EFNB2 基因rs550067317 位點基因多態(tài)性與精神分裂癥相關(guān)性研究

汪 斌 項則文 陳 瑩 蔡 靚

精神分裂癥是一種慢性、嚴重和致殘的精神疾病，其臨床特征是幻覺、妄想和認知缺陷，其遺傳度高達80%[1]。EFNB2 基因位于13q33 染色體上，與精神分裂癥有很強的聯(lián)系。研究發(fā)現(xiàn)，EFNB2 基因與中國漢族人群中的精神分裂癥有關(guān)[2]。研究表明，microRNA 表達失調(diào)可能與精神分裂癥相關(guān)[3-5]。microRNA-137（miR-137）的變異是迄今為止鑒定的與精神分裂癥風(fēng)險相關(guān)性最為密切的基因座之一，與較差的認知表現(xiàn)有關(guān)。與miR-137 相關(guān)的精神分裂癥風(fēng)險可能與其更廣泛的下游遺傳效應(yīng)有關(guān)[6]。rs550067317 位于EFNB2 基因的3’-UTR，該區(qū)域是miR-137 的結(jié)合位點，本研究探討EFNB2 基因rs550067317 位點單核苷酸多態(tài)性與精神分裂癥的相關(guān)性，同時分析miR-137 的作用，報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 隨機選擇2015 年8 月—2017 年12月期間浙江省紹興市第七人民醫(yī)院精神科收治的85例精神分裂癥患者作為研究對象，選擇同期健康體檢者85 名作為對照，本研究通過醫(yī)院倫理委員會的審核，所有受試者均簽署知情同意書。

1.2 精神分裂癥診斷標準 參考美國精神障礙診斷與統(tǒng)計手冊第四版（Diagnostic and Statistical Manual of Mental Disor-ders，DSM-IV）[7]。

1.3 納入、排除標準 納入標準：（1）年齡≥20 歲；（2）有兩名精神科主治醫(yī)生根據(jù)DSM-IV 標準確診為精神分裂癥。排除標準：（1）根據(jù)DSM-IV 診斷為精神發(fā)育遲滯、心境障礙、譫妄、分裂情感障礙、癡呆等精神類疾??；（2）有嚴重的臟器功能障礙；（3）處于哺乳期或者妊娠期的患者。

1.4 基因型分析 所有受試者均被抽取約2mL 靜脈血，使用乙二胺四乙酸（EDTA）抗凝，保存于-20℃冰箱待測。根據(jù)美國國立生物技術(shù)信息中心（National Center for Biotechnology Information，NCBI）數(shù)據(jù)庫中EFNB2 基因rs550067317 位點信息設(shè)計引物，上游引 物 序 列 為F：5’-TACTGGCACTAAGATACACAG CTCCGAGCT-3’。下游引物序列為R：5’-GTATCTT AGTGCCAGTACCACAACAGTCCT-3’。使用25μL 的PCR 反應(yīng)體系擴增，包含50ng 模板DNA，10×PCR緩沖液2.5μL，25mM Mg2+1.5μL，10mM dNTP 0.5μL，5U Taq 酶0.5μL，上下游引物各1μL，補雙蒸水至25μL。PCR 反應(yīng)程序為：95℃，4min；然后進入30 個循環(huán)的如下反應(yīng)：94℃，30s；60℃，30s；72℃，30s；然后72℃，10min。PCR 反應(yīng)完成后將產(chǎn)物寄送上海生工生物工程有限公司進行測序，測序結(jié)果使用chromas 1.62 進行序列分析，結(jié)果見圖1。

