環(huán)境中抗生素抗性基因及消減途徑研究

朱玥晗1,，姚 欽，李 森，郭兆奎3，王光華

(1.牡丹江師范學(xué)院 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，黑龍江 牡丹江 157012；2.中國科學(xué)院 東北地理與農(nóng)業(yè)生態(tài)研究所 黑土區(qū)農(nóng)業(yè)生態(tài)重點實驗室，黑龍江 哈爾濱 150081；3.中國煙草總公司 黑龍江省公司煙草科學(xué)研究所，黑龍江 哈爾濱 150076)

0 引 言

抗生素是高等動植物以及微生物在其生長代謝過程中產(chǎn)生的，在低濃度下具有殺滅或抑制他種生物生長的活性物質(zhì)。其殺菌作用主要通過與細(xì)胞膜相互作用，干擾蛋白質(zhì)的合成，抑制生物細(xì)胞壁的合成及抑制核酸的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄4種機制完成[1]。自1928年第一種抗生素—青霉素(Penicillin)被發(fā)現(xiàn)以來，大量的抗生素投入市場，被廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、衛(wèi)生和禽畜養(yǎng)殖業(yè)。其中，用于禽畜養(yǎng)殖業(yè)中的抗生素，主要是作為飼料添加劑并以亞治療劑量進入到養(yǎng)殖生產(chǎn)中，用以預(yù)防、治療禽畜疾病和促進禽畜生長[2]。據(jù)統(tǒng)計，我國每年生產(chǎn)抗生素原料約為21萬t，其中禽畜養(yǎng)殖業(yè)的使用量約占總抗生素產(chǎn)量的46.2%[3]。然而，這些抗生素在動物體內(nèi)不能完全被吸收，添加在飼料中的抗生素約有60%～90%以原藥或代謝物的形式，隨糞尿等排泄物排出體外，污染環(huán)境；或作為有機肥施入農(nóng)田土壤，將抗生素和抗生素抗性基因(Antibiotic resistance genes，ARGs)帶入農(nóng)田生態(tài)系統(tǒng)，從而引起后續(xù)的生態(tài)和食品安全問題[4]。近年來，由于抗生素的濫用而導(dǎo)致的大量耐藥性致病菌的出現(xiàn)，引起了人們對抗生素及抗生素抗性基因的廣泛關(guān)注[5-6]。ARGs是指微生物攜帶的、能夠?qū)е挛⑸飳Π袠?biāo)抗生素產(chǎn)生抗性的遺傳元件。環(huán)境中的ARGs不僅能夠通過細(xì)菌增殖的方式進行垂直傳播，還可以通過基因盒、質(zhì)粒、噬菌體和轉(zhuǎn)座子等可移動元件(Mobile genetic element，MGE)，通過水平基因轉(zhuǎn)移(Horizontal gene transfer，HGT)的方式打破物種間遺傳方式的傳播界限，從而在不同微生物中蔓延，使更多的微生物具有抗性[7]。而一旦ARGs通過食物鏈轉(zhuǎn)移到人類的致病細(xì)菌中，將會導(dǎo)致抗生素治療失效，給人類健康帶來巨大的風(fēng)險。

自從2006年P(guān)ruden等[8]首次將ARGs作為新型環(huán)境污染物提出以來，國際上對ARGs在環(huán)境研究領(lǐng)域關(guān)注的程度日益增加。ARGs在不同環(huán)境介質(zhì)中的傳播、擴散，以及在環(huán)境中的持久性殘留帶來的潛在生態(tài)風(fēng)險可能比抗生素本身對環(huán)境危害更大[9]。本文綜述了ARGs在環(huán)境中的來源、傳播以及消減方法和途徑，旨在為了解和控制環(huán)境中ARGs的傳播提供理論和技術(shù)參考。

