7個地理種群小鼠TLR9基因的遺傳多樣性分析

冷冰霜 于立強 黃玲

摘要 [目的]分析我國7個地理種群小鼠TLR9基因的遺傳多樣性。[方法]利用PCR技術(shù)擴增并測序7個地理種群100個小鼠樣品的TLR9基因。使用MEGA 7.0、DnaSP等軟件對基因序列進行分析，計算遺傳距離、遺傳多樣性，并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。[結(jié)果]獲得的TLR9基因片段長度為1 030 bp，位于參與對病原體相關(guān)分子模式識別的LRR結(jié)構(gòu)域的編碼區(qū)，A、T、C、G的平均含量分別為22.9%、22.2%、32.8%和22.0%，各地理種群間堿基含量沒有明顯差異。通過計算各地理種群間遺傳距離及核苷酸多樣性發(fā)現(xiàn)，這7個地理種群小鼠TLR9基因序列較為保守，并無明顯遺傳分化。以褐家鼠（NM_198131） 作為外群構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，其結(jié)果與遺傳多樣性分析相一致。[結(jié)論]7個地理種群小鼠TLR9基因遺傳多樣性較低，具有極高的保守性。

關(guān)鍵詞 小鼠;TLR9 基因;遺傳多樣性

中圖分類號 Q953文獻標(biāo)識碼 A

文章編號 0517-6611（2019）10-0089-03

Abstract [Objective]To analyze the genetic diversity of TLR9 gene in Mus musculus from 7 geographical populations of China.[Method] PCR technology was used to amplify and sequence TLR9 gene of 100 mice samples in 7 geographical populations.Using MEGA 7.0，DnaSP and other software，the sequences of TLR9 gene were analyzed，the genetic distance and genetic diversity were calculated，and the phylogenetic tree was constructed.[Result]The length of TLR9 gene fragment was 1 030 bp.TLR9? gene was located in the encoding region of LRR domain， which was involved in the identification of pathogenrelated molecular patterns.The average content of bases A，T，C，G were 22.9%，22.2%，32.8% and 22.0% respectively.There was no significant difference in base composition among different geographical populations.Through calculating the genetic distance and nucleotide diversity among the geographical populations，it was found that TLR9 gene in M.musculus in 7 geographical populations was conservative，and there was no obvious genetic differentiation.The phylogenetic tree was constructed with Rattus norvegicus （NM_198131） as the outgroup，the results were consistent with the genetic diversity analysis.[Conclusion]The genetic diversity of TLR9 gene in M.musculus of 7 geographical populations was low，with high conservation.

Key words Mus musculus;TLR9 gene;Genetic diversity

小鼠（Mus musculus）是全球性分布的小型嚙齒類動物，其適應(yīng)性強、行動敏捷，活動范圍廣泛，主要棲息在與人類生產(chǎn)和生活密切相關(guān)的生境區(qū)域（室內(nèi)生境、室周生境及農(nóng)業(yè)耕作區(qū)等），是最常見的家棲鼠種之一[1]。小鼠與人類伴生，關(guān)系密切，作為易感宿主，其體內(nèi)外存在多種寄生蟲，可以攜帶多種病原體，并傳播多種人獸共患病，目前已發(fā)現(xiàn)的有20多種，如萊姆病、腎綜合征出血熱、恙蟲病、鼠疫和地方性斑疹傷寒等[2]。小鼠早在6 000萬年前便和人類共有同一祖先，與人類在基因組水平上的同源性高達93%。同時，其生理生化指標(biāo)及其調(diào)控機制也與人類相同或相似，進一步為其作為人類疾病研究模型提供了強有力的證據(jù)[3-4]。因此，小鼠被廣泛應(yīng)用于生物學(xué)和醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域中，是具有重要應(yīng)用價值和意義的模式動物之一。

早在17世紀(jì)就有人用野生小鼠做試驗，人們從野生小鼠中選擇培育實驗品系小鼠，迄今為止已培育出1 000多種品系。科學(xué)家們研究發(fā)現(xiàn)，在野生小鼠中平均每100～200 bp 就包含1個單核苷酸多態(tài)性（SNPs）[5-6]。研究發(fā)現(xiàn)，實驗品系小鼠基因組的遺傳多樣性比野生小鼠低，在實驗品系小鼠染色體上發(fā)現(xiàn)的SNPs只占野生小鼠中的25%左右[7]。這些研究表明，實驗品系小鼠的遺傳多樣性水平遠遠低于野生小鼠，與實驗品系小鼠相比生存在自然環(huán)境下的野生小鼠積累了豐富的歷史重組事件[8-9]。因此，探究野生小鼠的遺傳多樣性對于復(fù)雜性狀的研究具有非常重要的意義。我國疆域遼闊，地形地貌復(fù)雜，氣候環(huán)境多變，擁有豐富多樣的物種資源，這極大地豐富了野生小鼠資源，為研究小鼠種群遺傳進化提供了優(yōu)越的條件。