圖1 EFNB2 基因rs550067317 位點測序結(jié)果

1.5 血漿miR-137 表達檢測 取2mL 受試者EDTA 抗凝血，使用TRIzol（Invitrogen，USA）提取總RNA，使用反轉(zhuǎn)錄PCR 反轉(zhuǎn)錄成cDNA，試劑盒為TaqManmicroRNA 反轉(zhuǎn)錄試劑盒（ThermoFisher，批號4366596），每個樣本重復(fù)測量2 次，以GAPDH 為外參，計算miR-137 的閾值環(huán)（threshold cycle，Ct）的差，并用2-△△Ct 表示miR-137 的相對表達水平。GAPDH 反轉(zhuǎn)錄qPCR 正向引物序列為5’-CCAAGG TCATCCATGACAACT-3’，反向引物為5’-CAGGGA TGATGTTCTGGAGAG-3’。miR-137 反轉(zhuǎn)錄qPCR 正向引物序列為5’-TTATTGCTTAAGAATACGCGTAG-3’，反向引物為5’-CTCGCTTCGGCAGCACA-3’。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法 使用SPSS20.0 軟件進行統(tǒng)計分析，計數(shù)資料的表示方法為頻數(shù)[n（%）]，組間差異采用χ2檢驗，基因型頻率分布是否符合Hardy-Weinberg 平衡采用χ2檢驗。采用非條件Logistic 回歸模型估計優(yōu)勢比（OR）和95%置信區(qū)間（CI）。計量資料用均數(shù)±標準差（s） 表示，組間統(tǒng)計分析采用t 檢驗或單因素方差分析。采用非參數(shù)法估計計算受試者工作特征曲線（ROC）曲線下面積（AUC），P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 精神分裂癥患者與健康對照者一般情況比較研究組85 例中男46 例，女39 例，年齡20～74 歲，平均（36.54±9.56）歲。對照組85 名中男42 名，女43名，年齡20～65 歲，平均（36.15±10.12）歲。研究組與對照組年齡、性別等差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），具有可比性。

2.2 EFNB2 基因rs550067317 位點基因多態(tài)性與精神分裂癥風(fēng)險 EFNB2 基因rs550067317 位點基因型頻率分布符合Hardy-Weinberg 平衡（P＞0.05）。研究組患者與對照組EFNB2 基因rs550067317 位點基因型頻率之間差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=6.996，P=0.030），以野生型AA 為參考，雜合子（AC）不是精神分裂癥的危險因素（OR=0.492，95%CI=0.203～1.182，P=0.082），純合子（CC）是精神分裂癥發(fā)生的保護因子（OR=0.300，95%CI=0.087～0.980，P=0.024），顯性模型下精神分裂癥發(fā)生風(fēng)險降低（OR=0.414，95%CI=0.196～0.870，P=0.011），隱性模型下精神分裂癥風(fēng)險并未顯著降低（OR=0.346，95%CI=0.102-1.112，P=0.081）。研究組患者EFNB2 基因rs550067317 位點C 等位基因頻率顯著低于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=9.833，P=0.002），以A 等位基因為參考，C 等位基因是精神分裂癥發(fā)生的保護因素（OR=0.413，95%CI=0.226～0.750，P=0.002），見表1。

2.3 miR-137 表達情況 RT-PCR 檢測結(jié)果顯示，精神分裂癥患者血漿miR-137 水平顯著高于對照組（P＜0.01），見表2。分析比較EFNB2 基因rs550067317位點不同基因型受試者血漿miR-137 水平，結(jié)果顯示，AA 基因型受試者血漿miR-137 水平顯著高于AC 基因型、AC 基因型顯著高于CC 基因型（P＜0.01），見表3。

2.4 miR-137 基因表達對精神分裂癥診斷價值 使用Graphpad Prism 7.0 作miR-137 水平診斷精神分裂癥的ROC 曲線，結(jié)果顯示，cut-off 值為2.45，即當miR-137 相對表達量為2.45 時診斷精神分裂癥的價值最高，miR-137 診斷精神分裂癥的AUC（曲線下面積）為0.8619，P＜0.0001，敏感度為72.94%，特異度為85.88%。當僅考慮rs550067317 位點野生型（AA）受試者時，miR-137 診斷精神分裂癥的AUC（曲線下面積）為0.9791，P＜0.0001，敏感度為98.53%，特異度為95.59%，cut-off 值為3.75。當僅考慮rs550067317 位點突變型（AC+CC）受試者時，miR-137 診斷精神分裂癥的AUC（曲線下面積）為0.8529，P=0.0004，敏感度為76.47%，特異度為76.47%，cut-off 值為2.25。見圖2。

表1 EFNB2 基因rs550067317 位點基因型和等位基因頻率[例（%）]

