深度測(cè)序解析年齡及UCMSC治療對(duì)獼猴lncRNA的影響

朱向情，陳裕浩，王嚴(yán)影，高 萌，潘興華

長(zhǎng)鏈非編碼RNA（lncRNA）是一類(lèi)長(zhǎng)度＞200個(gè)核苷酸的非編碼RNA，其轉(zhuǎn)錄水平和狀態(tài)與細(xì)胞分化、個(gè)體發(fā)育及人類(lèi)疾病等相關(guān)。lncRNA的表達(dá)具有嚴(yán)格的細(xì)胞類(lèi)型和組織特異性，還具有精確的時(shí)間和空間表達(dá)模式，在惡性腫瘤、退行性疾病等疾病中可出現(xiàn)序列、空間結(jié)構(gòu)、表達(dá)水平、與結(jié)合蛋白相互作用的異常[1]。為探討年齡和臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞（UCMSC）治療對(duì)外周血單個(gè)核細(xì)胞lncRNA的影響，本研究對(duì)不同年齡獼猴及UCMSC治療后的老年獼猴外周血單個(gè)核細(xì)胞的全轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行測(cè)序分析，試圖解析年齡和UCMSC對(duì)lncRNA表達(dá)的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組 不同年齡健康獼猴12只，分為幼年、中年、老年和老年UCMSC治療4個(gè)組，每組3只，均為雄性。其中幼年組為年齡1歲，、體重 2～3 kg；中年組為年齡 10 歲，體重 8～10 kg；老年和老年UCMSC治療組為年齡22～24歲，體重8～10 kg。編號(hào)分別為老年組1～3號(hào)，中年組4～6號(hào)，幼年組7～9號(hào)，老年UCMSC治療組10～12號(hào)。實(shí)驗(yàn)用獼猴均來(lái)自于中國(guó)科學(xué)院昆明動(dòng)物研究所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，在醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心進(jìn)行飼養(yǎng)和實(shí)驗(yàn)，動(dòng)物使用經(jīng)過(guò)醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)審查、批準(zhǔn)。

1.2 UCMSC來(lái)源及治療 獼猴UCMSC來(lái)源于剖腹產(chǎn)母猴的臍帶組織，UCMSC的制備和鑒定在本實(shí)驗(yàn)室完成。經(jīng)體外分離、擴(kuò)增、傳代培養(yǎng)后，獲得第3代（P3）經(jīng)鑒定符合以下標(biāo)準(zhǔn)：（1）體外培養(yǎng)呈長(zhǎng)梭形，旋渦狀克隆生長(zhǎng)；（2）高表達(dá) CD105、CD90、CD29，不表達(dá) CD34、CD45；（3）體外可誘導(dǎo)分化為神經(jīng)、骨、軟骨、脂肪細(xì)胞；（4）可分泌多種生長(zhǎng)因子、炎癥調(diào)節(jié)因子和外分泌體。UCMSC治療方法：將P3 UCMSC用生理鹽水稀釋為1×106細(xì)胞/ml懸液，采用后肢隱靜脈輸入法按1×106個(gè)細(xì)胞/kg的劑量輸入老年UCMSC治療組獼猴體內(nèi)，1次/w，連續(xù)治療3次，其他組不作處理。所有實(shí)驗(yàn)獼猴均常規(guī)飼養(yǎng)于普通級(jí)實(shí)驗(yàn)環(huán)境，給予充足飲水和飼料。

1.3 外周血單個(gè)核細(xì)胞的采集及處理 末次UCMSC治療后30 d，采集各組獼猴外周靜脈血5 ml，用等量生理鹽水稀釋后，置于預(yù)先準(zhǔn)備好的淋巴細(xì)胞分層液上，400 r/min離心20 min，收集單個(gè)核細(xì)胞；用生理鹽水洗滌3次，再用1640培養(yǎng)基稀釋成5×106細(xì)胞/ml備用。