外界環(huán)境中存在多種病原微生物，威脅著生物的生存。生物在長期的進化過程中逐步形成并不斷完善免疫系統(tǒng)來抵抗病原微生物。免疫系統(tǒng)是宿主的防御系統(tǒng)，包括天然免疫（innate immunity） 防線和適應(yīng)性免疫 （adaptive immunity） 防線[10-11]。研究發(fā)現(xiàn)，天然免疫的防御機制是機體通過病原體相關(guān)分子模式 （pathogenassociated molecular patterns，PAMP）對病原體的保守結(jié)構(gòu)進行識別[11-12]，然后在細(xì)胞內(nèi)外發(fā)生一系列反應(yīng)，最終啟動免疫應(yīng)答。

Toll樣受體（tolllike receptor，TLRs）家族是天然免疫模式識別受體中重要的一員，同時也是連接天然免疫和適應(yīng)性免疫的橋梁[13]。當(dāng)病原微生物突破機體的第一道免疫抵御防線時，TLRs可以識別它們并激活機體產(chǎn)生免疫應(yīng)答[14-15]。迄今為止，哺乳動物中已經(jīng)鑒定出13個TLRs家族成員，命名為TLR1～TLR13，但在不同的物種中含有的TLRs成員不一樣，小鼠體內(nèi)含有12個家族成員，分別為TLR1～9和TLR11～13[16-17]。TLR9在識別外源 DNA的過程中起到非常重要的作用[18-19]，研究發(fā)現(xiàn)在TLR9基因缺陷的小鼠中核因子-κB （nuclear factor-kappa-B，NF-κB）、c-Jun氨基末端激酶 （c-Jun N-terminal kinase，JNK） 等信號分子都被破壞，不能對DNA中非甲基化的CpG 寡聚核苷酸序列產(chǎn)生免疫應(yīng)答[15]，這表明TLR9蛋白受體對于識別細(xì)菌的非甲基化CpG DNA是不可缺少的[20-21]，此外還可能識別各種非正常結(jié)構(gòu)及成分的DNA序列[22]。筆者對我國7個地理種群100個小鼠TLR9基因序列進行了分析，探究小鼠TLR9基因的遺傳多樣性，進而為揭示我國小鼠遺傳多樣性與病原微生物間的關(guān)系提供基礎(chǔ)性信息。

1 材料與方法

1.1 樣品采集 樣品采自我國7個地區(qū)，包括漠河（MH）、煙臺（YT）、渭南（WN）、烏魯木齊（WQ）、上海（SH）、昆明（KM）和貴陽（GY）。具體采樣方法參考徐健等[3]、王金鵬等[4]的方法。

1.2 方法

1.2.1 DNA提取。

根據(jù)Promega試劑盒的方法提取基因組總DNA，具體方法參考徐健等[3]、王金鵬等[4]的方法。將提取的產(chǎn)物用2.0%的瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，并置于-20 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 PCR擴增。

利用GenBank數(shù)據(jù)庫查找小鼠TLR9基因序列，根據(jù)引物設(shè)計原則，利用Primer 5.0軟件設(shè)計TLR9基因引物。PCR體系及程序參考王金鵬等[4]的方法，退火溫度為58 ℃。

1.2.3 PCR擴增產(chǎn)物檢測。

取5 μL PCR擴增產(chǎn)物，在1.5%瓊脂糖凝膠（已加溴化乙錠-EB染色）中進行電泳檢測，將擴增效果好的PCR產(chǎn)物送至生工生物工程（上海）股份有限公司測序。

1.3 產(chǎn)物測序及序列分析

應(yīng)用軟件Chromas查看序列峰圖文件，選取可用片段，使用Seqman軟件進行序列剪切與拼接，通過BLAST檢測序列同源性，查看與GenBank數(shù)據(jù)庫中已有小鼠TLR9基因序列的相似度，利用ClustalX 1.83軟件進行比對與校正。利用MEGA 7.0和DnaSP 5.10軟件進行序列分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 目的基因提取及PCR擴增產(chǎn)物檢測結(jié)果 將提取的DNA進行2.0%的瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果見圖1。從圖1可見整齊清楚且明亮的條帶，說明DNA提取效果較好。

