豁痰解毒通絡(luò)飲干預(yù)IRE1α/XBP1信號通路參與球囊損傷后兔頸動脈再狹窄的機(jī)制研究

單斯嘉，鄧 悅，于克英，孫哲宇，石 銳

針對治療冠狀動脈粥樣硬化性心臟病所推出的經(jīng)皮冠狀動脈腔內(nèi)成形術(shù)(PTCA)具有劃時代的意義，而支架內(nèi)再狹窄(in-stent restenosis， ISR)問題也是近年來的研究熱點。炎癥反應(yīng)最終造成了內(nèi)皮細(xì)胞損傷，進(jìn)而引起動脈粥樣硬化斑塊(atherosclerosis， AS)。相關(guān)文獻(xiàn)已經(jīng)證明，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(endoplasmicreticulum stress， ERS)有可能通過其偶聯(lián)的炎癥反應(yīng)和細(xì)胞凋亡的作用參與新生內(nèi)膜形成，在ISR的病理過程中起著重要的作用，并貫穿AS發(fā)展的整個過程[1]。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)位于各種真核細(xì)胞中(除哺乳動物的成熟紅細(xì)胞)，其功能是蛋白質(zhì)的合成、加工、轉(zhuǎn)運、調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度等，當(dāng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)穩(wěn)態(tài)遭到破壞后，會產(chǎn)生ERS。ERS是細(xì)胞在感受到自身調(diào)節(jié)機(jī)制失衡時的一種自我保護(hù)，ERS短時間可以增加細(xì)胞抵抗應(yīng)激的功能，可以維持內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的穩(wěn)態(tài)平衡，然而長時間的劇烈ERS可破壞細(xì)胞功能，導(dǎo)致細(xì)胞無法調(diào)節(jié)其自身機(jī)制并最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。根據(jù)研究發(fā)現(xiàn)，通過控制ERS 也許是打開治療AS的一個新的思路[2]。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)將會通過3種信號通路引起ERS：未折疊蛋白反應(yīng)(unfolded protein response， UPR)，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)超負(fù)荷反應(yīng)(endoplasmicreticulum-overloaded response，EOR)和固醇調(diào)節(jié)級聯(lián)反應(yīng)(sterol regulatory element binding protein，SREBP)。其中UPR通路是最保守最為清楚的通路。UPR激活蛋白激酶R樣內(nèi)質(zhì)網(wǎng)激酶(PERK)、肌醇需求酶1( inosito-l requring enzyme1， IRE-1)和活化轉(zhuǎn)錄因子6(activating transcription factor 6，ATF6)3條信號通路。這三者都是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)跨膜蛋白。IRE-1被激活后具有核糖核酸內(nèi)切酶活性， 在胞漿中剪切的X盒結(jié)合蛋白1(X-box-binding protein-1，XBP1)mRNA， 編碼具有轉(zhuǎn)錄活化域的蛋白， 誘導(dǎo)大量ERS反應(yīng)的基因表達(dá)， 幫助細(xì)胞解除ERS[3]。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為AS病機(jī)為本虛標(biāo)實，痰濁、瘀血及外邪是AS的關(guān)鍵病理因素，國醫(yī)大師任繼學(xué)教授提出“伏邪即隱藏于人體之虛處”，提出以“伏邪內(nèi)藏，毒損脈絡(luò)”為中心的學(xué)說，而痰瘀伏絡(luò)、日久不愈、蘊(yùn)結(jié)成毒是ISR的關(guān)鍵病機(jī)[4]。根據(jù)此病機(jī)創(chuàng)立的以“益氣化瘀，豁痰通絡(luò)”為治則的豁痰解毒通絡(luò)飲在臨床上收到了很好的療效，但具體作用機(jī)制尚未完全明確。本研究旨在通過建立球囊損傷后兔頸動脈再狹窄模型，探討豁痰解毒通絡(luò)方是否與干預(yù)IRE1α/XBP1通路相關(guān)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物 日本雄性大耳白兔共24只，3～4月齡，體重1.8～2.2 kg，分籠飼養(yǎng)于中國中醫(yī)科學(xué)院基礎(chǔ)理論研究所清潔級動物房。大耳白兔由北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司提供，許可證號為SCXK(京)2015-0001。兔飼料由科奧協(xié)力有限公司提供，許可證號為SCXK(京)2014-0010，生產(chǎn)批號：GDAF161217。每只實驗兔每天給予120 g飼料1次。