1.4 LncRNA轉(zhuǎn)錄組測(cè)序及數(shù)據(jù)分析 外周血單個(gè)核細(xì)胞樣本交由上海歐易生物醫(yī)學(xué)科技有限公司進(jìn)行RNA提取、二代測(cè)序，并提供原始數(shù)據(jù)、統(tǒng)計(jì)處理、數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)、聚類(lèi)分析、差異分析報(bào)告。高通量測(cè)序得到的原始圖像數(shù)據(jù)文件經(jīng)堿基識(shí)別分析轉(zhuǎn)化為原始測(cè)序序列，使用軟件FASTQC對(duì)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)量評(píng)估，使用軟件NGS QC TOOLKIT v2.3.3對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行預(yù)處理，篩選獲得轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)。lncRNA的篩選方法：（1）使用cuffcompare軟件樣本轉(zhuǎn)錄本與參考轉(zhuǎn)錄本進(jìn)行比對(duì)，去除已知編碼轉(zhuǎn)錄本；（2）篩選到的轉(zhuǎn)錄本按長(zhǎng)度200 bp和外顯子數(shù)目≥2 進(jìn)行再次篩選；（3）使用 CPC、CNCI、Pfam、PLEK軟件和數(shù)據(jù)庫(kù)[3-6]對(duì)篩選得到的轉(zhuǎn)錄本進(jìn)行編碼能力預(yù)測(cè)分析，獲得有編碼潛能的轉(zhuǎn)錄本。

通過(guò)上述3步篩選后，最終獲得的轉(zhuǎn)錄本為本研究預(yù)測(cè)得到的潛在lncRNA轉(zhuǎn)錄本。利用LncRNA的表達(dá)量進(jìn)行主成分PCA分析，對(duì)樣品分布和實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)進(jìn)行驗(yàn)證。利用DESeq軟件包比較不同組別的差異lncRNA，并對(duì)差異表達(dá)lncRNA進(jìn)行聚類(lèi)分析，計(jì)算多個(gè)樣品兩兩之間的距離，構(gòu)成距離矩陣，合并距離最近的兩類(lèi)為一新類(lèi)，計(jì)算新類(lèi)與當(dāng)前各類(lèi)的距離；再合并、計(jì)算，直至只有一類(lèi)為止。同一類(lèi)樣品能通過(guò)聚類(lèi)出現(xiàn)在同一個(gè)簇中，具有相似的生物學(xué)功能，用熱圖展示。

2 結(jié)果

2.1 測(cè)序數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì) 采用Solexa RNA的pairedend測(cè)序法獲得了老年組、中年組、幼年組和老年經(jīng)UCMSC治療組共12個(gè)樣本的全基因組轉(zhuǎn)錄數(shù)據(jù)。將獲得的原始數(shù)據(jù)（raw data）進(jìn)行預(yù)處理：（1）去除低質(zhì)量的reads，質(zhì)量閾值設(shè)置為20，長(zhǎng)度閾值設(shè)置為70%；（2)從3'端去除低質(zhì)量堿基：質(zhì)量閾值設(shè)置為20；（3)切除reads中含有未識(shí)別堿基的：長(zhǎng)度閾值設(shè)置為前35 bp。經(jīng)過(guò)預(yù)處理，最終獲得的數(shù)據(jù)結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 LncRNA序列數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)結(jié)果

2.2 LncRNA類(lèi)型分布及主成分分析 通過(guò)生物信息學(xué)比較分析獲得的lncRNA主要包括基因間lncRNA、內(nèi)含子lncRNA、反義 lncRNA和有意義重疊lncRNA，其中反義RNA的含量最多，其次是基因間lncRNA和重疊lncRNA（圖1）。采用主成分PCA分析法對(duì)12個(gè)樣本的lncRNA數(shù)據(jù)進(jìn)行樣本分布分析，其中幼年、老年和老年UCMSC治療組的主成分分布相對(duì)集中，中年組存在個(gè)體差異（圖2）。

