CJ016對H1975細胞周期和細胞凋亡的影響

萬 丹，甘 萍，譚永紅

小分子抗腫瘤化合物因其結構簡單，代謝途徑和作用機理便于研究分析，同時合成途徑相對簡捷，以及經(jīng)濟、低毒等特點而備受關注。在基因突變或缺失導致癌癥發(fā)生的進程中，組蛋白去乙酰化酶（HDACs）能通過反向調節(jié)染色質修飾來影響基因表達，誘發(fā)癌癥發(fā)生、發(fā)展，目前已成為治療癌癥的一個潛在靶點[1-3]。近年來，已發(fā)現(xiàn)幾類抗癌活性較好且特異性強的HDACs抑制劑，有些已進入臨床治療。但是，這HDACs抑制劑多被用于血液瘤等疾病的治療，在面對肺癌、肝癌這些多見實體瘤時，療效卻不盡如人意。為了能改善HDACs抑制劑治療實體瘤的療效，本課題組自主合成了小分子化合物CJ016（圖1），同時選擇吉非替尼耐藥的H1975細胞作為研究對象，觀察CJ016對H1975細胞周期和細胞凋亡的影響，從而分析其抗腫瘤作用機制，為進一步研究提供理論基礎[4]。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞株 人非小細胞肺癌細胞株（NCIH1975）購自中科院上海生命科學院細胞資源中心。

圖1 CJ016分子結構式

1.1.2 試劑與設備 化合物CJ016由本課題組自主合成、純化；紫杉醇（Paclitaxel，PTX）購自大連美侖生物技術有限公司；碘化丙啶（PI）、Annexin V購自美國Sigma公司；MTT購自美國Sigma公司，規(guī)格1 g/瓶；RPMI-1640培養(yǎng)基購自美國HyClone公司；優(yōu)級胎牛血清購自草原綠野生物工程材料有限公司；M5型全波長酶標儀購自美國Molecular公司，F(xiàn)ASC420型流式細胞儀購自美國Thremo公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) H1975細胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基中，細胞復蘇后，每48 h傳代一次，鏡下觀察細胞生長形態(tài)和密度，在5%CO2和37℃的恒溫培養(yǎng)箱內培養(yǎng)，連續(xù)傳代培養(yǎng)3次，選擇生長相對穩(wěn)定的對數(shù)期細胞用于后續(xù)研究。

1.2.2 CJ016對H1975細胞增殖的影響 取對數(shù)生長期細胞，按4×104個細胞/ml接種于96孔板，100 μl/孔。培養(yǎng)24 h后，分別加入終濃度分別為2.5、5、10、20、40、80 nmol/L 的 CJ016，空白對照組加等體積的培養(yǎng)基，每組6個復孔。繼續(xù)培養(yǎng)24、48、72 h后，用MTT法檢測細胞生長情況并計算細胞抑制率（%）。抑制率（%）=（空白對照組OD值-給藥組OD值）/空白對照組OD值×100%。

1.2.3 PI染色測定細胞周期 用0.25%胰酶消化并收集H1975細胞，按4.5×105個細胞/孔的密度接種于6孔培養(yǎng)板中，培養(yǎng)24 h后，加入終濃度分別為 10、20 nmol/L的 CJ016和 20 nmol/L的 PTX，作用24 h后消化并收集細胞，用2 ml PBS洗2次，1000 r/min離心3 min，用預冷的70%乙醇4℃固定過夜。離心，用 Buffer緩沖液 （Rnase A 1 μg/L，EDTA 20 mM/L）重懸后，于室溫孵育30 min。加PI染液 0.4 ml（1 mg/L），小心混勻，避光室溫染色 1.5 h，用流式細胞儀檢測DNA含量[5-7]。

