結(jié)腸腺癌組織MMP-11、MMP-12 和VEGF-D 表達(dá)及意義

張宗祥 楊 翀 方迪龍 李 科

結(jié)腸腺癌是腸黏膜上皮呈腺樣分化的一種惡性上皮性腫瘤，病變發(fā)生與遺傳及飲食等因素有關(guān)[1]。腺癌常伴有淋巴道轉(zhuǎn)移，一般預(yù)后較差，與病變形成時(shí)的浸潤(rùn)及播散有關(guān)[2]。近年研究認(rèn)為，腫瘤細(xì)胞播散時(shí)可以產(chǎn)生轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白[3]。MMPs 家族是與轉(zhuǎn)移相關(guān)的蛋白，能對(duì)細(xì)胞外基質(zhì)成分形成降解，破壞腫瘤轉(zhuǎn)移的屏障，腫瘤細(xì)胞易于離開(kāi)原灶，形成播散。基質(zhì)金屬蛋白酶-11（MMP-11）和基質(zhì)金屬蛋白酶-12（MMP-12）是近年發(fā)現(xiàn)的與轉(zhuǎn)移密切相關(guān)的蛋白，二者可能與脈管生成相關(guān)[4]。血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子-D（VEGF-D）被認(rèn)為是淋巴管生成的促進(jìn)因子，通過(guò)其受體血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體3（VEGFR3）促進(jìn)間質(zhì)淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞增殖并介導(dǎo)淋巴管新生[5]。筆者應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)腸腺癌組織MMP-11、MMP-12和VEGF-D 表達(dá)，分析其相關(guān)性及對(duì)預(yù)后判斷的價(jià)值。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2012 年9 月—2014 年8 月在浙江省中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院普外科就診并進(jìn)行手術(shù)治療的結(jié)腸腺癌患者130 例為研究組。選擇上述患者術(shù)后標(biāo)本距腫物邊緣>3cm 的正常結(jié)腸黏膜組織130份作為對(duì)照組。術(shù)后標(biāo)本均由病理主治醫(yī)師以上職稱人員進(jìn)行取材，嚴(yán)格按診療規(guī)范進(jìn)行操作。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)審核通過(guò)，納入病例均由患者或家屬簽屬知情同意書(shū)。

1.2 納入及排除標(biāo)準(zhǔn) 納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）由病理醫(yī)師進(jìn)行復(fù)核切片，并按WHO 結(jié)腸腺癌的診斷標(biāo)準(zhǔn)作為依據(jù)，明確分型；（2）原發(fā)腺癌且為首次發(fā)病就診的患者。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）伴有其它器官惡性腫瘤；（2）有消化道手術(shù)史者；（3）術(shù)前行放、化療的患者；（4）有風(fēng)濕免疫性疾病及先天發(fā)育異常的患者。

1.3 流式細(xì)胞檢測(cè) 應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)兩組術(shù)后新鮮標(biāo)本MMP-11、MMP-12 和VEGF-D 的表達(dá)。新鮮標(biāo)本立即取材后應(yīng)用75%酒精固定24h 以上，用剪刀將組織剪成漿糊狀，進(jìn)行過(guò)濾，去除雜質(zhì)后離心（2000r/min，10min），取沉淀物，制備單細(xì)胞懸液（1×106/mL），取1mL，嚴(yán)格按實(shí)驗(yàn)步驟依條件加一抗、PBS 和二抗后，應(yīng)用美國(guó)BD 公司生產(chǎn)的流式細(xì)胞儀上機(jī)檢測(cè)，應(yīng)用系統(tǒng)自帶的軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。流式細(xì)胞結(jié)果判定：實(shí)驗(yàn)結(jié)果應(yīng)用熒光指數(shù)（F I）表示，F(xiàn)I計(jì)算方法：

1.4 Western Blot 檢測(cè)方法 應(yīng)用Western Blot 法檢測(cè)20 份結(jié)腸腺癌和20 份距腫物邊緣＞3cm 正常結(jié)腸黏膜組織MMP-11、MMP-12 和VEGF-D 表達(dá)。具體方法：各取適量組織加裂液和PMSF 勻質(zhì)裂解后離心取上清液提取蛋白，用BCA 法測(cè)定蛋白濃度；放入100℃水浴鍋內(nèi)煮5min，配制10%SDA-PAG凝膠，每孔加適量蛋白和Loading Buffer 混合液，電泳分離，之后將蛋白（MMP-11、MMP-12 和VEGFD）和GAPDH 的膠段切下轉(zhuǎn)移到PVDF 膜上，封閉60min，加入20mL 抗體（MMP-11 為1：500、MMP-12為1：400、VEGF-D 為1：1000）和20mL 一抗稀釋液，4℃過(guò)夜，次日洗膜，加入二抗，室溫1h 后洗膜，用ECL 發(fā)光液進(jìn)行顯影。

