木薯種莖活力的生理生化鑒評(píng)指標(biāo)研究

陳晨,黃潔,劉子凡,*,魏云霞

1.海南大學(xué)熱帶作物學(xué)院,?？?570228

2.中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶作物品種資源研究所,農(nóng)業(yè)農(nóng)村部木薯種質(zhì)資源保護(hù)與利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,儋州 571737

0 前言

種子活力是指一批種子在不同環(huán)境條件下的萌發(fā)活性和各種性能的總和[1]。種子活力逐漸下降并表現(xiàn)出生理、生化乃至遺傳的綜合效應(yīng)被稱(chēng)為老化,種子老化不僅影響萌發(fā)與幼苗的生長(zhǎng),還影響著后期的產(chǎn)量和品質(zhì)[2],因此,篩選、評(píng)價(jià)活力高的種子是農(nóng)業(yè)生產(chǎn)急需解決的問(wèn)題。采用人工加速老化獲取材料,于廣度條件下進(jìn)行發(fā)芽與幼苗生長(zhǎng)測(cè)評(píng)是目前公認(rèn)的可靠活力測(cè)定方法[3],但該方法繁瑣、耗時(shí)長(zhǎng),難以高效快捷指導(dǎo)生產(chǎn)。為此,前人開(kāi)始探索種子活力與生理生化指標(biāo)間的關(guān)系。有研究表明:可溶性糖含量與不結(jié)球白菜種子活力極顯著相關(guān)[4];過(guò)氧化物酶(POD)、過(guò)氧化氫酶 (CAT)活性與玉米種子活力達(dá)顯著或極顯著相關(guān)[5];淀粉含量可作為衡量不同成熟期小麥種子活力的重要指標(biāo)[6];小麥種子蛋白質(zhì)含量與其幼苗活力及產(chǎn)量呈正相關(guān)[7];丙二醛(MDA)含量與大白菜種子活力關(guān)系緊密[8];種子活力與其含水量密切相關(guān)[9-14],等。

木薯(Manihot esculentaCrantz)是我國(guó)熱帶、亞熱帶地區(qū)的重要經(jīng)濟(jì)作物,主要以種莖種植,常因貯藏技術(shù)欠佳導(dǎo)致種莖質(zhì)量差,種植時(shí)及苗期又易受高溫干旱等逆境影響,導(dǎo)致成活率低、植株長(zhǎng)勢(shì)差,最終導(dǎo)致減產(chǎn)降質(zhì),選用優(yōu)質(zhì)種莖已是木薯增產(chǎn)的重要前提。為了保持或提高木薯種莖活力,前人研究了各種種莖處理[15-18]和種莖貯藏技術(shù)[19-21],但這些措施都需經(jīng)田間試驗(yàn)后方能確定效果,時(shí)間長(zhǎng)、受環(huán)境影響大。生產(chǎn)上,常以種莖老熟程度和種莖切口乳汁多少來(lái)衡量木薯種莖質(zhì)量,主觀經(jīng)驗(yàn)性大,容易誤判,且不適用于種莖處理措施優(yōu)劣的判斷。若能找到一種或幾種簡(jiǎn)易的生理生化指標(biāo)評(píng)價(jià)種莖活力,便可快速知曉該措施的優(yōu)劣。目前,雖然有性繁殖材料種子活力的快速評(píng)價(jià)方法有較多報(bào)道,而無(wú)性繁殖材料木薯種莖活力的生理生化評(píng)價(jià)指標(biāo)的研究尚為空白。為此,本文采用人工加速老化方法處理木薯種莖,在較短時(shí)間內(nèi)獲得不同活力的研究材料,于正常供水和干旱脅迫條件下,開(kāi)展種莖發(fā)芽和幼苗生長(zhǎng)試驗(yàn),對(duì)不同老化程度的種莖,先通過(guò)主成分分析獲得其綜合活力得分,再與其生理生化指標(biāo)進(jìn)行相關(guān)性分析,遴選可快速評(píng)價(jià)木薯種莖活力的生理生化指標(biāo),并為種莖貯藏及其處理技術(shù)提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 種莖的采集

試驗(yàn)在中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶作物品種資源研究所(品資所)六坡木薯基地進(jìn)行。木薯品種為當(dāng)?shù)刂魍魄矣H緣關(guān)系較遠(yuǎn)的華南8 號(hào)(SC8)和南植199 (NZ199),由品資所提供;2017年3月24日種植,株行距80 cm × 80 cm,2018年2月25日收獲種莖。收獲時(shí)于離地10 cm處砍斷,去除20 cm頂梢及所有葉片;將種莖等長(zhǎng)鋸為頂部、中部、基部3 類(lèi),進(jìn)而鋸成長(zhǎng)7.0 cm ± 0.5 cm 的莖段。