1.2.4 Annexin V/PI雙染色檢測細胞凋亡 用0.25%胰酶消化并收集H1975細胞，按4.5×105個細胞/孔的密度接種于6孔培養(yǎng)板中，正常培養(yǎng)24 h后，將培養(yǎng)細胞分為4組：CJ016給藥組（加入終濃度分別為10、20 nmol/L的CJ016）、PTX組 （加入終濃度為20 nmol/L的PTX）、空白對照組（加入等體積的培養(yǎng)基）。繼續(xù)培養(yǎng)48 h，消化并收集細胞，用細胞篩過濾。血球計數(shù)板計數(shù)后，每組收集≥2×105個細胞。用0.3 ml Buffer緩沖液重懸細胞于流式管內，加5 μl的Annexin V-FITC，室溫避光染色30 min。加10 μl的PI染液，室溫避光染色10 min，用流式細胞儀檢測細胞凋亡情況[8-9]。

1.3 統(tǒng)計學方法 應用SPSS19.0統(tǒng)計軟件分析數(shù)據(jù)，實驗數(shù)據(jù)以±s表示，采用方差分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 CJ016對H1975細胞增殖的影響 隨CJ016給藥濃度不斷增加，細胞抑制率也相應提高，在80 nmol/L的劑量時，已基本沒有細胞存活。同時，隨CJ016給藥時間不斷延長，細胞抑制率也隨之增加，72 h時對細胞的抑制活性最大。見圖2。

2.2 CJ016對H1975細胞周期的影響 與空白對照組比較 （18.27%），CJ016處理H1975細胞24 h后，能將細胞阻滯在合成期和分裂期（G2/M），10、20 nmol/L的CJ016使G2/M細胞比例明顯增加，分別為25.15%和42.11%。同時，S期細胞比例有所增加，G0/G1期細胞比例相對減少，且呈現(xiàn)出一定的劑量差異。見圖3。

圖2 CJ016對H1975細胞增殖的影響

圖3 CJ016對H1975細胞周期的影響

2.3 CJ016誘導H1975細胞凋亡 空白對照組發(fā)生凋亡的細胞比例很少，凋亡細胞總數(shù)＜1%；陽性對照紫杉醇組凋亡細胞總數(shù)為20.29%。CJ016處理H1975細胞48 h后，細胞凋亡比例明顯增加：與空白對照組比較，10 nmol/L的CJ016使細胞早期凋亡（7.52%）和晚期凋亡 （10.1%）的比例明顯增加；20 nmol/L的CJ016使細胞晚期凋亡（25.8%）的比例明顯增加，且呈現(xiàn)一定的劑量差異。)+見圖見圖 4。

3 討論

圖4 CJ016對H1975細胞凋亡的影響

HDACs是參與人體內染色體重塑的一類重要激酶，其在表觀遺傳和基因表達中起關鍵作用，與癌癥的發(fā)生發(fā)展密切相關。小分子化合物因其結構相對簡單，合成途徑較簡捷經(jīng)濟，從而廣受關注。因此，利用小分子化合物來治療癌癥的方法在臨床上被廣泛使用。CJ016作為小分子HDACs抑制劑，在體外能有效抑制H1975細胞增殖，本課題組觀察到，當CJ016給藥濃度高于20 nmol/L時，鏡下觀察可見細胞數(shù)量明顯減少，細胞皺縮變圓，半貼壁或漂浮死亡。且隨給藥濃度不斷增加，抑制作用也隨之增強，呈現(xiàn)出較廣的治療窗口。同時，隨著作用時間的延長，其對腫瘤細胞的抑制效果也相應增加。流式檢測結果發(fā)現(xiàn)，10 nmol/L的CJ016處理H1975細胞48 h后，凋亡細胞比例（17.62%）較空白對照組（0.732%）明顯增多，凋亡細胞大多處在晚期凋亡中；而20 nmol/L的CJ016誘導細胞凋亡比例 （26.92%）高于10 nmol/L組，存在一定的劑量效應關系，且略優(yōu)于陽性對照紫杉醇組（20.29%）。表明CJ016能有效誘導H1975細胞發(fā)生凋亡，從而抑制腫瘤細胞惡性增殖。從圖3也可以看出，CJ016處理H1975細胞24 h后，能劑量依賴地將細胞周期阻滯在G2/M期中，一定程度地減緩細胞正常有絲分裂，起到抑制細胞增殖的作用。

綜上所述，CJ016能有效地阻滯H1975細胞分裂增殖，誘導細胞發(fā)生凋亡，起到延緩或抑制腫瘤細胞惡性傳代的作用，具有一定的抗腫瘤作用。