1.1.2 藥品 豁痰解毒通絡(luò)飲，由金銀花、水蛭、甘松、當(dāng)歸等藥物組成。生藥由長春中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院藥劑科供給，生藥濃度為2.3 g/mL。阿托伐他汀每片20 mg，由輝瑞制藥有限公司生產(chǎn)，生產(chǎn)批號：S90893，批準(zhǔn)文號：國藥準(zhǔn)字：H20051408。

1.1.3 主要儀器和試劑 PTCA球囊導(dǎo)管(2.5 mm×20 mm，美國Medtronic公司)；戊巴比妥鈉由北京化學(xué)試劑公司進(jìn)口分裝；青霉素鈉：華北制藥股份有限公司，8×105U/瓶；低分子肝素鈉(吉派林)：杭州九源基因工程有限公司；耗材：血清管，枸櫞酸鈉抗凝管，1.5 mL EP管，一次性采血針頭，槍頭，2#縫合線，2 mL無菌注射器， 5 mL無菌注射器。

1.2 實驗方法

1.2.1 動物模型制備 將實驗兔24只分為4組：假手術(shù)組、模型組、中藥組(豁痰解毒通絡(luò)組)、西藥組(阿托伐他汀組)，每組6只。4組兔適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d。頸動脈球囊損傷方法：手術(shù)前1 h皮下注射低分子肝素0.1 mL/kg可預(yù)防急性血栓形成。麻醉，3%戊巴比妥鈉1 mL/kg，耳緣靜脈給藥。頸部備皮、消毒，從氣管正中線切開皮膚，并將頸總動脈直接向遠(yuǎn)心端鈍性分離，在頸外動脈0.8～1.2 cm處結(jié)扎一條線，分離頸內(nèi)動脈，在距離分叉處約3 mm結(jié)扎一活結(jié)。在頸總動脈纏雙繞線，準(zhǔn)備解繞后用動脈夾夾閉頸總動脈，使用虹膜剪，在頸外動脈剪一小口，插入球囊導(dǎo)管，長度8 cm，球囊加壓至7個大氣壓，原位擴(kuò)張3次，撤出球囊，結(jié)扎頸外動脈近心端。將傷口縫合并消毒，術(shù)后連續(xù)3 d肌內(nèi)注射青霉素8×105U及皮下注射吉派林0.1 mL/kg。

1.2.2 給藥 術(shù)后第2天連續(xù)灌胃28 d。假手術(shù)組、模型組灌胃等量蒸餾水，中藥組用量為6.67 g/kg，西藥組為1.42 mg/kg。每日1次，28 d后取材。

1.3 HE染色 用鹽水清洗頸總動脈組織，將其固定在4%多聚甲醛中，固定在包埋盒中，并在流水中漂洗30 min。將其在乙醇中脫水，再置于二甲苯中透明，浸蠟包埋。切片后烘干。用二甲苯脫蠟后，乙醇水化，用蘇木素及伊紅染色，用75%乙醇脫水，透明，用中性樹膠封片，完成染色。

1.4 Westernblot法檢測兔頸動脈IRE1α、XBP1蛋白含量 通過加入液氮研磨組織后，用裂解緩沖液提取蛋白質(zhì)以測定純度和濃度，采用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳1.5 h，轉(zhuǎn)膜為45 m，封閉用3%脫脂奶粉，TBST洗4次，敷一抗過夜后回收一抗，然后TBST洗4次，敷二抗1 h，TBST洗3次后加顯色劑至顯色。用Image J檢測灰度值。SPSS 19.0統(tǒng)計數(shù)據(jù)。