1.2 種莖的人工老化

把莖段分類(lèi)放入人工老化箱,于40 ±2℃ ℃、相對(duì)濕度100%的條件下老化,共設(shè)老化0、2、4、6 d四個(gè)不同老化時(shí)間;當(dāng)每個(gè)老化階段結(jié)束時(shí),隨機(jī)取出部分種莖,于室溫下(22 ±3℃ )℃平衡一晚(晚20 時(shí)至翌晨10 時(shí))后再參與相應(yīng)試驗(yàn)。

1.3 種莖發(fā)芽與幼苗生長(zhǎng)試驗(yàn)

試驗(yàn)設(shè)正常和干旱脅迫2個(gè)處理,每個(gè)處理各3盤(pán)沙培(每盤(pán)30 段莖段)作為3 次重復(fù)。取洗凈烘干的河沙,正常處理按每1 kg干沙加200 mL去離子水的比例拌勻;干旱脅迫處理以等體積的15% PEG 6000 溶液替代去離子水。

在870 mm × 305 mm × 70 mm 塑料育苗盤(pán)底層鋪厚約4 cm 的上述拌勻河沙;取經(jīng)老化的上、中、基部各10 段莖段,選留中間2 個(gè)芽眼后,用牙簽(針刺法)刺死其余芽眼;平放于育苗盤(pán)內(nèi);覆上沙子,以剛好覆蓋莖段為度;在25 ℃、75%濕度的24 h 光照培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)20 d。

1.4 測(cè)定指標(biāo)與方法

1.4.1 發(fā)芽與幼苗生長(zhǎng)指標(biāo)測(cè)定

培養(yǎng)20 天后,以重復(fù)為觀測(cè)單元逐一統(tǒng)計(jì)發(fā)芽數(shù),并測(cè)定所有幼苗的苗長(zhǎng)SL、苗鮮重SFW、苗干重SDW。苗長(zhǎng)為幼苗與莖段連接處至葉片最高點(diǎn)的長(zhǎng)度,單位為cm;苗鮮重為各重復(fù)內(nèi)所有幼苗的單株平均鮮重,單位為g;苗干重為各重復(fù)內(nèi)所有幼苗于60 ℃下烘干的單株平均重量,單位為g。計(jì)算正常和干旱脅迫條件下的種莖發(fā)芽率、活力指數(shù)Ⅰ、活力指數(shù)Ⅱ和活力指數(shù)Ⅲ[22],計(jì)算公式如下:

1.4.2 生理生化指標(biāo)的測(cè)定

從老化并平衡后的種莖段中隨機(jī)選取10 段,用打孔器去除髓部,經(jīng)液氮冷凍后,再混合液氮于粉碎機(jī)中粉碎,把粉末裝于密封袋中,保存于-20℃的冰箱中備用測(cè)定。

硫代巴比妥酸法測(cè)定丙二醛(MDA) 含量[23],茚三酮顯色法測(cè)定游離脯氨酸含量[24],蒽酮比色法測(cè)定可溶性糖含量[24],考馬斯亮藍(lán)G-250 染色法測(cè)定可溶性蛋白質(zhì)含量[25],氯化鈣-旋光法測(cè)定淀粉含量,試劑盒法測(cè)定過(guò)氧化氫酶(CAT) 活性,愈創(chuàng)木酚法測(cè)定過(guò)氧化物酶(POD)活性[26]。

1.5 主成分分析與相關(guān)分析

主成分分析和相關(guān)性分析均采用DPS 7.55 軟件。其中主成分分析按照累積貢獻(xiàn)率大于85%的要求確定主因子數(shù),活力綜合得分權(quán)重。其中:j＝1,2,…,n,;Fj表示第j個(gè)主因子,Pj表示第j個(gè)公因子的貢獻(xiàn)率[27]。

2 結(jié)果與分析

2.1 種莖發(fā)芽與幼苗生長(zhǎng)指標(biāo)的簡(jiǎn)單相關(guān)分析

種子活力的強(qiáng)弱表現(xiàn)在發(fā)芽率、根長(zhǎng)、苗長(zhǎng)、鮮重、干重、逆境條件發(fā)芽能力、耐藏性、抗老化等諸多方面,是由多基因控制的數(shù)量性狀[28]。不同老化時(shí)間種莖于正常和干旱條件下的發(fā)芽與生長(zhǎng)指標(biāo)變化情況如表1、表2所示,隨著老化天數(shù)的增加,種莖的發(fā)芽率、苗長(zhǎng)、苗鮮重、苗干重均快速下降。分別對(duì)2 品種的14 個(gè)發(fā)芽與幼苗生長(zhǎng)指標(biāo)進(jìn)行簡(jiǎn)單相關(guān)分析,相關(guān)系數(shù)見(jiàn)表3、表4。大多數(shù)指標(biāo)間存在顯著或極顯著相關(guān)性。表明若使用單一的測(cè)定方法或指標(biāo)來(lái)判斷2 個(gè)參試品種的種莖活力高低,可能會(huì)存在偏差,需要綜合評(píng)判。

