天門冬組織培養(yǎng)研究

楊平飛，羅 鳴，劉 海，宋智琴，張金霞，趙仕娟2，趙明書3，吳明開

(1.貴州省農(nóng)業(yè)科學院現(xiàn)代中藥材研究所，貴陽 550006；2.貴州務川綠源中藥種植開發(fā)有限公司，貴州 務川 564300；3.貴州麻陽河國家級自然保護區(qū)管理局，貴州 務川 564300)

天門冬[Asparaguscochinchinensis(Lour.) Merr.]為百合科天門冬屬多年生攀援草本植物，別名天冬，以干燥塊根入藥，是我國傳統(tǒng)常用中藥材，具有養(yǎng)陰潤燥、清肺生津功效，主治肺燥干咳，腰膝酸痛，骨蒸潮熱，內(nèi)熱消渴，咽干口渴，腸燥便秘[1]。另外，研究發(fā)現(xiàn)，天門冬具有抗腫瘤、抑菌、鎮(zhèn)咳祛痰等藥理作用[2]。近年來，天門冬野生資源遭到過度采挖，瀕臨枯竭。隨著人們生活水平的不斷提高，對天門冬的需求不斷增加。天門冬的繁殖方式主要是分株繁殖和種子繁殖，分株繁殖增殖系數(shù)較低，成活率受諸多因素影響；種子繁殖發(fā)芽率低，整齊度不高，出苗所需時間長，管理費時費工[3]。近年來，各地雖有小規(guī)模種植天門冬，但種植技術水平參差不齊，嚴重制約規(guī)?；l(fā)展，利用組織培養(yǎng)快繁技術規(guī)?；a(chǎn)種苗勢在必行。目前，對天門冬的組織培養(yǎng)快繁技術研究相關報道較少[4-6]。全秒華等研究表明，天門冬嫩芽愈傷組織誘導率最高[4]；楊堯軍等[5]以羊齒天門冬嫩枝為材料，篩選出了愈傷組織和生根的適宜培養(yǎng)基；潘麗梅等研究表明，以莖段作為外植體進行培養(yǎng)基優(yōu)化，生根率可達76%[7]。但針對天門冬嫩芽組培研究尚不完善，為進一步完善嫩芽組培技術體系，提高天門冬嫩芽組培各階段誘導率，本研究基于前人的研究，以天門冬嫩芽為研究材料，開展組培快繁研究，篩選較佳培養(yǎng)基誘導愈傷組織、叢生芽、生根等，旨在為天門冬組織培養(yǎng)和規(guī)模生產(chǎn)提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試材料天門冬由貴州務川綠源中藥種植開發(fā)有限公司提供，品種為西南天門冬，采用天門冬嫩芽作為組織培養(yǎng)材料。

1.2 試驗方法

1.2.1外植體消毒

先將采集的天門冬嫩芽清水沖洗6 h，用無菌濾紙吸干水分。然后于超凈工作臺進行外植體消毒，依次用0.1%升汞和75%乙醇分別浸泡2 min和5 min，之后用無菌水漂洗5次，最后用無菌濾紙吸干水分。

1.2.2誘導愈傷組織

以MS培養(yǎng)基作為基本培養(yǎng)基，添加不同濃度的6-BA(0.5，1.0，2.0 mg·L-1)和NAA(0.5，1.0，1.5 mg·L-1)，瓊脂添加量為7.2 g·L-1，蔗糖添加量為30 g·L-1，pH值為5.8。選取大小和長勢一致的嫩芽接種到不同激素配比的培養(yǎng)基中，于光照強度1 200 lx、光照時間為12 h/d、溫度為(25±2)℃、濕度為30%～50%的組培室里培養(yǎng)30 d，統(tǒng)計誘導數(shù)，計算誘導率。

1.2.3誘導叢生芽

以MS培養(yǎng)基作為基本培養(yǎng)基，添加不同濃度的6-BA(0.5，1.0，2.0 mg·L-1)和IAA(0.5，1.0，2.0 mg·L-1)，瓊脂添加量為7.2 g·L-1，蔗糖添加量為30 g·L-1，pH值為5.8。將培養(yǎng)30 d嫩芽誘導出來的生長一致的愈傷組織分成大小一致的小塊，接種到不同激素配比的培養(yǎng)基中，于光照強度1 200 lx、光照時間為12 h/d、溫度為(25±2)℃、濕度為30%～50%的組培室里培養(yǎng)30 d，統(tǒng)計分化數(shù)，計算分化率。

