血清microRNA-4286表達(dá)與胃癌臨床病理特征的關(guān)系及其臨床意義*

郭紅艷，高勇，張春晶，李淑艷，吳琦，黃常志，孫曉杰

（1.齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院 生物化學(xué)教研室，黑龍江 齊齊哈爾 161006；2.齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院第三 附屬醫(yī)院 檢驗(yàn)科，黑龍江 齊齊哈爾 161002；3.中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 腫瘤醫(yī)院 分子腫瘤學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100021）

胃癌是世界第3 大癌癥死亡原因，約50%胃癌發(fā)生在中國(guó)，且年輕患者死亡率呈逐年上升的趨勢(shì)[1-2]。 microRNAs（miRNAs）與人類腫瘤的發(fā)生、發(fā)展關(guān)系密切，是新型基因診斷標(biāo)志物[3-4]。MicroRNA-4286（miR-4286）定位于人類染色體8p23.1，在惡性黑色素瘤等腫瘤組織中表達(dá)上調(diào)[5-6]，但miR-4286 在胃癌中的表達(dá)及其與胃癌發(fā)生、發(fā)展的關(guān)系國(guó)內(nèi)外卻未見(jiàn)報(bào)道。本文通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（quantitative real-time polymerase chain reaction,qRTPCR）檢測(cè)胃癌血清樣本中miR-4286 的表達(dá)，分析其與胃癌臨床病理特征的關(guān)系，初步探討其對(duì)胃癌的臨床診斷效能及意義。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

選取2017年3月—2017年6月在中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院腫瘤醫(yī)院住院的胃癌患者（胃癌組，84 例）和健康體檢者（對(duì)照組，60 例）。其中對(duì)照組男性19 例，女性41 例，平均年齡（48.71±10.53）歲；胃癌組男性66 例，女性18 例，平均年齡（59.57±9.28）歲。胃癌組樣本在收集前患者均未進(jìn)行手術(shù)、放療和化療等相關(guān)治療。癌癥診斷和腫瘤分期根據(jù)手術(shù)結(jié)果，按照美國(guó)癌癥聯(lián)合委員會(huì)癌癥的TNM 分期系統(tǒng)第6版確定[2]。不適合手術(shù)治療的患者，通過(guò)組織活檢及影像學(xué)檢查確定臨床診斷和腫瘤分期。本研究經(jīng)過(guò)本院倫理會(huì)批準(zhǔn)，所有研究對(duì)象簽署知情同意書(shū)。

1.2 方法

1.2.1 血清標(biāo)本收集 用血清收集管分別收集5 ml胃癌組和對(duì)照組靜脈血，室溫靜止1 h 后，4 ℃、3 500 r/min 離心10 min。將上層血清轉(zhuǎn)移到新的收集管，4℃、16 000 r/min 離心10 min，除去細(xì)胞碎片，于-80℃保存。

1.2.2 血清總RNA 提取 采用Trizol LS 試劑（美國(guó)Invitrogen 公司）從血清中提取總RNA，按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。取250μl 血清，加入750μl Trizol LS，室溫裂解后分別加入三氯甲烷、異丙醇及75%乙醇（北京化工廠）等試劑提取總RNA，用10μl RNase free ddH2O（美國(guó)Sigma公司）溶解RNA，于-80℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 qRT-PCR 將 血 清 總RNA 采 用Mir-X miRNA First-Strand Synthesis 和SYBR qRT-PCR 試劑盒（日本TaKaRa 公司）逆轉(zhuǎn)錄生成cDNA。逆轉(zhuǎn)錄總反應(yīng)體系為10μl，包含5.00μl mRQ 緩沖液、1.25μl mRQ 酶、3.75μl RNA 模板，逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件：37℃、60 min，85℃、5 min。反應(yīng)生成的cDNA 模板10 倍稀釋后進(jìn)行qRT-PCR。PCR 反應(yīng)體系總體積20μl，miR-4286 正向引物由美國(guó)Invitrogen 公司合成，引物序列：5’-ACCCCACTCCTGGTACC-3’，通用引物和U6 引物均為試劑盒自帶。使用QuantStudioTM7 Flex qRT-PCR 儀（美國(guó)ABI 公司）進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性10 s，95℃變性5 s，60℃退火及延伸20 s，共40 個(gè)循環(huán)。每個(gè)樣品設(shè)置3 個(gè)復(fù)孔，以U6 為內(nèi)參照基因，基因相對(duì)表達(dá)量采用2-ΔΔCt法計(jì)算。