2.2 種莖活力的主成分分析

主成分分析是一種常用的綜合評(píng)價(jià)方法,是利用降維的思維,將多個(gè)指標(biāo)在不丟失其全部信息的前提下轉(zhuǎn)化為幾個(gè)較少的新指標(biāo),從而使多變量問(wèn)題分析得到簡(jiǎn)化,化繁為簡(jiǎn)。主成分分析的公因子特征值及貢獻(xiàn)率結(jié)果表明:2 品種原來(lái)的14 個(gè)單項(xiàng)指標(biāo)均可轉(zhuǎn)換為1 個(gè)新的相互獨(dú)立的綜合指標(biāo)F1。華南8 號(hào)的F1累積貢獻(xiàn)率達(dá)93.95%,南植199 的F1累積貢獻(xiàn)率達(dá)91.65%(表5),說(shuō)明此方法計(jì)算種莖活力攜帶有原始指標(biāo)的絕大部分信息。

表1 華南8 號(hào)種莖發(fā)芽與幼苗生長(zhǎng)指標(biāo)變化情況 Table1 Changes of germination and growth indices of SC8 cassava stem

表2 南植199 種莖發(fā)芽與幼苗生長(zhǎng)指標(biāo)變化情況 Table2 Changes of germination and growth indices of NZ199 cassava stem

表3 華南8 號(hào)種莖發(fā)芽與幼苗生長(zhǎng)指標(biāo)間的簡(jiǎn)單相關(guān)系數(shù) Table3 Correlation coefficient of germination and growth indices of SC8 cassava stem

華南8 號(hào)及南植199 的F1中各指標(biāo)特征向量值均為正,且大小相近,說(shuō)明這些指標(biāo)在F1中均為正貢獻(xiàn)且貢獻(xiàn)率相近(表6)。

表4 南植199 種莖發(fā)芽與幼苗生長(zhǎng)指標(biāo)間的簡(jiǎn)單相關(guān)系數(shù) Table4 Correlation coefficient of germination and growth indices of NZ199 cassava stem

由表4中F1的特征向量值及其貢獻(xiàn)率,可得種莖活力綜合得分。華南8 號(hào)和南植199 種莖活力隨老化時(shí)間的延長(zhǎng)呈現(xiàn)出先慢后快的下降趨勢(shì)(表7),說(shuō)明通過(guò)人工老化獲得了不同活力的種莖材料。

2.3 不同老化程度種莖生理生化指標(biāo)變化

不同老化程度木薯種莖的生理生化指標(biāo)變化見(jiàn)表8、表9。從表6可知,隨著老化程度的加深,2 個(gè)木薯品種的種莖CAT 活性、POD 活性、MDA 含量總體呈現(xiàn)先升后降的趨勢(shì),種莖含水量總體先微降再上升至最大值。華南8 號(hào)種莖可溶性糖含量隨老化時(shí)間的延長(zhǎng)顯著增加,而南植199 可溶性糖變化不明顯;南植199 種莖游離脯氨酸含量顯著增加,而華南8 號(hào)游離脯氨酸含量變化無(wú)一定規(guī)律;兩品種的可溶性蛋白含量總體表現(xiàn)為逐步上升的趨勢(shì),而淀粉含量表現(xiàn)為顯著的下降趨勢(shì)。

表5 主成分的公因子特征值及貢獻(xiàn)率 Table5 Common factor eigenvalues and contribution rates of principal components

表6 種莖的14 個(gè)活力指標(biāo)特征向量 Table6 Characteristic vector of 14 vigor indicators of stem

表7 種莖活力綜合得分 Table7 Comprehensive score of cassava stem vigor

表8 華南8 號(hào)種莖不同老化時(shí)間生理生化指標(biāo)的變化 Table8 Physiological and biochemical indices within different aging times of SC8 cassava stem

表9 南植199 種莖不同老化時(shí)間生理生化指標(biāo)的變化 Table9 Physiological and biochemical indices within different aging times of NZ199 cassava stem

