沉默S100A4基因?qū)θ橄侔┥掀らg質(zhì)轉(zhuǎn)換的影響

李麗春，陳 瑤，付 梅，何 謙

乳腺癌是最常見的女性惡性腫瘤之一[1]，近幾年其在診斷和治療方式上都有一定的進(jìn)展，但是其5年生存期仍然較低，主要原因是其發(fā)生轉(zhuǎn)移[2]。上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)換（EMT）在細(xì)胞分化過程中發(fā)揮著重要的作用，近年來在腫瘤的演進(jìn)中受到關(guān)注，并且認(rèn)為其是導(dǎo)致腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移的主要機(jī)制之一[3]。有文獻(xiàn)報(bào)道，其參與乳腺癌的侵襲和轉(zhuǎn)移[4]。EMT過程中，上皮細(xì)胞標(biāo)志物E-cadherin下降，間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物N-cadherin上調(diào)，導(dǎo)致細(xì)胞獲得一定的運(yùn)動(dòng)能力[5]，同時(shí)Slug、Snail作為轉(zhuǎn)錄因子也參與EMT過程[6]。S100A4基因定位于1號(hào)染色體長(zhǎng)臂2區(qū)1帶，其表達(dá)的蛋白是鈣結(jié)合蛋白S100家族的主要成員之一，其主要功能是調(diào)節(jié)細(xì)胞粘附能力。有研究報(bào)道，S100A4在乳腺癌、胃癌、鼻咽癌、甲狀腺癌、膀胱癌等腫瘤組織中高表達(dá)[7-8]。有文獻(xiàn)提示，S100A4可能也參與與乳腺癌的侵襲和轉(zhuǎn)移，并且與乳腺癌的臨床病理參數(shù)以及預(yù)后相關(guān)，但S100A4是否是通過調(diào)節(jié)EMT過程進(jìn)而影響乳腺癌的臨床病理變化及預(yù)后[9]，目前尚未完全清楚。因此，本實(shí)驗(yàn)研究了沉默S100A4基因?qū)θ橄侔〦MT過程的影響，為進(jìn)一步闡明乳腺癌的發(fā)病機(jī)制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與設(shè)備 MCF-7和MDA-MB-231細(xì)胞購(gòu)自上海生物制品研究所；S100A4和非特異性陰性對(duì)照序列的siRNA購(gòu)自上海生博生物醫(yī)藥科技有限公司；胎牛血清和青、鏈霉素溶液、DMEM購(gòu)自美國(guó) Gibco公司，TRIzol和 RT試劑盒購(gòu)自大連TaKaRa公司，SYBR Green PCR混合液購(gòu)自美國(guó)Life technology公司，BCA蛋白濃度檢測(cè)試劑盒、RIPA細(xì)胞裂解液裂解均購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司。所用引物由武漢金開瑞生物工程有限公司合成，Lipoctamine2000購(gòu)自美國(guó) Thermo Fisher Scientific公司 ，實(shí)驗(yàn)所用一抗（β-actin，Slug，N-cadherin，S100A4和Snail）均購(gòu)自美國(guó)Cell Signaling Technology公司，E-cadherin購(gòu)自美國(guó)Abcam公司，抗兔 IgG(H+L)、 抗鼠 IgG(H+L)、Super ECL Plus Western Blotting Substrate化學(xué)發(fā)光顯影液、DEPC水均購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；凝膠圖像分析系統(tǒng)和PCR儀均購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad公司。

1.2 細(xì)胞與組織標(biāo)本 MCF-7和MDA-MB-231細(xì)胞于 37℃、5%CO2、95%大氣條件下培養(yǎng)，每2 d更換一次培養(yǎng)基。本實(shí)驗(yàn)所用細(xì)胞均處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。

組織樣本來自醫(yī)院乳腺外科收治的4例乳腺癌患者，均經(jīng)3位病理醫(yī)生診斷，組織學(xué)類型均為原發(fā)浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌。腫瘤組織和正常組織標(biāo)本分別取自瘤體和距離瘤體2 cm外正常乳腺組織。本研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)，所有參與研究的患者知曉本研究并簽署了知情同意書。

1.3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染和分組 將S100A4和非特異性陰性對(duì)照序列的siRNA分別轉(zhuǎn)染至人乳腺癌MCF-7和MDA-MB-231細(xì)胞，分別作為S100A4基因沉默組（基因沉默組）和陰性對(duì)照組，轉(zhuǎn)染步驟按脂質(zhì)體Lipoctamine2000說明書操作。

1.4 Western blot實(shí)驗(yàn) Western blot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)S100A4蛋白在人乳腺癌組織樣本中的表達(dá)水平以及 S100A4、N-cadherin、E-cadherin、Slug、Snail 蛋 白在基因沉默組和陰性對(duì)照組中的表達(dá)水平。方法概述如下：轉(zhuǎn)染了siRAN和陰性對(duì)照的細(xì)胞或者新鮮組織收集于1.5 ml的EP管中，用RIPA細(xì)胞裂解液裂解，BCA方法測(cè)量蛋白濃度。實(shí)驗(yàn)的蛋白樣本用RIPA調(diào)整至相同的濃度，蛋白樣品上樣電泳2 h后轉(zhuǎn)膜，用含5%脫脂奶粉封閉液封閉2 h，一抗孵育過夜(4℃)；次日用TBST浸洗1 h，然后用對(duì)應(yīng)的二抗孵育 2 h，TBST浸洗 45 min，最后用 Super ECL Plus Western Blotting Substrate化學(xué)發(fā)光顯影液顯影。