1.2.4 腫瘤標(biāo)志物的檢測(cè) 采用全自動(dòng)電化學(xué)發(fā)光免疫分析儀（瑞士羅氏公司）測(cè)定血清樣本中腫瘤標(biāo)志物癌胚抗原（carcinoembryonic antigen,CEA）、糖類抗原19-9（carbohydrate antigen 19-9,CA19-9）和糖類抗原72-4（carbohydrate antigen 72-4,CA72-4）的表達(dá)量，檢測(cè)結(jié)果通過(guò)查閱臨床病例資料獲得，上限值分別為5.0 ng/ml、39 u/ml 和8.2 u/ml。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 21.0 統(tǒng)計(jì)軟件。正態(tài)分布的計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，非正態(tài)分布的計(jì)量資料用非參數(shù)秩和檢驗(yàn)（Mann-Whitney U）；計(jì)數(shù)資料以率或百分比表示，用Fisher 確切概率法；繪制受試者工作特征曲線（ROC），P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 胃癌患者血清miR-4286 表達(dá)升高

qRT-PCR 結(jié)果顯示，miR-4286 在對(duì)照組和胃癌組患者血清中的表達(dá)量分別為（1.810±2.099）和（4.707±4.649），經(jīng)秩和檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Z=-4.644，P=0.000），胃癌組平均升高2.601 倍。 見(jiàn)圖1。

圖1 兩組miR-4286 表達(dá)水平比較

2.2 miR-4286 的ROC 曲線診斷性能

繪制ROC 曲線，計(jì)算出約登指數(shù)，最大約登指數(shù)的對(duì)應(yīng)值即為最佳預(yù)測(cè)值（Cut off 值）。經(jīng)計(jì)算確定Cut off 值為3.381，此時(shí)曲線下面積（AUC）為0.727（95%CI：0.645，0.810），敏感性和特異性分別為48.8%和88.3%。以3.381為診斷閾值（即危險(xiǎn)分?jǐn)?shù)），將樣本劃分為兩組，即高危險(xiǎn)風(fēng)險(xiǎn)組和低危險(xiǎn)風(fēng)險(xiǎn)組，前者代表胃癌患者，后者健康體檢者，進(jìn)行危險(xiǎn)分?jǐn)?shù)分析，結(jié)果顯示血清miR-4286 診斷胃癌的陽(yáng)性預(yù)測(cè)值和陰性預(yù)測(cè)值分別為0.872 和0.557。見(jiàn)表1和圖2。

2.3 血清miR-4286 表達(dá)與胃癌臨床病理特征的關(guān)系

將胃癌組根據(jù)性別、年齡、TNM 分期及病理分化程度等進(jìn)行分類統(tǒng)計(jì)。Fisher 確切概率法結(jié)果表明，miR-4286 表達(dá)水平與腫瘤分化程度相關(guān)（P＜0.05），與性別、年齡、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、臨床分期無(wú)關(guān)（見(jiàn)表2）。秩和檢驗(yàn)結(jié)果顯示，胃癌血清中miR-4286 的表達(dá)量與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移與否、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移與否及腫瘤臨床分期（Ⅰ～Ⅳ）無(wú)關(guān)（Z=-1.270、-1.432 和-1.218，P=0.204、0.152和0.223），但其在低分化胃癌患者血清中的表達(dá)量高于中、高分化胃癌患者（Z=-2.661，P=0.008）（見(jiàn) 圖3）。

表1 胃癌患者和健康對(duì)照者的危險(xiǎn)分?jǐn)?shù)分析

圖2 miR-4286 的ROC 曲線

表2 胃癌臨床因素與miR-4286 表達(dá)水平的關(guān)系 例

2.4 腫瘤標(biāo)志物CA19-9、CEA 和CA72-4 在胃癌患者血清中的表達(dá)

通過(guò)查閱病例，對(duì)胃癌組和對(duì)照組樣本的腫瘤標(biāo)志物CA19-9、CEA 和CA72-4 檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。秩和檢驗(yàn)結(jié)果顯示，胃癌血清中CA72-4 表達(dá)量較對(duì)照組升高（Z=-3.324，P=0.001）；兩組CA19-9和CEA 比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Z=-1.315 和-1.400，P=0.188 和0.161）（見(jiàn)圖4）。ROC 曲線結(jié)果顯示，CA19-9、CEA 和CA72-4 診斷胃癌的AUC 分別為0.574（95% CI：0.465，0.683）、0.579（95% CI：0.469，0.689）和0.691（95% CI：0.587，0.795）（見(jiàn) 圖5）。