1 環(huán)境中ARGs的種類和來源

1.1 常見ARGs的種類

ARGs在環(huán)境中的傳播風(fēng)險，是人類健康和生態(tài)環(huán)境所面臨的安全問題之一，尤其是傳播過程中誘導(dǎo)產(chǎn)生的具有抗性的致病菌，更是嚴(yán)重威脅到生態(tài)安全及人類健康。目前，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)微生物對257種抗生素具有抗性現(xiàn)象。國際抗生素抗性基因數(shù)據(jù)庫(Antibiotic Resistance Genes Database，ARDB)包含13 293個基因、377種類型、257種抗生素、632個基因組、933個物種和124個屬的耐藥信息[10]。表1列舉的是8大類抗生素抗性基因類群中的代表性ARGs[11]。

表1 抗生素抗性基因代表性種類Table 1 Representatives of antibiotic resistance genes

1.2 ARGs的來源

1.2.1 微生物的內(nèi)在抗性。環(huán)境中ARGs的重要來源之一就是環(huán)境中微生物的內(nèi)在抗性(Intrinsic resistance)[12]。從根本上說，抗生素是一類由微生物生長代謝過程中產(chǎn)生的具有抑制其他微生物生長繁殖的次級代謝產(chǎn)物。因此，內(nèi)含抗性基因是合成這些抗生素的微生物本身所需具備的先決條件，用以維持其自身基本的生長代謝。即微生物的“內(nèi)在抗性”就是這種微生物本身所具有的潛在的抗性；而存在于環(huán)境微生物基因組上的抗性基因的原型、準(zhǔn)抗性基因能使微生物獲得抗性[13]。

多數(shù)抗生素來源于土壤微生物，某些種類的ARGs并不是現(xiàn)代醫(yī)療應(yīng)用導(dǎo)致產(chǎn)生的，而是在自然界中就已廣泛存在。D′Costa等[14]提取到3萬年前的Beringian永久凍土帶沉積物，提取這些來自于晚更新世生物的DNA，通過宏基因組分析發(fā)現(xiàn)，這些遠(yuǎn)離人類接觸的晚更新世生物的基因組上存在高多樣性的抗性基因，這些抗性基因?qū)λ沫h(huán)素類抗生素、β-內(nèi)酰胺類抗生素和糖肽類抗生素均具有抗性。2009年Allen等[15]從阿拉斯加凍土中篩選出雙功能β內(nèi)酰胺酶基因。2010年，Lang等[16]從相同凍土樣品中篩選出新的氯霉素類抗性基因。這些結(jié)果均表明，ARGs無處不在，并同樣存在于人類活動范圍之外的環(huán)境中。此外，黃福義等[17]從長期未施有機肥農(nóng)田土壤中檢測出多種ARGs，這些基因的種類和豐度遠(yuǎn)小于施用有機肥處理的土壤。

1.2.2 外源輸入。抗生素的使用導(dǎo)致人類與抗生素相關(guān)的細(xì)菌耐藥性普遍發(fā)生。大量醫(yī)源性細(xì)菌已具有較高水平的耐藥性?？股刈畛醣挥糜谥委熀皖A(yù)防人類疾病，人類服用抗生素后，抗生素在人體內(nèi)會誘導(dǎo)出抗性細(xì)菌，這些抗性菌株隨糞便排出體外，進入到城市廢水當(dāng)中，流入不同的生態(tài)環(huán)境中。進入環(huán)境中的抗性細(xì)菌攜帶的ARGs，再經(jīng)過水平轉(zhuǎn)移的方式傳遞到各種環(huán)境土著細(xì)菌中[18]。因此，在城市污水處理廠附近均發(fā)現(xiàn)高豐度的ARGs，并同時檢測到多重耐藥菌株[19-20]?？股鼗蚩剐约?xì)菌隨制藥業(yè)廢水、養(yǎng)殖場污水、城市生活廢水及醫(yī)療廢水等進入污水處理系統(tǒng)后，由于現(xiàn)有的污水處理技術(shù)對絕大部分的抗生素和抗性細(xì)菌沒有明顯的去除效果，一定數(shù)量的抗生素抗性細(xì)菌存留在污水中[21]，污水淤泥或沉積物經(jīng)過填埋，露天堆肥后ARGs又將會被帶入到土壤及周圍環(huán)境中[22-23]。