1.5 qPCR測定IRE1α/XBP1的mRNA的表達(dá) 用Trizol試劑盒說明，按步驟提取組織中的RNA，Bio-spec測定濃度和純度。重復(fù)3次，樣品濃度在1.8～2.0。IRE1α引物(5′-cca gca cca gca gtt cca gaa g-3′；5′-tgc agg cat cca gga ggt cag-3′)。XBP1引物(5′-tgg tta ctg agg cag agg-3′；5′-gaa gag tca gtg ccg tca gaa tcc-3′)。β-actin引物(5′-ggc atg gag tcg tgt ggc atc-3′； 5′-cgt gtt ggc gta cag gtc ctt g-3′)。按照Takara逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和PCR試劑盒進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄和qPCR反應(yīng)。反應(yīng)結(jié)束后通過確認(rèn)qPCR的擴(kuò)增曲線和溶解曲線，記錄各指標(biāo)Cq值，SPSS 19.0統(tǒng)計各組數(shù)據(jù)。

2 結(jié) 果

2.1 HE染色結(jié)果 假手術(shù)組內(nèi)膜連續(xù)、完整，無增生，無狹窄。模型組較假手術(shù)組血管內(nèi)皮下新生內(nèi)膜明顯增厚，管腔狹窄，外膜增生伴炎細(xì)胞浸潤。中藥組和西藥組與模型組相比內(nèi)膜增生相對減少，管腔狹窄程度減低。詳見圖1。

圖1 HE染色檢測兔頸動脈病理改變(40×)

2.2 豁痰解毒通絡(luò)飲對IRE1α/XBP1的蛋白表達(dá)影響 結(jié)果顯示，與假手術(shù)組相比，模型組IRE1α，XBP1的mRNA含量顯著增加(P<0.05)。與模型組相比，中藥組及西藥組干預(yù)后，其mRNA含量顯著降低(P<0.05)。詳見圖2、表1。

A為假手術(shù)組；B為模型組；C為中藥組；D為西藥組圖2 兔頸動脈中IRE1α、XBP1的蛋白表達(dá)電泳圖

表1 兔頸動脈中IRE1α、XBP1的蛋白表達(dá)比較(±s)

與假手術(shù)組比較，1)P<0.05；與模型組比較，2)P<0.05

2.3 豁痰解毒通絡(luò)飲對IRE1α、XBP1的mRNA表達(dá)影響 qPCR結(jié)果顯示，與假手術(shù)組相比，模型組IRE1α的mRNA含量顯著增加(P<0.05)，與模型組相比，中藥組及西藥組干預(yù)后，其mRNA含量顯著降低(P<0.05)，但中藥組與西藥組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。XBP1趨勢與IRE1α相同，模型組與假手術(shù)組相比，mRNA含量顯著增加，兩組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，而中藥組與西藥組均較模型組顯著降低(P<0.05)。詳見表2。

表2 兔頸動脈中IRE1α、XBP1的mRNA表達(dá)情況(±s)

與假手術(shù)組比較，1)P<0.05；與模型組比較，2)P<0.05

3 討 論

冠心病介入術(shù)推出后大大降低了冠狀動脈粥樣硬化性心臟病的死亡率，但PTCA術(shù)后ISR的發(fā)生率為30%～50%[5]，再狹窄的發(fā)生原因有許多，如炎癥反應(yīng)、內(nèi)皮細(xì)胞功能受損、腎素-血管緊張素系統(tǒng)過度激活、多因子作用都有可能是導(dǎo)致ISR發(fā)生[6]。在再狹窄的過程中，ERS起到了重要的作用。ERS初始時，首先啟動的是UPR途徑，UPR共有3種通路介導(dǎo)：ATF6、PERK、IRE1。其中IRE1α是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的一種固有蛋白，它同時具有蛋白激酶和核糖核酸內(nèi)切酶活性。IRE1α通過其核酸內(nèi)切酶活性產(chǎn)生含有b-ZIP結(jié)構(gòu)域有活性的轉(zhuǎn)錄因子XBP1，激活I(lǐng)RE1-XBP1信號通路，IRE1-XBP1是UPR通路中最保守的通路，在ERS應(yīng)激中發(fā)揮著非常重要的作用。而XBP1作為IRE1α的間接產(chǎn)物，是一種重要的反式作用因子，可調(diào)控大量的基因表達(dá)，從而緩解ERS應(yīng)激，維持內(nèi)質(zhì)網(wǎng)穩(wěn)態(tài)。有眾多研究表明XBP1在AS發(fā)生過程中起著重要的作用[7]。