表2 研究組和對照組miR-137 相對表達水平比較（x±s）

表3 EFNB2 基因rs550067317 位點不同基因型受試者血漿miR-137 水平比較（x±s）

3 討 論

雖然全基因組關(guān)聯(lián)研究提供了一種系統(tǒng)的、有效的、無偏移的方法來研究復(fù)雜疾病如精神分裂癥的常見變異，然而由于精神分裂癥在不同人群中的遺傳異質(zhì)性，精神分裂癥易感位點的識別在不同的研究中不能被重復(fù)[8-9]。盡管如此，通過病例對照全基因組關(guān)聯(lián)研究發(fā)現(xiàn)，歐洲人體內(nèi)miR-137 與精神分裂癥之間的較強關(guān)聯(lián)性在中國漢族人群中被重復(fù)[10]。miR-137 與EFNB2 結(jié)合的序列是保守的[11]，通過計算預(yù)測分析和報告基因分析，EFNB2 基因被miR-137 直接靶向調(diào)控。包括EFNB2 在內(nèi)的腎上腺素B 的激活可以彌補Reelin 的缺失，而Reelin 信號是神經(jīng)系統(tǒng)正常運作所必需的，這種通路的中斷導(dǎo)致了異腦癥，這是一種與精神分裂癥相關(guān)的嚴重發(fā)育障礙[12]。既往研究表明，miR-137 調(diào)節(jié)成人神經(jīng)發(fā)生、神經(jīng)元成熟和突觸前可塑性，miR-137 的過度表達導(dǎo)致突觸小泡運輸受損和突觸可塑性改變[13]。Wu等[14]研究顯示，EFNB2 作為miR-137 的直接靶標，miR-137 是精神分裂癥的危險因素，可能與NMDA受體信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和/或Reelin 信號通路有關(guān)。

圖2 miR-137 基因表達對精神分裂癥診斷價值的ROC 曲線分析

通過本研究結(jié)果可以看出，EFNB2 基因rs550067317 位點C 等位基因頻率顯著低于對照組，以A 等位基因為參考進行非條件Logistic 回歸模型估計結(jié)果顯示，C 等位基因是精神分裂癥發(fā)生的保護因素，說明攜帶A 等位基因的群體具有比C 等位基因攜帶者具有更高的精分裂癥風(fēng)險。本研究結(jié)果還顯示，AA 基因型受試者血漿miR-137 水平顯著高于AC 基因型、AC 基因型顯著高于CC 基因型（P＜0.01）。根據(jù)Wu 等[14]研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，內(nèi)源性EFNB2表達在蛋白質(zhì)水平上可以被miR-137 下調(diào)，rs550067317 位點位于3’-UTR 與miR-137 的結(jié)合位點上，C 等位基因影響miR-137 與EFNB2 基因3’-UTR 的結(jié)合，進而影響miR-137 對EFNB2 表達的調(diào)控作用，具體表現(xiàn)為A 等位基因EFNB2 低表達，被miR137 抑制，C 等位基因EFNB2 高表達。

此外，在使用ROC 曲線分析miR-137 診斷精神分裂癥時發(fā)現(xiàn)，以EFNB2 基因rs550067317 位點所有基因型為對象，AUC 為0.8619，P＜0.0001，敏感度為72.94%，特異度為85.88%，cut-off 值為2.45。當僅考慮rs550067317 位點野生型（AA）受試者時，miR-137 診斷精神分裂癥的AUC 為0.9791，P＜0.0001，敏感度為98.53%，特異度為95.59%，cut-off 值為3.75。當僅考慮rs550067317 位點突變型（AC+CC）受試者時，miR-137 診斷精神分裂癥的AUC 為0.8529，P=0.0004，敏感度為76.47%，特異度為76.47%，cut-off值為2.25。由此結(jié)果可知，野生型型群體中miR-137診斷精神分裂癥的價值高于突變型。

本研究有以下不足之處。首先，沒有建立EFNB2表達模型驗證EFNB2 基因rs550067317 位點單核苷酸多態(tài)性與EFNB2 表達以及與血漿miR-137 水平的相關(guān)性；其次，樣本量較小，可能影響統(tǒng)計結(jié)果的準確性。

綜上所述，EFNB2 基因rs550067317 位點基因多態(tài)性與精神分裂癥風(fēng)險相關(guān)，血漿miR-137 水平檢測精神分裂癥具有較高的診斷價值，其中野生型群體中診斷價值最高，敏感度高達98.53%，特異度高達95.59%。