細(xì)胞因子IL-6、TNF-α和循環(huán)腫瘤細(xì)胞在乳腺癌預(yù)后監(jiān)測中的臨床意義

鄒 麟，向 瑜，李秋錦

(重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院檢驗科，重慶 400016)

乳腺癌是發(fā)生在乳腺腺上皮組織的惡性腫瘤，是女性最常見的腫瘤之一,全球每年約40萬女性死于該病[1]。乳腺癌的發(fā)生和發(fā)展是內(nèi)分泌、免疫系統(tǒng)等諸多因素共同作用的結(jié)果，一般要經(jīng)歷從增生到非典型增生再到原位癌，最終發(fā)展為浸潤性癌[2]。目前手術(shù)仍是乳腺癌治療的主要手段，但是術(shù)后仍有將近60%患者發(fā)生復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移，而復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致乳腺癌患者預(yù)后差的主要原因[3]。因此提高乳腺癌患者術(shù)后生存期，對乳腺癌預(yù)后情況的判斷就尤為重要。

目前，臨床上用于監(jiān)測乳腺癌的預(yù)后指標(biāo)有很多，如原發(fā)腫瘤的大小、受侵腋窩淋巴結(jié)個數(shù)、腫瘤的組織學(xué)、雌激素受體(ER)及孕激素受體(PR)、Her-2基因的擴增、白細(xì)胞介素-6(IL-6)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、循環(huán)腫瘤細(xì)胞(CTC)等。

IL-6是由內(nèi)皮細(xì)胞和正常造血細(xì)胞等多種細(xì)胞產(chǎn)生的多效性細(xì)胞因子，具有促進(jìn)生長和抗凋亡的作用。已有研究證實，IL-6在腫瘤患者血清內(nèi)高度地表達(dá)并與患者預(yù)后較差相關(guān)[4]。TNF-α是一種具有抗腫瘤作用的細(xì)胞因子，其高水平的表達(dá)與乳腺癌的分級相關(guān)。CTC是指存在于外周血中的各類腫瘤細(xì)胞的統(tǒng)稱，它來源于原發(fā)腫瘤或轉(zhuǎn)移腫瘤，是獲得脫離基底膜的能力并入侵通過組織基質(zhì)進(jìn)入血管的腫瘤細(xì)胞，已有研究發(fā)現(xiàn)CTC是了解乳腺癌發(fā)病機制和監(jiān)測乳腺癌進(jìn)展及預(yù)后的指標(biāo)[5]。

本研究擬通過檢測乳腺癌患者手術(shù)前后血清內(nèi)IL-6、TNF-α水平及全血中CTC的表達(dá)數(shù)量，以確定其作為監(jiān)測乳腺癌患者預(yù)后指標(biāo)的臨床意義。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2014-2015年在本院乳腺外科接受手術(shù)治療的乳腺癌患者61例，年齡31～63歲，平均年齡43.8歲。所有病例均符合世界衛(wèi)生組織(WHO)乳腺癌的診斷標(biāo)準(zhǔn)，按照TNM臨床分期均為Ⅰ期。其中進(jìn)行免疫組化染色[免疫組化指標(biāo)包括人表皮生長因子受體Ⅱ型中分化群內(nèi)的基因蛋白(CerbB-2)、ER、PR、抑癌基因(P53)、腫瘤增殖抗原(Ki67)]38例。通過上述免疫組化指標(biāo)的陽性情況將38例乳腺癌患者分為全陽性組和非全陽性組。

1.2方法

1.2.1標(biāo)本采集 在61例乳腺癌患者手術(shù)前以及手術(shù)后(24 h內(nèi))分別抽取患者外周靜脈血2～3 mL用于細(xì)胞因子的檢測,另抽取患者外周靜脈血8～10 mL于加有防腐劑的CellSave血樣本儲存管中用于CTC的檢測。

1.2.2細(xì)胞因子水平的檢測 用IMMULITE 1000化學(xué)發(fā)光分析儀(西門子公司)及其試劑盒(化學(xué)發(fā)光法)測定血清樣本中IL-6和TNF-α水平，實驗方法按照說明書進(jìn)行。