冠狀動脈粥樣硬化性心臟病屬于中醫(yī)學(xué)“胸痹”“心痛”的范疇，治療時不僅要針對胸痹之脈絡(luò)瘀阻，也要著眼于整體。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為，導(dǎo)致ISR的關(guān)鍵在于虛、瘀和熱毒。虛即正氣虧虛，PTCA術(shù)后再狹窄的病機(jī)是本虛標(biāo)實，本虛以氣虛為主，標(biāo)實以痰濁，瘀血為主。在治療的早期階段，應(yīng)該活血化瘀、清熱解毒，并在后期進(jìn)行辨證分型、補(bǔ)正養(yǎng)陰[8]。同時，血瘀也是該病的重要原因。血瘀的成因可以是寒凝、氣滯、陽虛、氣陰兩虛或者痰瘀互結(jié)。大量研究表明，PTCA還會在冠狀動脈狹窄期間損害血管內(nèi)膜，導(dǎo)致血液瘀滯[9]。因此，介入后有必要加強(qiáng)活血化瘀、祛痰通絡(luò)、降脂和抗血小板藥物的治療。導(dǎo)致ISR的另一個重要發(fā)病機(jī)制是痰阻心脈，痰瘀既是血瘀證的病理產(chǎn)物又是其病因?；钛龅闹畏ㄊ侵委煿谛牟〉囊话阋?guī)律，但治療期間也必須考慮痰濕的因素，在活血化瘀的基礎(chǔ)上需要兼顧祛痰濁、利水濕，才能夠取得更好的療效[10]。鄧悅教授根據(jù)多年的臨床經(jīng)驗，認(rèn)為此病病位在絡(luò)脈，為本虛標(biāo)實之證。同時強(qiáng)調(diào)伏邪理論在心病治療中的重要價值。心系疾病早在出現(xiàn)癥狀前就以伏邪的形式存在[11]，并以痰瘀伏絡(luò)、蘊(yùn)結(jié)成毒為病機(jī)關(guān)鍵。鄧悅教授在此基礎(chǔ)上提出了“PTCA 術(shù)后再狹窄與痰瘀伏絡(luò)-內(nèi)癰相關(guān)”“豁痰解毒通絡(luò)方藥為其主要干預(yù)途徑”的科學(xué)研究假說?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，豁痰解毒通絡(luò)飲中的主要藥物中，金銀花有解熱抗炎，抗菌抗病毒的功效；瓜蔞可增加冠狀動脈血流量，保護(hù)缺血心肌，促進(jìn)微循環(huán)，增加缺氧耐受性、抗凝血和降低血清膽固醇，抗菌等多種活性；水蛭具有抗凝血、抗血栓、抗炎、抗纖維化的作用[12-15]。

本研究觀察豁痰解毒通絡(luò)飲對PTCA術(shù)后兔頸動脈內(nèi)膜再狹窄的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，豁痰解毒通絡(luò)飲可顯著降低頸動脈內(nèi)皮增生面積，改善血管炎癥反應(yīng)，緩解頸動脈內(nèi)膜狹窄，且效果優(yōu)于西藥組。同時可下調(diào)IRE1α、XBP1的蛋白以及mRNA的表達(dá)。說明豁痰解毒通絡(luò)飲有可能通過IRE1α-XBP1通路抑制動脈內(nèi)膜的增生。這為中藥治療PTCA后ISR的臨床應(yīng)用提供了理論依據(jù)，為探討中藥復(fù)方干預(yù)ISR的作用機(jī)制奠定了理論基礎(chǔ)。