同樣，在禽畜養(yǎng)殖業(yè)中，集約化的養(yǎng)殖極大地促進了ARGs的蔓延。動物的腸道微生物中含有豐富的抗性細(xì)菌和ARGs。動物糞便經(jīng)堆肥后直接施用在農(nóng)田土壤中，增加了土壤中ARGs的豐度[24]。在水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)中，糞便直接排放到水體環(huán)境中。Agers?等[25]在養(yǎng)殖魚類的水體及底泥樣本中，均高頻地檢出磺胺類及四環(huán)素類抗性基因。在地中海沿岸的養(yǎng)魚場，養(yǎng)殖飼料雖未添加任何抗生素，但養(yǎng)殖場及附近的池塘中均發(fā)現(xiàn)四環(huán)素類tetM、tetO、tetL和tetK以及大環(huán)內(nèi)酯類ermB、ermA和ermC等多種抗性基因，說明海水養(yǎng)殖可能促進了該漁場中抗性基因的水平轉(zhuǎn)移[26]。這些水資源中的ARGs，也可通過食物鏈在人體中富集，如Pruden等[27]在城市飲用水及循環(huán)水中均檢測到一定濃度的磺胺類和四環(huán)素類抗性基因。

2 ARGs的傳播途徑

ARGs在環(huán)境中的傳播途徑如圖1所示。ARGs通過多種直接或間接的傳播途徑在環(huán)境介質(zhì)中擴散蔓延，在傳播過程中誘導(dǎo)出抗性菌株[28]。其中，城市污水處理廠和集約化養(yǎng)殖場是最為關(guān)鍵和主要的傳播源。從圖1中我們不難看出，各個ARGs儲庫之間相互聯(lián)系，人類、動物和環(huán)境之間形成了一個循環(huán)，使得ARGs不斷的進行傳播和積累。

2.1 ARGs的垂直傳播

ARGs垂直傳播是指攜帶ARGs的細(xì)菌在增殖過程中將ARGs傳遞給子代細(xì)菌，從而提高ARGs在環(huán)境中的含量[29]。自然界中存在某些微生物，他們本身具有ARGs序列，天然地對抗生素表現(xiàn)出抗性性狀。一部分位于基因組上的ARGs來自于那些能夠產(chǎn)生抗生素的菌株所產(chǎn)生的保護機制，這些ARGs可以通過繁殖將抗性基因序列垂直地傳播給下一代，從而實現(xiàn)抗性基因的增殖。而另一部分位于質(zhì)粒上的抗性基因的垂直增殖與質(zhì)粒特性有關(guān)[30-31]。這些攜帶有抗性基因的微生物，在環(huán)境中的適應(yīng)性會受到環(huán)境中選擇壓力的制約，抗性基因逐代選擇進化的同時，ARGs在群落中的頻率會相應(yīng)地升高。

圖1 抗生素抗性基因傳播途徑Fig.1 Antibiotic resistance gene transmission pathway

2.2 ARGs的水平轉(zhuǎn)移

從上世紀(jì)40年代開始，不同物種間遺傳物質(zhì)的傳遞就成為了研究熱點。隨著對抗生素不斷地深入研究，科研工作者逐漸證實了ARGs的水平轉(zhuǎn)移途徑[32]。ARGs水平轉(zhuǎn)移是基因組中可移動遺傳因子(整合子(integron)、轉(zhuǎn)座子(transposon)及質(zhì)粒(plasmid)等)通過HGT機制在環(huán)境中傳播ARGs。HGT機制包含基因的接合(conjugation)、轉(zhuǎn)化(transformation)和轉(zhuǎn)導(dǎo)(transduction)幾種方式。HGT機制是將ARGs從一種微生物轉(zhuǎn)移到另一種微生物中，從而使后者獲得該抗性的一種分子機制[33]。ARGs的水平轉(zhuǎn)移是微生物在抗生素藥物的選擇壓力下長期進化的結(jié)果，是微生物適應(yīng)抗生素的主要分子機制之一。