1.2.3CTC檢測 用CellSearch檢測系統(tǒng)按照CellSearch循環(huán)上皮細(xì)胞檢測試劑盒(免疫磁顆粒細(xì)胞捕獲+熒光染色法，強生醫(yī)療器材有限公司)進(jìn)行全血中的上皮源性的CTC的計數(shù)檢測。將7.5 mL血樣從CellSave血樣本儲存管移入帶標(biāo)記的相應(yīng)15 mL錐形試管中。加入6.5 mL的稀釋緩沖液，蓋上錐形試管的蓋子，上下顛倒5次混合均勻。在吊籃式離心機中，以800 g的相對離心力離心樣本10 min，離心過程關(guān)閉制動器。將上述制備好的樣本放入CellTracksAutoPrep系統(tǒng)中，CellTracksAutoPrep系統(tǒng)處理后的樣本轉(zhuǎn)移到樣本盒中，然后用CellTracks Analyzer分析儀進(jìn)行分析。上皮細(xì)胞(CK-PE)特殊熒光試劑以及白細(xì)胞(CD45+)核染劑用于電腦制造細(xì)胞圖像，當(dāng)形態(tài)學(xué)特征中包括腫瘤細(xì)胞特征并顯示出顯型EpCAM+,CK-PE+,DAPI+和CD45-時，圖像被分類為CTC。報告檢測的結(jié)果為：CTC的數(shù)目/7.5 mL的血液。

1.2.4免疫組化染色 免疫組化采用鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶連結(jié)(SP)法，CerbB-2、ER、PR、Ki67試劑盒購自Ventana Medical Systems,Inc.，p53試劑盒購自福建邁新生物技術(shù)有限公司，按試劑盒操作步驟進(jìn)行。以PBS取代一抗作為陰性對照，已知的CerbB-2、ER、PR、P53、Ki67陽性乳腺癌切片作為陽性對照。

1.3免疫組化染色結(jié)果及判定 ER、PR、P53、Ki67顯色在細(xì)胞核內(nèi)呈現(xiàn)為棕色或棕黃色顆粒，CerbB-2則以胞漿和胞膜呈棕黃色為陽性。根據(jù)染色數(shù)量和染色強度綜合判斷，陽性細(xì)胞數(shù)低于10%為陰性，陽性細(xì)胞數(shù)高于10%為陽性。

1.4統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，數(shù)據(jù)為偏態(tài)分布，結(jié)果以M(P25、P75)表示。組間比較采用Wilcoxon(Mann-WhitneyU)檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1手術(shù)前后IL-6、TNF-α水平及CTC的數(shù)量比較 IL-6在術(shù)后水平升高，手術(shù)前后血清中IL-6水平差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，而TNF-α水平及CTC的數(shù)量的差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見表1。

表1 IL-6、TNF-α表達(dá)水平及CTC的數(shù)量在手術(shù)

2.2各免疫組化指標(biāo)陽性率分析 61例乳腺癌患者中，進(jìn)行免疫組化染色患者共計38例，其中CerbB-2陽性患者33例，陽性率87%；ER陽性患者27例，陽性率71%；PR陽性患者21例，陽性率55%，P53陽性患者21例，陽性率55%；Ki67>20% 20例，陽性率52%(Ki67>20%為高增殖活性，表中Ki67>20%即為Ki67陽性)。見表2。

表2 各免疫組化指標(biāo)陽性率

2.3全陽性組/非全陽性組術(shù)前及術(shù)后IL-6、TNF-α水平及CTC數(shù)量比較 以免疫組化指標(biāo)CerbB-2、ER、PR、P53、Ki67對38例乳腺癌患者進(jìn)行分組，全陽性的11例患者為全陽性組，其余27例患者為非全陽性組，分別對手術(shù)前后免疫組化指標(biāo)全陽性組和非全陽性組IL-6、TNF-α表達(dá)水平及CTC的數(shù)量進(jìn)行比較。術(shù)前兩組IL-6、TNF-α表達(dá)水平及CTC的數(shù)量的差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，術(shù)后IL-6的表達(dá)水平在全陽性組表達(dá)升高，兩組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，而TNF-α表達(dá)水平及CTC的數(shù)量在兩組中的差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見表3、4。