2.2 小鼠TLR9基因堿基含量分析

獲得的TLR9基因片段長度為1 030 bp，位于參與對病原體相關(guān)分子模式識別的LRR結(jié)構(gòu)域的編碼區(qū)。分析對各地理種群TLR9基因序列的堿基組成，結(jié)果見表1。由表1可知，小鼠TLR9基因片段A、T、C、G的平均含量分別為22.9%、22.2%、32.8%、22.0%，且C+G的堿基含量 （54.8%） 略高于A+T含量 （45.1%），各地理種群間堿基含量沒有明顯差異。

2.3 各地理種群間遺傳距離分析

基于小鼠TLR9基因序列，計算各地理種群間遺傳距離，結(jié)果見表2。由表2可知，各地理種群間的遺傳距離為0.000～0.012，各地理種群間除昆明 （KM） 小鼠外，其他地理種群間遺傳距離均較小。這表明各地理種群間小鼠TLR9基因的遺傳差異較小，該基因在進化過程中具有一定的保守性，這對于其功能的保守結(jié)構(gòu)具有重要意義。前人研究[3]發(fā)現(xiàn)，我國小鼠存在2條遷移路線，據(jù)此推測昆明地區(qū)小鼠起源于古印度，受地理環(huán)境及起源地的影響，使其與其他地理種群存在較小的遺傳差異。

2.4 小鼠TLR9基因遺傳多樣性分析

使用DnaSP軟件對各地理種群小鼠TLR9基因進行遺傳多樣性分析，結(jié)果見表3。由表3可知，各地理種群小鼠TLR9基因片段包含變異位點數(shù)2～11個，單倍型多樣性指數(shù)為0.154～0.905，核苷酸多樣性范圍為0.000 98～0.003 42，昆明地區(qū)的單倍型多樣性和核苷酸多樣性均最高。這表明這7個地理種群小鼠TLR9基因遺傳多樣性較低，與遺傳距離的結(jié)果相符，說明該基因進化相對保守。

2.5 系統(tǒng)發(fā)育樹分析

系統(tǒng)發(fā)育樹能反映物種進化關(guān)系，基于TLR9基因片段，以褐家鼠 TLR9基因 （NM_198131）為外群，構(gòu)建7個地理種群小鼠的系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果如圖3所示。從圖3可以看出，昆明地區(qū)小鼠單獨為一支，最先分離出來，其他地理種群聚為一個分支，這表明除昆明地區(qū)小鼠外，其他6個地理種群小鼠沒有明顯的分化現(xiàn)象。系統(tǒng)發(fā)育樹分析結(jié)果與此前研究結(jié)果相一致，而昆明地區(qū)相對于其他地區(qū)存在遺傳差異，需要進一步分析其遺傳結(jié)構(gòu)。

3 討論

近年來，隨著對多種動物相關(guān)免疫基因進化模式的研究，科學(xué)家們開始重視對野生動物TLRs 基因分子進化研究。病原微生物保守的分子結(jié)構(gòu)需要高度保守的免疫基因才可以發(fā)揮其特異性識別作用。筆者分析了我國7個地理種群小鼠TLR9基因遺傳多樣性，發(fā)現(xiàn)獲得的TLR9基因片段長度為1 030 bp，位于參與對病原體相關(guān)分子模式識別的LRR結(jié)構(gòu)域的編碼區(qū)，A、T、C、G的平均含量分別為22.9%、22.2%、

32.8%和22.0%，各地理種群間堿基含量沒有明顯差異。通過計算各地理種群間遺傳距離及核苷酸多樣性，發(fā)現(xiàn)這7個地理種群小鼠TLR9基因序列較為保守，并無明顯分化現(xiàn)象，以褐家鼠 （NM_198131） 作為外群構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，其結(jié)果與遺傳多樣性分析相一致。小鼠是生物學(xué)和生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域最常用的模式動物之一，從分子水平上探究我國小鼠群體TLR9基因的遺傳多樣性，能為揭示小鼠和病原微生物間的關(guān)系提供基礎(chǔ)性信息。但目前的研究數(shù)據(jù)較少，需要繼續(xù)補充全國范圍的小鼠TLR9基因序列，進一步探究我國小鼠TLR9基因的遺傳多樣性。

47卷10期冷冰霜等 7個地理種群小鼠TLR9基因的遺傳多樣性分析

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