Western Blot 結(jié)果判定：用Image J 行灰度分析，以目的蛋白灰度值與GAPDH 灰度值的比值為其相對(duì)表達(dá)量。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SAS6.12 進(jìn)行處理，依據(jù)條件對(duì)數(shù)據(jù)行卡方檢驗(yàn)、t 檢驗(yàn)、方差分析、生存分析和線性相關(guān)性檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水平a=0.05。

2 結(jié) 果

2.1 臨床資料及病理特征 本組130 例，男69 例，女61 例，年齡38～85 歲，平均（63.0±7.9）歲，中位年齡59 歲；其中高分化23 例，中分化20 例，低分化87例；浸潤(rùn)未超過(guò)肌層者45 例，浸潤(rùn)超過(guò)肌層者85例；有脈管浸潤(rùn)者35 例，無(wú)脈管浸潤(rùn)者95 例；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移31 例，無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移99 例。

2.2 結(jié)腸癌組織與正常結(jié)腸黏膜組織MMP-11、MMP-12 和VEGF-D 表達(dá)量比較 同一病例不同部位標(biāo)本分組，兩組MMP-11、MMP-12 和VEGF-D 表達(dá)量差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。見(jiàn)表1。

表1 結(jié)腸癌組織與正常結(jié)腸黏膜組織MMP-11、MMP-12和VEGF-D 表達(dá)量比較（x±s）

2.3 研究組不同臨床及病理特征分組MMP-11、MMP-12 和VEGF-D 表達(dá)量比較 研究組MMP-11、MMP-12 和VEGF-D 表達(dá)量與脈管浸潤(rùn)、浸潤(rùn)深度和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)，MMP-11、MMP-12 表達(dá)量與細(xì)胞增殖指數(shù)相關(guān)。三者與分化程度無(wú)明顯相關(guān)性。見(jiàn)表2。

2.4 Western Blot 法 檢 測(cè)MMP-11、MMP-12 和VEGF-D 表達(dá) 20 份結(jié)腸腺癌組織MMP-11 平均表達(dá)量（0.98±0.21），20 份正常結(jié)腸黏膜組織平均表達(dá)量（0.21±0.01）；結(jié)腸腺癌組織MMP-12 平均表達(dá)量（0.83±0.11），正常結(jié)腸黏膜組織平均表達(dá)量（0.29±0.25）；結(jié)腸腺癌組織VEGF-D 平均表達(dá)量（0.81±0.20），正常結(jié)腸黏膜組織VEGF-D 平均表達(dá)量（0.18±0.03）。經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見(jiàn)圖1。

表2 研究組不同臨床及病理特征與MMP-11、MMP-12 和VEGF-D 表達(dá)比較（x±s）

圖1 Western Blot 法結(jié)果圖

2.5 研究組MMP-11、MMP-12 和VEGF-D 表達(dá)相關(guān)性分析 應(yīng)用線性相關(guān)性分析，結(jié)果顯示，MMP-11 和VEGF-D （r=0.39，P=0.0313）、MMP-12 和VEGF-D（r=0.43，P=0.0213）具有正相關(guān)性。見(jiàn)圖2-3。

圖2 MMP-11 和VEGF-D 相關(guān)性

圖3 MMP-12 和VEGF-D 相關(guān)性

2.6 研究組MMP-11、MMP-12 和VEGF-D 表達(dá)與生存時(shí)間的關(guān)系 研究組患者隨訪生存時(shí)間8～60個(gè)月，平均36.4 個(gè)月，經(jīng)生存分析顯示，MMP-11、MMP-12 和VEGF-D 的表達(dá)與生存時(shí)間相關(guān)（P＜0.05）。即MMP-11、MMP-12 和VEGF-D 高表達(dá)患者生存時(shí)間短，預(yù)后差；MMP-11、MMP-12 和VEGF-D低表達(dá)患者生存時(shí)間長(zhǎng)，預(yù)后好。見(jiàn)圖4-6。