表3 術(shù)前IL-6、TNF-α表達(dá)水平及CTC的數(shù)量

表4 術(shù)后IL-6、TNF-α表達(dá)水平及CTC的數(shù)量

3 討 論

近年來乳腺癌發(fā)病率有升高趨勢，病死率居女性惡性腫瘤第2位,女性的身心健康受到嚴(yán)重威脅[6]。目前認(rèn)為乳腺癌是由環(huán)境和遺傳等多種因素共同作用而導(dǎo)致的一種復(fù)雜疾病，但其發(fā)生、發(fā)展的機制仍不清楚，因此受到了臨床的高度關(guān)注。盡管乳腺癌可早發(fā)現(xiàn)、早診斷、早治療，包括手術(shù)、化療、放療、內(nèi)分泌治療及生物靶向治療等，但仍有10%～15%的乳腺癌患者在手術(shù)后的2年內(nèi)進(jìn)展為晚期乳腺癌，5年生存率為21%[7]。乳腺癌術(shù)后一旦發(fā)生轉(zhuǎn)移，將不可治愈，因此尋找乳腺癌的預(yù)后監(jiān)測指標(biāo)至關(guān)重要。

目前用傳統(tǒng)的影像診斷、血清腫瘤標(biāo)記物檢查等方法來判斷乳腺癌的預(yù)后，存在對微小轉(zhuǎn)移灶的早期檢出率低等缺點，而CTC可以早期發(fā)現(xiàn)微小轉(zhuǎn)移灶[8]。腫瘤的轉(zhuǎn)移程度與CTC陽性檢測呈正相關(guān)，治療前檢測CTC結(jié)果為陽性預(yù)示轉(zhuǎn)移性乳腺癌患者預(yù)后不良[9]。在本實驗中，術(shù)前組CTC個數(shù)平均數(shù)為1，術(shù)后組CTC個數(shù)平均數(shù)為2，兩組進(jìn)行比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。而CRISTOFANILI等[10]利用CellSearch系統(tǒng)對177例轉(zhuǎn)移性乳腺癌患者進(jìn)行了前瞻性研究，發(fā)現(xiàn)治療前有CTC的患者無病進(jìn)展生存期和總生存期均縮短。IGNATIADIS等[11]檢測444例乳腺癌患者外周血CTC并進(jìn)行了隨訪，中位時間為53.5個月，結(jié)果顯示與CTC陰性患者相比，CTC陽性患者的局部復(fù)發(fā)率和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移率顯著升高，而無病生存期以及總生存期顯著縮短。本研究標(biāo)本采集時間分別為術(shù)前24 h和術(shù)后24 h，CTC在外周血中的播散及消失是一個較長的過程，需要更長的時間，在術(shù)前、術(shù)后24 h內(nèi)并沒有顯著的變化。本研究只針對患者手術(shù)前后的CTC的數(shù)量進(jìn)行分析，并沒有在手術(shù)后對患者進(jìn)行隨訪，沒有了解到患者術(shù)后的轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)情況，不能對術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的患者及預(yù)后良好的患者CTC個數(shù)進(jìn)行比較分析，所以后續(xù)實驗需要跟進(jìn)了解患者術(shù)后的預(yù)后情況，從而做出更全面的判斷。