2.4 種莖活力綜合得分與其生理生化指標(biāo)相關(guān)性分析

經(jīng)不同老化時(shí)間獲得了不同活力的種莖材料,故可由種莖活力綜合得分與生理生化指標(biāo)進(jìn)行相關(guān)性分析,結(jié)果見(jiàn)表10。由表10 可知,華南8 號(hào)和南植199 種莖活力綜合得分與種莖的可溶性蛋白含量呈顯著負(fù)相關(guān),與種莖淀粉含量呈顯著正相關(guān),另外,南植199 種莖活力綜合得分還與其種莖脯氨酸含量呈極顯著負(fù)相關(guān)。

3 討論與結(jié)論

種子活力受其貯藏物質(zhì)數(shù)量的制約[29],隨著種 子內(nèi)淀粉、蛋白質(zhì)、脂肪等貯藏物質(zhì)含量的提高而逐漸提高[30]。木薯種莖中大量積累的淀粉可為腋芽活力提供必需的能量和結(jié)構(gòu)物質(zhì)[31]。本研究表明:種莖活力綜合得分與種莖淀粉含量呈顯著正相關(guān),這與玉米種子的出苗率與種子淀粉含量成正相關(guān)[32]和老化白菜種子淀粉含量與種子活力呈正相關(guān)[33]的結(jié)果一致。因此,可推薦木薯種莖淀粉含量作為種莖貯藏劣變過(guò)程中活力強(qiáng)弱的評(píng)價(jià)指標(biāo)。

本研究還表明,木薯種莖可溶性蛋白含量隨著老化程度的加深而不斷升高,且與種莖活力綜合得分呈顯著負(fù)相關(guān)。本研究的蛋白質(zhì)含量隨老化程度加深而升高的變化規(guī)律,與薄麗萍的不結(jié)球白菜種子研究結(jié)果相一致[33],但與前人在小麥[7]、白菜[4]種子的研究結(jié)果不一致。本研究所揭示的種莖活力與蛋白質(zhì)相關(guān)規(guī)律,契合張倩霞在粳稻種子上的研究結(jié)果[34]。Srivastava 發(fā)現(xiàn),衰老組織中蛋白質(zhì)含量在某個(gè)階段表現(xiàn)出忽然上升的現(xiàn)象,他認(rèn)為是由于合成了新蛋白質(zhì)的緣故[35];此外,水稻種子老化時(shí)會(huì)產(chǎn)生一種老化響應(yīng)熱激蛋白OsHSP18.2,并通過(guò)限制ROS 積累,保護(hù)細(xì)胞蛋白在種子成熟脫水、干燥和種子老化過(guò)程中的損傷,改善種子活力和種子壽命[36]。據(jù)此推測(cè),隨著木薯種莖老化程度的加深,其可溶性蛋白含量不斷上升的現(xiàn)象,可能是由于種莖不斷產(chǎn)生新的逆境蛋白,且大于劣變所消耗可溶性蛋白的速率。因此,可推薦木薯種莖可溶性蛋白含量作為種莖貯藏劣變過(guò)程中活力強(qiáng)弱的評(píng)價(jià)指標(biāo)。

表10 種莖活力綜合得分與生理生化指標(biāo)的相關(guān)性分析 Table10 Correlation analysis between comprehensive vigor scores with physiological and biochemical indices of the stem

植物體內(nèi)積累大量的脯氨酸,除作為植物細(xì)胞質(zhì)內(nèi)滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)外,還在穩(wěn)定生物大分子結(jié)構(gòu)、降低細(xì)胞酸性、解除氨毒以及作為能量庫(kù)調(diào)節(jié)細(xì)胞氧化還原等方面起重要作用,常被用來(lái)評(píng)價(jià)種子活力[37]。玉米種子脯氨酸含量在老化過(guò)程中呈現(xiàn)上升趨勢(shì)并與種子活力指標(biāo)負(fù)相關(guān)[5],5.55%含水量的樸樹(shù)種子在常溫和4 ℃下貯藏時(shí),種子活力與脯氨酸含量呈負(fù)相關(guān)[38]。本研究表明,脯氨酸含量與南植199 種莖活力綜合得分呈極顯著負(fù)相關(guān),與華南8號(hào)種莖活力綜合得分相關(guān)系數(shù)達(dá)-0.899,但未達(dá)顯著水平。這說(shuō)明脯氨酸在衡量木薯種莖活力時(shí)存在品種差異,不適用于所有品種。

綜上,2 個(gè)木薯品種的種莖淀粉含量、可溶性蛋白含量與其種莖活力之間,均呈現(xiàn)一致的顯著相關(guān)關(guān)系,因此,可作為木薯種莖貯藏劣變過(guò)程中活力強(qiáng)弱的評(píng)價(jià)指標(biāo),并可為篩選木薯種莖貯藏及處理技術(shù)提供一定的理論依據(jù)。