圖1 lncRNA類(lèi)型及含量

圖2 樣品主成分分析

2.3 基因表達(dá)量分析 本研究獲得的lncRNA轉(zhuǎn)錄本的表達(dá)豐度結(jié)果見(jiàn)表2。差異表達(dá)分析采用DESeq軟件中的負(fù)二項(xiàng)分布檢驗(yàn)，計(jì)算出各組lncRNA表達(dá)差異。老年組與中年組比較，差異表達(dá)的基因總數(shù)為111個(gè)，其中上調(diào)表達(dá)的48個(gè)，下調(diào)表達(dá)的63個(gè)。老年組與幼年組比較，差異表達(dá)的基因總數(shù)為103個(gè)，其中上調(diào)表達(dá)的54個(gè)，下調(diào)表達(dá)的49個(gè)。中年組與幼年組比較，差異表達(dá)的基因總數(shù)為98個(gè)，其中上調(diào)表達(dá)的52個(gè)，下調(diào)表達(dá)的46個(gè)。老年組與老年UCMSC治療組比較，差異表達(dá)的基因總數(shù)為109個(gè)，其中上調(diào)表達(dá)的41個(gè)，下調(diào)表達(dá)的68個(gè)。

2.4 聚類(lèi)分析 對(duì)篩選獲得的差異表達(dá)基因進(jìn)行生物信息聚類(lèi)分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)各組IncRNA表達(dá)水平均呈現(xiàn)較大差異，總體趨勢(shì)是部分幼年高表達(dá)的IncRNA，在中年和老年時(shí)表達(dá)降低。 見(jiàn)圖3。

3 討論

lncRNA是一類(lèi)長(zhǎng)度超過(guò)200 bp、不具有蛋白編碼功能的RNA分子。在哺乳動(dòng)物基因組序列中，約有4%～9%的序列產(chǎn)生的轉(zhuǎn)錄本為lncRNA。研究表明，lncRNA在劑量補(bǔ)償效應(yīng)、表觀遺傳調(diào)控、細(xì)胞周期和分化調(diào)控等眾多生命活動(dòng)中發(fā)揮重要作用，參與了X染色體沉積、基因組印記、染色體修飾、轉(zhuǎn)錄激活、轉(zhuǎn)錄干擾、核內(nèi)運(yùn)輸?shù)榷喾N重要的調(diào)控過(guò)程[7]。

表2 轉(zhuǎn)錄本豐度分布

圖3 各組差異表達(dá)IncRNA移動(dòng)平均線(xiàn)（MA）分析

關(guān)于衰老及UCMSC治療對(duì)IncRNA表達(dá)的影響研究，國(guó)內(nèi)外報(bào)道極少。本研究通過(guò)基因轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，獲得了獼猴老年、中年、幼年和老年UCMSC治療后的外周血單個(gè)核細(xì)胞IncRNA轉(zhuǎn)錄本，通過(guò)生物信息學(xué)篩選和比較分析，找出了不同年齡和老年UCMSC治療獼猴差異IncRNA及表達(dá)變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在不同年齡狀態(tài)和UCMSC治療后，IncRNA表達(dá)水平存在一定差異，這些差異表達(dá)的IncRNA參與了細(xì)胞生物過(guò)程、功能分子及細(xì)胞組成成份基因的表達(dá)調(diào)控，其主要變化趨勢(shì)是隨著年齡增長(zhǎng)，部分幼年高表達(dá)的IncRNA表達(dá)下調(diào)，部分幼年低表達(dá)的IncRNA表達(dá)上調(diào)。值得關(guān)注的是，在對(duì)老年獼猴實(shí)施UCMSC治療后，衰老狀態(tài)的低表達(dá)IncRNA表達(dá)水平升高，而一些高表達(dá)IncRNA的表達(dá)水平降低，表明衰老狀態(tài)的IncRNA表達(dá)譜發(fā)生了向中年或幼年方向逆轉(zhuǎn)，這種變化可能是UCMSC發(fā)揮抗衰老效應(yīng)機(jī)制之一。

本研究為生物體衰老及UCMSC抗衰老的基因表達(dá)調(diào)控機(jī)制提供了新的思路和證據(jù)，一步將針對(duì)差異表達(dá)IncRNA的靶基因及在衰老和UCMSC治療中的生物學(xué)功能進(jìn)行深入，逐步闡明差異IncRNA的調(diào)控機(jī)制。