另外，宏基因組分析表明，噬菌體DNA中存在某些ARGs[34]。噬菌體在宿主中將毒力基因和ARGs整合到細(xì)菌DNA上，形成前噬菌體(Prophage)，并激活噬菌體的裂解周期，使噬菌體基因和細(xì)菌染色體分離，產(chǎn)生新的噬菌體，新的噬菌體持續(xù)誘導(dǎo)，直到宿主細(xì)胞裂解，釋放出更多噬菌體到細(xì)胞外。游離的噬菌體攜帶ARGs，尋找新的寄主，持續(xù)進行侵染傳播[35]。同時，噬菌體具有在不同種屬之間轉(zhuǎn)移ARGs的優(yōu)勢。因此，噬菌體拓寬了攜帶ARGs侵染的范圍[36]。故此，噬菌體也是引起ARGs水平轉(zhuǎn)移的方式之一。

3 不同環(huán)境中ARGs豐度變化

正確評估抗生素的生態(tài)風(fēng)險、抗性機制和傳播途徑，需要定量分析ARGs在不同環(huán)境中的豐度。越南[37]、泰國[38]、韓國[39]、埃及[40]和印度[41]的醫(yī)療廢水中，均發(fā)現(xiàn)了對廣譜頭孢霉素類抗生素和氟喹諾酮類抗生素具有抗性的大腸桿菌，并在這些具有抗性的大腸桿菌中發(fā)現(xiàn)了blaSHV、blaTEM、blaCTX-M、aac(6′)-Ib-cr、qnrA、qnrB、qnrS和qepA等多種抗性基因。Seifrtov等[42]采用固相萃取法，在pH為10.5的條件下，萃取富集了城市污水的喹諾酮類抗生素，喹諾酮類抗生素回收率為84%，羅紅霉素回收率為89%～93%。以上研究表明，世界各地水體中均含有數(shù)目可觀的ARGs，尤以磺胺類、四環(huán)素類抗性基因居多，這可能與相應(yīng)抗生素的大量使用及其在環(huán)境中的殘留有關(guān)[15]。

受人類活動影響，河流及沉積物中也檢測到一定豐度的抗生素抗性基因。Luo等[43]對中國海河72 km長的水體和沉積物樣本進行定量PCR分析，雖未檢測到四環(huán)素ARGs，但在所有樣品中均檢測到高濃度的磺胺類抗生素sul1和sul2。其中，沉積物中sul1和sul2濃度比水體中高120～2 000倍，表明沉積物是海河流域重要的ARGs儲存庫[44]。隨著養(yǎng)殖業(yè)抗生素的使用和種植業(yè)畜禽糞肥的施用，農(nóng)田土壤也是ARGs一個主要來源庫。Zhu等[45]采用高通量熒光定量PCR技術(shù)研究發(fā)現(xiàn)，施用雞糞、豬糞和牛糞等有機肥與施用化肥和不施肥對照相比，ARGs豐度存在顯著性差異。黃福義等[17]對施用豬糞的水稻土中295種ARGs進行研究發(fā)現(xiàn)，未施用豬糞的水稻土中僅有66種ARGs被檢出，而長期施用豬糞的水稻土中有107個ARGs基因被檢出，其中49種基因的豐度顯著高于未施肥土壤，施用豬糞水稻土中喹諾酮類抗性基因、氯霉素類抗性基因的mexF的豐度相對于未施用豬糞水稻土增加了1 791倍。該結(jié)果表明，施用豬糞后水稻土抗生素抗性基因分布格局發(fā)生顯著變化。

4 環(huán)境中ARGs的消減方法和途徑

近年來，ARGs在環(huán)境中的污染情況越來越嚴(yán)重，科研工作者也在不斷地探索如何更有效地去除環(huán)境中抗性基因及抗性細(xì)菌，以期達(dá)到更好的去除效果。

4.1 高溫/低溫厭氧處理

高溫能夠有效地去除抗生素抗性基因，一方面是因為高溫有利于促進生化反應(yīng)的進行[46-47]，另一方面是因為溫度會改變環(huán)境中菌群的DNA組成結(jié)構(gòu)[48]。

污水處理廠是抗生素抗性基因的一個重要儲庫，源頭處理是控制抗生素蔓延的一個重要環(huán)節(jié)。Ghosh等[49]研究了嗜溫(35 ℃～37 ℃)和嗜熱(50 ℃～60 ℃)兩相厭氧消化系統(tǒng)對污水中四環(huán)素類抗性基因的去除效果。研究發(fā)現(xiàn)，不論是嗜溫還是嗜熱消化過程都顯著減少了tetX、tetO和intL1的豐度，其中tetX的去除率達(dá)到了85%～99%，intL1的去除率達(dá)到的80%～95%，tetA和tetO的去除率也能達(dá)到50%～80%；而在嗜溫厭氧消化階段tetA豐度出現(xiàn)了反彈。