2.5 miR-4286 與CA72-4 對(duì)胃癌診斷的效能比較

以病理診斷為金標(biāo)準(zhǔn)，將miR-4286 與腫瘤標(biāo)志物CA72-4 對(duì)胃癌的診斷效能進(jìn)行比較，結(jié)果顯示，miR-4286 診斷胃癌的特異性和陽(yáng)性預(yù)測(cè)值高于臨床常用腫瘤標(biāo)志物CA72-4。見(jiàn)表3。

圖3 miR-4286 表達(dá)水平與胃癌臨床病理特征的關(guān)系 （±s）

圖4 兩組腫瘤標(biāo)志物的表達(dá)水平比較

圖5 CA19-9、CEA、CA72-4 的ROC 曲線

表3 血清miR-4286、CA72-4 診斷胃癌的敏感性和特異性比較

3 討論

miRNA 是通過(guò)干擾1 個(gè)或多個(gè)靶mRNA 的翻譯來(lái)調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄后基因表達(dá)的微小非編碼RNA，參與細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖、分化、凋亡和衰老等生理、病理過(guò)程[7]。 miRNA 通過(guò)影響癌基因和腫瘤抑制基因的表達(dá)成為人類致癌的重要調(diào)節(jié)因子，其異常調(diào)節(jié)可能與所有類型癌癥的發(fā)病機(jī)制相關(guān)[8-9]，其表達(dá)水平在胃癌等多種惡性腫瘤中可作為潛在的診斷和預(yù)后生物標(biāo)志物[10-12]。

miR-4286 是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的miRNAs，其在惡性黑色素瘤及食管癌組織中表達(dá)升高，miR-4286 通過(guò)靶向INPP4A基因激活JAK2/STAT3 信號(hào)通路，促進(jìn)食管癌的發(fā)生，與食管癌患者的預(yù)后生存期高風(fēng)險(xiǎn)密切相關(guān)，有望成為食管癌治療的靶點(diǎn)[13-14]。但miR-4286與其他腫瘤發(fā)生及診斷預(yù)后的關(guān)系未見(jiàn)報(bào)道。本研究通過(guò)qRT-PCR 實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，miR-4286 在胃癌血清中的表達(dá)量高于對(duì)照組，且其表達(dá)水平與腫瘤分化程度相關(guān)。筆者據(jù)此推測(cè)，miR-4286 可能參與胃癌細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化過(guò)程，但其發(fā)揮作用的分子機(jī)制還需進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)研究。

目前臨床常用的胃腸道腫瘤標(biāo)志物主要有CEA、CA19-9 和CA72-4，但其對(duì)胃癌診斷的敏感性和特異性都不高，如LIANG 等[15]對(duì)2 288 例胃癌患者和1 869 例對(duì)照組進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)CEA、CA19-9 和CA724 獨(dú)立診斷胃癌的敏感性僅為20.1%～27.6%，而3 者聯(lián)合診斷可將敏感性提高至48.2%。YU 等[16]對(duì)216 例胃癌患者的臨床檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，結(jié)果CEA、CA19-9 和CA72-4 獨(dú)立診斷的敏感性分別為22.69%、18.98%和22.69%，而3 者聯(lián)合診斷的敏感性達(dá)44.91%。GUO 等[17]對(duì)1 566 例胃癌患者的臨床檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行ROC 曲線分析，結(jié)果CEA、CA19-9 和CA724 區(qū)分胃癌和健康人的AUC 分別為0.582、0.571和0.544。本研究發(fā)現(xiàn)，CA724 診斷的AUC 為0.691，高于文獻(xiàn)報(bào)道[17]，但其獨(dú)立診斷的敏感性和特異性分別為31.57%和55.95%，作為診斷標(biāo)志物導(dǎo)致較高的漏診率；而miR-4286 診斷胃癌的AUC 為0.727，診斷的特異性高達(dá)90%，陽(yáng)性預(yù)測(cè)值為0.872，高于CA72-4，因此可能具有潛在的臨床應(yīng)用前景。

目前非編碼RNA 的研究正如火如荼，由于循環(huán)miRNAs 反映癌癥進(jìn)展的狀態(tài)，且其穩(wěn)定性較好，因此可能是癌癥快速檢測(cè)和治療的潛在生物標(biāo)志物[18]。本研究初步探討miR-4286 的表達(dá)水平與胃癌的關(guān)系，為闡明miR-4286 的生物學(xué)功能奠定了基礎(chǔ)，至于miR-4286 的表達(dá)是否具有組織或器官特異性，以及其在腫瘤發(fā)生、發(fā)展中作用的分子機(jī)制，還需更深入的基礎(chǔ)研究及大規(guī)模的臨床樣本進(jìn)行驗(yàn)證。