1.2.4誘導生根

對MS培養(yǎng)基、IBA、NAA 3個因素進行正交設計L9(34)(見表1)，瓊脂添加量為7.2 g/L，蔗糖添加量為30 g/L，pH值為5.8。將誘導出來的高約0.5 cm叢生芽接種到培養(yǎng)基中，于光照強度1 200 lx、光照時間為12 h/d、溫度為(25±2)℃、濕度為30%～50%的組培室里培養(yǎng)30 d，統(tǒng)計生根數(shù)，計算生根率。

表1 試驗因素及水平

水平因素基本培養(yǎng)基IBA/(mg·L-1)NAA/(mg·L-1)1MS0.50.521/2MS1.01.031/4MS2.02.0

1.3 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)統(tǒng)計和分析使用Excel 2003軟件和SPSS18.0軟件進行。

2 結果與分析

2.1 不同培養(yǎng)基對天門冬愈傷組織的誘導

在植物組培初代培養(yǎng)中，不同濃度的細胞分裂素和生長素組合，影響愈傷組織、不定芽和生根的誘導。從表2知，當處理4中6-BA濃度為1.0 mg·L-1和NAA濃度為0.5 mg·L-1時，愈傷組織誘導數(shù)較多，達25個，誘導率達83.33%，且長勢較好；以處理3中6-BA濃度為0.5 mg·L-1和NAA濃度為1.5 mg·L-1時，愈傷組織誘導數(shù)較少，為6個，誘導率為20.00%，且長勢較差；當6-BA濃度不變時，誘導率隨NAA濃度的上升而呈下降的趨勢。結果表明，MS+1.0 mg·L-16-BA+0.5 mg·L-1NAA為天門冬愈傷組織誘導的較佳培養(yǎng)基。

表2 不同培養(yǎng)基對天門冬愈傷組織的誘導

處理6-BANAA接種個數(shù)誘導個數(shù)誘導率/%長勢10.50.5301446.67++20.51.030930.00++30.51.530620.00++41.00.5302583.33++++51.01.0301550.00+++61.01.5301240.00++72.00.5301240.00++82.01.0301343.33++92.01.5301136.67++

注：長勢以“ + ”表示，“ + ”越多表示長得越好。下同。

2.2 不同培養(yǎng)基對天門冬叢生芽的誘導

將愈傷組織接種到叢生芽培養(yǎng)基中培養(yǎng)30 d，有不同長勢和數(shù)量的叢生芽長出。從表3可知，當處理4中6-BA濃度為1.0 mg·L-1和IAA濃度為0.5mg·L-1時，叢生芽分化數(shù)較多，達24個，誘導率達80.00%，且長勢較好；以處理6中6-BA濃度為1.0 mg·L-1和IAA濃度為2.0 mg·L-1和處理9中6-BA濃度為2.0 mg·L-1和IAA濃度為2.0 mg·L-1，愈傷組織誘導數(shù)較少，均為11個，誘導率均為36.67%，且長勢較差；當6-BA濃度不變時，分化率隨IAA濃度的上升而呈下降的趨勢。結果表明，MS+1.0 mg·L-16-BA+0.5 mg·L-1IAA為天門冬叢生芽誘導的較佳培養(yǎng)基。

表3 不同培養(yǎng)基對天門冬叢生芽的誘導

處理6-BAIAA接種個數(shù)分化個數(shù)分化率/%長勢10.50.5301550.00++20.51.0301756.67+++30.52.0301446.67++41.00.5302480.00+++51.01.0301860.00+++61.02.0301136.67++72.00.5301550.00++82.01.0301240.00++92.02.0301136.67++