圖4 MMP-11 表達(dá)生存分析

圖5 MMP-12 表達(dá)生存分析

圖6 VEGF-D 表達(dá)生存分析

3 討 論

結(jié)腸腺癌發(fā)生與各種基因譜系如癌基因、抑癌基因、凋亡相關(guān)基因與轉(zhuǎn)移相關(guān)基因的異常改變有關(guān)，轉(zhuǎn)移相關(guān)基因異常表達(dá)是進(jìn)展期結(jié)腸腺癌中的分子病理因素[6]。腫瘤鏡下形態(tài)主要由腺管狀、腺泡狀或乳頭狀結(jié)構(gòu)構(gòu)成，也可以表現(xiàn)為不相粘著的單個(gè)細(xì)胞構(gòu)成（彌漫狀分布），腫瘤細(xì)胞廣泛浸潤(rùn)或隱匿在結(jié)腸腸壁的各層，上皮細(xì)胞的異型性明顯，伴有不同程度的分化。MMP-11 和MMP-12 是分泌家族轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白MMPs 家族中的兩個(gè)重要成員，具有高度保守的鋅離子依賴蛋白水解酶[7]。MMP-11 主要是經(jīng)過(guò)細(xì)胞外的水解后活化，以活性酶的形式存在，能對(duì)腫瘤細(xì)胞間質(zhì)的纖維和基質(zhì)的改建起一定的作用[8]。有研究認(rèn)為，MMP-11 能調(diào)節(jié)血管或淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞的生長(zhǎng)，促進(jìn)間質(zhì)的淋巴細(xì)胞聚集和巨噬細(xì)胞反應(yīng)[9]。MMP-12 是由活化的炎細(xì)胞和惡性腫瘤細(xì)胞分泌，白細(xì)胞介素、腫瘤壞死因子、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子及血小板活化因子等均可以介導(dǎo)MMP-12 的表達(dá)，而MMP-12 在正常組織不表達(dá)[10]。MMP-12 有廣泛的底物活性，能分解彈性蛋白、IV 型原和層粘連蛋白，并對(duì)腫瘤間質(zhì)的纖維組織有明顯的降解作用[11]。VEGF-D 是新發(fā)現(xiàn)的淋巴管生成促進(jìn)因子，在高遷移腫瘤的進(jìn)展時(shí)，腫瘤細(xì)胞可以產(chǎn)生大量的VEGFD，引起間質(zhì)中淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞的增生，新形成的脈管呈枝芽狀生長(zhǎng)，在物理性條件作用下，在新生腫瘤的間質(zhì)處形成管腔，與原淋巴管連接，具有脈管的播散功能，也為腫瘤細(xì)胞遷移提供了原始通道[12-13]。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，研究組MMP-11、MMP-12 和VEGF-D 表達(dá)明顯高于對(duì)照組，提示三者具有癌基因樣作用，MMP-11、MMP-12 和VEGF-D 是腫瘤形成和進(jìn)展中的重要促進(jìn)蛋白。實(shí)驗(yàn)也顯示出流式細(xì)胞術(shù)和Western Blot 兩種半定量檢測(cè)結(jié)果表達(dá)的一致性。研究組MMP-11、MMP-12 和VEGF-D 表達(dá)量與脈管浸潤(rùn)、lauren 分型和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)，提示兩者是與腫瘤遷移和播散相關(guān)的重要蛋白。MMP-11和MMP-12 的表達(dá)與細(xì)胞的增殖指數(shù)相關(guān)，提示兩者具有促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增生和繁殖的作用。由于以上因素均為與患者生存時(shí)間（預(yù)后）相關(guān)的臨床及病理指標(biāo)，因此三者高表達(dá)可能與患者的生存時(shí)間或預(yù)后相關(guān)，而預(yù)后分析直接證實(shí)了此結(jié)論。研究組MMP-11 和VEGF-D、MMP-12 和VEGF-D 表達(dá)具有正相關(guān)性，提示MMP-11 和MMP-12 均可能促進(jìn)VEGF-D 的表達(dá)[14]，誘導(dǎo)淋巴管生成。但是MMP-11和MMP-12 在血管生成調(diào)節(jié)過(guò)程中的通路作用可能不確切。MMP-11、MMP-12 在腫瘤進(jìn)展期中的表達(dá)升高，即隨著腫瘤進(jìn)展MMP-11 和MMP-12 分泌增加，引起腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)和分化，細(xì)胞異型性明顯，增殖活躍，并能對(duì)P53 和ras 等基因進(jìn)行調(diào)控，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的遷移和播散[15-16]。MMP-12 具有多種生物學(xué)功能，通過(guò)識(shí)別ECM 及細(xì)胞膜上免疫蛋白超家族黏附分子、細(xì)胞間黏附分子等介導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的黏附作用，并引起細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)異常及調(diào)節(jié)細(xì)胞生存和增殖[17-18]。MMP-11 在腺上皮惡性轉(zhuǎn)變過(guò)程中還可能通過(guò)對(duì)WNT 和PI3K 的信號(hào)通路進(jìn)行調(diào)節(jié)起作用，由于MMP-11 本身是一種分泌蛋白，其產(chǎn)生后不僅在細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)，還可以分泌到細(xì)胞外液體環(huán)境中，即在血液和組織液中可以檢測(cè)MMP-11 表達(dá)，因此血清中可以檢測(cè)出MMP-11 表達(dá)，其與組織中的表達(dá)可能有一定的一致性[19]。VEGF-D 被認(rèn)為可能與MMP-11 和MMP-12 有協(xié)同作用的因子，MMP-11和MMP-12 可能是上游基因，調(diào)節(jié)VEGF-D/VEGFR3 等信號(hào)通路，引起細(xì)胞增殖和遷移，但是它們是否能作為淋巴管生成的直接通路有待更多實(shí)驗(yàn)證實(shí)。

總之，MMP-11、MMP-12 和VEGF-D 在結(jié)腸腺癌組織表達(dá)上調(diào)，且具有正相關(guān)性，三者對(duì)病變的形成和進(jìn)展意義明顯，聯(lián)合檢測(cè)三者的表達(dá)量對(duì)判斷預(yù)后可能有一定價(jià)值。