乳腺癌的形成是一個復(fù)雜的過程，包括細(xì)胞增殖分化侵襲、凋亡的紊亂、腫瘤基質(zhì)和腫瘤周圍血管及腫瘤微環(huán)境形成等多個方面，而這些方面又受到各種因子的調(diào)控，其中細(xì)胞因子起到了非常重要的作用。有文獻(xiàn)報道腫瘤手術(shù)后大量炎癥細(xì)胞因子釋放，促進(jìn)組織損傷修復(fù)，同時也是腫瘤復(fù)發(fā)的風(fēng)險因素[12]。IL-6是主要由淋巴細(xì)胞、激活的巨噬細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生，可促進(jìn)炎癥介質(zhì)釋放，它既能調(diào)節(jié)T淋巴細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞和單核-巨噬細(xì)胞的免疫活性，又參與某些免疫病理的發(fā)生[13]。TNF-α是由單核巨噬細(xì)胞所產(chǎn)生的參與多種生理和免疫過程的重要介質(zhì)。作為炎癥環(huán)境的中心調(diào)節(jié)因子，之前的研究認(rèn)為TNF-α可直接進(jìn)入腫瘤殺死癌細(xì)胞，但近年來不少的研究認(rèn)為腫瘤微環(huán)境中TNF-α的長期表達(dá)可導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞進(jìn)一步惡化[14]。TNF-α促進(jìn)上皮細(xì)胞類型的乳腺癌細(xì)胞轉(zhuǎn)為間充質(zhì)干細(xì)胞類型，增強了入侵性和轉(zhuǎn)移性。因此，細(xì)胞因子IL-6和TNF-α與乳腺癌預(yù)后相關(guān)。

本研究結(jié)果顯示，IL-6水平：術(shù)前組為2.0(2.0，2.5)，術(shù)后組為8.5(5.4，13.6)，術(shù)后組IL-6的表達(dá)水平升高，兩組比較，IL-6的表達(dá)差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)?；颊呤中g(shù)后IL-6水平顯著高于術(shù)前，則提示患者可能預(yù)后差。已有文獻(xiàn)證實IL-6與乳腺癌臨床分期、轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)相關(guān)[15]。PIERCE等[16]研究證實：血清中的炎癥因子不僅為沒有發(fā)生復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的乳腺癌患者提供早期的疾病復(fù)發(fā)風(fēng)險的信息，還可以為評估乳腺癌復(fù)發(fā)風(fēng)險提供新的策略。他們的研究結(jié)果與本研究相符。已有文獻(xiàn)報道，免疫組化指標(biāo)CerbB-2、ER、PR、P53、Ki67與乳腺癌的預(yù)后有關(guān)，這些指標(biāo)陽性提示患者預(yù)后差[17-20]。在患者術(shù)后，全陽性組IL-6水平為16.5(10.2，20.7)，非全陽性組IL-6水平為7.2(4.4，10.7)，全陽組IL-6的表達(dá)水平升高，兩組比較，IL-6表達(dá)差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。全陽性組IL-6水平明顯高于非全陽性組，而免疫組化指標(biāo)全陽性組預(yù)后不良，因此患者術(shù)后血清中IL-6水平高可能與患者預(yù)后差相關(guān)。

在體內(nèi)，腫瘤細(xì)胞內(nèi)源性TNF-α通過誘導(dǎo)惡性乳腺上皮細(xì)胞等腫瘤細(xì)胞增殖，并促進(jìn)血管再生、腫瘤細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移等從而促進(jìn)腫瘤發(fā)展[21]。TNF-α可作為腫瘤復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的重要標(biāo)記物并且能鑒定腫瘤預(yù)后。本研究結(jié)果是：術(shù)前組TNF-α水平為5.7(4.6，7.2)，術(shù)后組為5.2(4.6，7.3)，兩組TNF-α表達(dá)水平比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。因此本研究無法確定TNF-α水平是否可作為乳腺癌預(yù)后監(jiān)測的指標(biāo)。上述文獻(xiàn)中所選研究對象有近300例，而本研究對象為61例，不能完整反映TNF-α水平變化情況。后續(xù)實驗需要對患者進(jìn)行隨訪，了解其預(yù)后情況，并對其血清中TNF-α水平進(jìn)行監(jiān)測，從而更全面了解TNF-α在乳腺癌患者預(yù)后監(jiān)測中的作用。

4 結(jié) 論

乳腺癌患者手術(shù)后血清中IL-6水平顯著高于手術(shù)前，并且免疫指標(biāo)CerbB-2、ER、PR、P53、Ki67全陽性患者的血清中IL-6水平顯著高于非全陽性組。因此，乳腺癌患者血清中IL-6的高水平與乳腺癌預(yù)后差相關(guān)。