2.3 不同培養(yǎng)基對天門冬生根的誘導

將叢生芽接種到生根培養(yǎng)基中培養(yǎng)30 d，有不同數(shù)量的根長出。對不同處理的天門冬生根率進行極差分析，從表4知，3因素對天門冬生根率影響的大小順序為：C>A>B。由K值大小可以看出，各因素3水平對生根率影響的主次順序分別為：A3>A1>A2，B2>B1>B3，C2>C1>C3，天門冬愈傷組織誘導率的最佳組合是A3B2C2，即MS+1.0 mg·L-1IBA+0.5 mg·L-1NAA，與生根率最高(86.6%)的組合A1B2C2不一致，可能是2種生長素(IBA和NAA)相互作用所致，故需對IBA和NAA進行交互效應檢驗。對IBA和NAA作交互效應檢驗，如表5所示。IBA*NAA的Sig<0.01，說明IBA和NAA之間對天門冬生根率存在極顯著的交互作用。

表4 不同培養(yǎng)基對天門冬生根的誘導

處理基本培養(yǎng)基IBA/(mg·L-1)NAA/(mg·L-1)生根率/%1MS0.50.554.32MS1.01.086.63MS2.02.030.541/2MS0.51.043.451/2MS1.02.023.661/2MS2.00.535.771/4MS0.52.054.381/4MS1.00.568.091/4MS2.01.061.8均值K157.150.752.7均值K234.259.463.9均值K361.442.736.1極差R27.216.727.8

表5 IBA和NAA交互效應檢驗

源Ⅲ型平方和df均方FSig.校正模型9455.74181181.96839.5010.000截距70002.779170002.7792339.4910.000IBA1259.2812629.64021.0430.000NAA3514.53421757.26758.7280.000IBA×NAA4681.92641170.48139.1170.000誤差538.6001829.922總計79997.12027校正的總計9994.34126

3 結論與討論

本研究主要以天門冬嫩芽為研究材料，開展天門冬組織培養(yǎng)研究，篩選較佳培養(yǎng)基誘導愈傷組織、叢生芽、生根。結果表明，天門冬愈傷組織誘導較佳培養(yǎng)基為MS+1.0 mg·L-16-BA+0.5 mg·L-1NAA，叢生芽誘導較佳培養(yǎng)基為MS+1.0 mg·L-16-BA+0.5 mg·L-1IAA，生根誘導較佳培養(yǎng)基為MS+1.0 mg·L-1IBA+0.5 mg·L-1NAA，各培養(yǎng)基瓊脂添加量均為7.2 g·L-1，蔗糖添加量均為30 g·L-1，pH值均為5.8。

在植物組織培養(yǎng)中起重要作用的激素主要是生長素和細胞分裂素，二者不同濃度配比影響組培各階段誘導的結果。本研究基于前人研究基礎，以天門冬嫩芽為材料開展組培研究。本研究生根誘導率較潘麗梅等[7]研究的76%要高13.95%，說明嫩芽較莖段適宜作為組培外植體；愈傷組織、叢生芽、生根誘導培養(yǎng)基與全妙華等[4]研究的1/2 MS+1.0 mg·L-16-BA+0.5 mg·L-1NAA、MS+1.5 mg·L-16-BA+0.5 mg·L-1IAA、MS+0.5 mg·L-1IBA+0.5 mg·L-1IAA不一致，誘導率略低，長勢不均，可能由于貴州和湖南兩地天門冬品種間存在一定差異，溫度、光照、濕度等培養(yǎng)條件存在差異，試驗操作過程中難免會出現(xiàn)一些誤差。因此，差異原因?qū)⑹窍乱徊降难芯抗ぷ鞣较颉?/p>

在藥用植物中，有相當一部分種子發(fā)芽率低，依傳統(tǒng)方式種子育苗或分株繁殖難以滿足大規(guī)模種植的需求，組培快繁技術是解決這生產(chǎn)難題的重要手段[8-10]。針對天門冬組培研究技術尚不成熟、體系尚不健全的現(xiàn)狀，需要更多研究來加強和完善。隨著市場對天門冬的需求越來越大，人工規(guī)?；耘鄤菰诒匦?，組培快繁技術的研究和技術體系的建立為解決天門冬野生資源和種苗稀缺、實現(xiàn)規(guī)?；a(chǎn)提供重要技術支撐。