Diehl等[50]采用熒光定量PCR的方法，研究了不同溫度下改變好氧和厭氧條件對污泥中抗生素抗性基因的去除效果。發(fā)現(xiàn)在厭氧環(huán)境下，tetA、tetL、tetO、tetW、tetX和intL1這6種抗生素抗性基因的去除速率和去除效率隨著溫度的升高顯著增加；而在好氧情況下，即使改變溫度也不能明顯降低四環(huán)素類抗性基因的含量。Ma等[51]通過比較嗜熱和嗜溫厭氧系統(tǒng)對抗性基因的去除效果，結(jié)果顯示，ermB、ermF、tetO和tetW這4種抗性基因在嗜熱厭氧系統(tǒng)中隨著溫度的升高可以有效地去除，并且效果明顯優(yōu)于嗜溫厭氧系統(tǒng)。Xu[52]等在海河流域的研究發(fā)現(xiàn)，4℃以下磺胺甲惡唑的生物去除率為40.5%，將溫度提高到25℃時，去除效率達(dá)82.9%。因此，高溫厭氧處理可以更加有效地去除抗生素抗性基因。

4.2 光照

研究發(fā)現(xiàn)，光照可以加速ARGs的降解。Engemann等[53]采用微宇宙培養(yǎng)的方法，量化ARGs衰減效率及ARGs的遷移速率。在對6種抗性基因tetO、tetW、tetM、tetQ、tetB和16S rRNA進行為期14天基因水平監(jiān)測發(fā)現(xiàn)，在陽光下6個基因的消失系數(shù)總是高于在黑暗條件下。進而，Engemann等[54]在實驗室通過模擬太陽“光”和“暗”條件，通過熒光定量PCR技術(shù)，分別對tetO、tetW、tetM、tetQ和16S rRNA進行為期29天基因水平監(jiān)測，發(fā)現(xiàn)無論氧四環(huán)素基因水平高低，光存在時基因消失率始終最高。Chen等[55]通過對可見光、模擬太陽光和紫外光等不同光輻射條件下的共軛轉(zhuǎn)移，發(fā)現(xiàn)紫外光輻照可以極快增加共軛頻率，從而使耐藥菌迅速失活。研究表明，紫外光一方面可以滅活細(xì)胞，從而達(dá)到消除ARGs的垂直傳播，另一方面，紫外輻射能夠破壞DNA結(jié)構(gòu)，降低ARGs的轉(zhuǎn)換能力，從而降低抗性基因的水平轉(zhuǎn)移風(fēng)險[56]。紫外輻射對ARGs消除具有一定的選擇作用，譬如對四環(huán)素類tetG和tetQ不能達(dá)到徹底去除的效果[57]。因此，利用紫外輻射去除抗性基因的方式還需不斷完善，技術(shù)方式有待提升。

4.3 物理及化學(xué)法

隨著飲用水工藝的發(fā)展，以及人類對水質(zhì)量的要求逐漸提高，污水處理方法也在逐步升級更新。目前，研究較多的處理方法主要有高級氧化法、活性污泥法、生物膜處理和物理沉降法等。?ncü等[58]從大腸桿菌(E.coli)中分離出質(zhì)粒DNA，比較常規(guī)氯、臭氧消毒和TiO2光催化對降低抗生素抗性的有效性研究，發(fā)現(xiàn)氯不影響質(zhì)粒DNA結(jié)構(gòu)，但TiO2光催化和臭氧均可破壞DNA超螺旋結(jié)構(gòu)，并且消減程度隨著氧化劑劑量的增加而增加。Cengiz等[59]將Fenton試劑和臭氧氧化法應(yīng)用于去除tetM基因及其宿主大腸桿菌HB101，研究發(fā)現(xiàn)在合適的實驗劑量下使用Fenton試劑和臭氧氧化法均可使糞便中部分抗性細(xì)菌滅活，而通過臭氧化過程以O(shè)33.125 mg·g-1糞漿的施用劑量可以使糞便中98.5%的抗性細(xì)菌滅活。Fenton試劑添加量達(dá)到50 mM H2O2和5 mM Fe2+時，可以達(dá)到最好的去除效果。除了高級氧化法之外，膜處理法對抗生素抗性基因的消減也有很好的效果[60-61]。Le等[62]比較了常規(guī)活性污泥和膜生物反應(yīng)器這兩種不同處理工藝對抗性基因的去除效果，發(fā)現(xiàn)膜生物反應(yīng)器對Antibiotic resistance bacteria(ARB)、ARG和大多數(shù)靶向抗生素的清除效果更好，能夠降低抗性基因的含量2.57～7.06個數(shù)量級[63]。