1.5 RT-PCR 檢測(cè)S100A4基因在人乳腺癌組織樣本中的表達(dá)水平以及 S100A4、N-cadherin、E-cadherin、Slug、Snail基因在 S100A4 基因沉默組（沉默組）和陰性對(duì)照組（對(duì)照組）中的表達(dá)水平。方法概述如下：采用TRIzol法提取組織樣本或者細(xì)胞mRNA，按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進(jìn)行RNA逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)合成cDNA。反應(yīng)體系如下：2 μg的mRNA加8 μl的5×primeScript mix緩沖液，然后用DEPC水補(bǔ)充至40 μl。然后進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR，方法參照RT試劑盒和SYBR Green PCR試劑盒說明書。各組基因表達(dá)的相對(duì)差異用循環(huán)數(shù)(ct)表示，每個(gè)樣品的ct值用B-actin進(jìn)行校正，

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用PASW Statistics統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，Graghpad Prism 6.2軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)圖制作。計(jì)量數(shù)據(jù)以±s表示，多組比較時(shí)行方差分析法，兩組比較行獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 S100A4基因和蛋白在乳腺組織中的表達(dá)水平比較 Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，S100A4蛋白在乳腺癌組織中表達(dá)明顯上調(diào)(表 1)；RT-PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，S100A4基因在乳腺癌組織中表達(dá)明顯上調(diào)（表 2）。

表1 S100A4蛋白在乳腺癌組織及正常組織表達(dá)比較

2.2 S100A4基因和蛋白在轉(zhuǎn)染siRNA乳腺細(xì)胞中的表達(dá)水平比較 Western blot實(shí)驗(yàn)分析顯示，乳腺癌細(xì)胞轉(zhuǎn)染siRNA后，S100A4蛋白表達(dá)水平下調(diào)(MCF-7 細(xì)胞：（104.1±11.36）vs（61.61±9.96）；MDA-MB-231 細(xì)胞：（185.23±10.54）vs（136.78±9.32)；RT-PCR實(shí)驗(yàn)也顯示，乳腺癌細(xì)胞轉(zhuǎn)染siRNA后，S100A4基因表達(dá)水平降低(MCF-7 細(xì)胞：（31.87±0.15）vs（23.11±0.65）；MDA-MB-231 細(xì)胞：（26.61±0.03）vs（20.52±0.09）。

表2 S100A4基因在乳腺癌組織及正常組織表達(dá)比較

2.3 基因沉默組與陰性對(duì)照組EMT相關(guān)蛋白和基因表達(dá)水平比較 Western blot（表3）和 RT-PCR（表 4）實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，N-cadherin、Snail、Slug 蛋白和基因表達(dá)水平在基因沉默組明顯降低，而E-cadherin明顯上調(diào)。

3 討論

乳腺癌是發(fā)生于女性群體中最常見的惡性腫瘤之一。腫瘤侵襲至周圍組織和發(fā)生轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致乳腺癌患者預(yù)后差的主要因素之一。有文獻(xiàn)報(bào)道，S100家族參與調(diào)節(jié)多種腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移[10-11]。本實(shí)驗(yàn)證明，S100家族的重要的成員之一S100A4在乳腺癌組織中的表達(dá)明顯上調(diào)，與Wang等[11]的報(bào)道一致。提示S100A4可能參與乳腺癌的生物學(xué)行為的調(diào)節(jié)。EMT參與結(jié)直腸癌、乳腺癌、卵巢癌等多種腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移。有文獻(xiàn)報(bào)道，S100A4參與調(diào)節(jié)人卵巢癌[12]、胰腺癌[13]、肝細(xì)胞肝癌[14]等的 EMT過程。EMT過程中，上皮細(xì)胞相關(guān)標(biāo)志物E-cadherin明顯下調(diào)，間質(zhì)相關(guān)標(biāo)志物N-cadherin明顯上調(diào)，Snail和Slug是參與調(diào)節(jié)EMT過程的重要的轉(zhuǎn)錄因子。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，沉默S100A4的乳腺癌細(xì)胞能上調(diào)E-cadherin表達(dá)水平，下調(diào)N-cadherin、Snail和Slug的表達(dá)，提示S100A4參與調(diào)節(jié)EMT過程。有文獻(xiàn)報(bào)道，敲低S100A4能抑制Src-FAK信號(hào)通路的激活[15]，此信號(hào)通路的激活能促進(jìn)EMT[16-17]。Xu等[13]報(bào)道，S100A4通過調(diào)節(jié)Shh-Gli1信號(hào)通路，進(jìn)而參與EMT的調(diào)節(jié)。故推測(cè)在人乳腺癌中，S100A4通過激活Src-FAK或者Shh-Gli1信號(hào)通路，進(jìn)而激活EMT過程。Rudland等[18]報(bào)道，S100A4與乳腺癌患者的預(yù)后呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)。本實(shí)驗(yàn)證明，S100A4參與調(diào)節(jié)乳腺癌的EMT過程，而EMT是導(dǎo)致患者發(fā)生轉(zhuǎn)移的主要機(jī)制之一，推測(cè)S100A4可能上調(diào)EMT過程，導(dǎo)致乳腺癌患者發(fā)生轉(zhuǎn)移，進(jìn)而影響患者的預(yù)后。

表3 沉默組與對(duì)照組EMT 相關(guān)蛋白表達(dá)水平比較（n=3）

表4 沉默組與對(duì)照組EMT 相關(guān)基因表達(dá)水平比較（n=3）

綜上所述，S100A4通過調(diào)節(jié)EMT過程，促進(jìn)乳腺癌的侵襲和遷移，其可能成為乳腺癌治療新的靶標(biāo)分子。