農(nóng)田土壤中ARGs去除是一個棘手的問題，除了從源頭上降低AGRs的種類和豐度外，Cui等[64]研究發(fā)現(xiàn)在土壤中添加生物炭也是一種改良土壤中ARGs污染的有效方法。因其成本低廉，效果顯著，現(xiàn)已引起科學(xué)工作者的關(guān)注。段曼莉[65]通過對禽畜養(yǎng)殖場糞便堆放地和農(nóng)用地的土壤添加生物炭，發(fā)現(xiàn)生物炭增加了土壤對氧四環(huán)素(土霉素)的吸附能力，加速了土壤中氧四環(huán)素的生物和非生物降解，降低了土壤、植物葉片和根系中氧四環(huán)素和ARGs的累積和轉(zhuǎn)運。由此可見，生物炭可有效消減土壤中氧四環(huán)素和ARGs的含量，是一種良好的土壤修復(fù)劑。

4.4 人工濕地

人工濕地是一種常規(guī)的污水處理系統(tǒng)，通常作為化學(xué)、物理及生物處理之后的一種輔助處理方式，因其工藝簡單，經(jīng)濟高效，現(xiàn)已被廣泛應(yīng)用于城鎮(zhèn)污水處理系統(tǒng)[66]。Chen等[67]通過分析杭州市周邊地區(qū)的污水處理廠ARGs發(fā)現(xiàn)，人工濕地可以有效降低2個數(shù)量級的ARGs豐度。隨后，Chen[68]通過比較生物曝氣濾池、紫外消毒及人工濕地這3種處理方式對ARGs的去除效果，發(fā)現(xiàn)人工濕地是最好的處理方式。

5 研究展望

臨床醫(yī)療和畜牧養(yǎng)殖存在長時間、大劑量和濫用抗生素的問題，導(dǎo)致抗生素抗性細(xì)菌和ARGs在不同生態(tài)環(huán)境中分布、種類和豐度發(fā)生了顯著變化，其潛在的環(huán)境問題和健康風(fēng)險引起了有關(guān)科研工作者的關(guān)注。針對環(huán)境中的ARGs的污染所導(dǎo)致的生態(tài)和食品安全問題，研究制定有效的ARGs防控措施已經(jīng)成為當(dāng)前亟需解決的問題。目前，關(guān)于ARGs的研究已經(jīng)廣泛開展，但是還有很多問題尚待解決，主要包括：(1)完善地區(qū)內(nèi)污染的抗性基因水平的定量解析方法；(2)研發(fā)綠色安全的飼料添加劑；(3)研發(fā)有效的污水處理技術(shù)，降低醫(yī)療廢水、生活污水和養(yǎng)殖業(yè)廢水中抗性細(xì)菌和ARGs的豐度；(4)污水處理場、畜禽糞便是ARGs的主要儲存地，應(yīng)在這些場所建立完整的ARGs監(jiān)測預(yù)警體系，并深入開展消減環(huán)境抗生素及ARGs的相關(guān)研究，最大限度地降低ARGs流入農(nóng)田、流向餐桌的風(fēng)險，保障生態(tài)和食品安全；(5)結(jié)合國內(nèi)外最先進抗生素消減技術(shù)，將技術(shù)落實、簡化并應(yīng)用到抗性基因高豐度地區(qū)，進行技術(shù)普及。