白細(xì)胞介素-6受體、白細(xì)胞介素-27基因多態(tài)性與冠心病易感性的相關(guān)性研究

冠心病是導(dǎo)致人類死亡最常見的原因之一。WHO報告顯示，冠心病死亡率占全球總死亡率的12.9%[1]。隨著人民生活水平的提高與老齡化進(jìn)程的加快，中國冠心病的發(fā)病率、死亡率逐年上升[2]。研究表明，免疫炎癥反應(yīng)在冠心病的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮著重要作用。白細(xì)胞介素-6(interleukin-6，IL-6)是細(xì)胞中重要的促炎因子，IL-6與其受體(IL-6R)結(jié)合后，可誘導(dǎo)多種細(xì)胞分化、成熟及凋亡[3-4]。白細(xì)胞介素-27(interleukin-27，IL-27)是由p28亞基與EB病毒誘導(dǎo)基因3(Epstein Barrvirus induced gene 3，EBI3)亞基結(jié)合形成的異源二聚體，具有促炎和抗炎雙向調(diào)節(jié)作用。研究發(fā)現(xiàn)，IL-6、IL-27基因多態(tài)性與炎癥、免疫、腫瘤、病毒感染等疾病密切相關(guān)[5-6]。但目前關(guān)于IL-6R、IL-27基因多態(tài)性與冠心病關(guān)聯(lián)分析的研究還較少。本研究通過檢測冠心病病人IL-6R、IL-27基因型，分析其與冠心病易感性的關(guān)系，從遺傳學(xué)角度探究冠心病的發(fā)病因素。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇本院心血管內(nèi)科2015年6月—2017年8月收治的冠心病病人226例為試驗組，其中男163例，女63例；年齡37～86(60.42±17.83)歲。全部病例符合1979年WHO公布的冠心病診斷標(biāo)準(zhǔn)[7]。采用Judkins法[8]進(jìn)行冠狀動脈造影，冠狀動脈主要分支狹窄程度≥50%確診為冠心病。所選病例均排除腫瘤、腦血管疾病、血液系統(tǒng)疾病、急慢性感染、嚴(yán)重肝腎疾病、全身免疫性疾病等。另選擇同期于本院體檢且年齡等相仿的200名身體健康者作為對照組，年齡40～80(62.74±18.39)歲；男150名，女50名。兩組受試者的性別、年齡等臨床資料差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。所有受試者均簽署知情同意書，本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會審核批準(zhǔn)。

1.2 臨床資料 收集所有受試者身高、體重、血壓、血漿總膽固醇(TC)、三酰甘油(TG)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)，凝血四項指標(biāo)包括凝血酶原時間(PT)、活化部分凝血活酶時間(APTT)、凝血酶時間(TT)、纖維蛋白原(FIB)等。

1.3 主要試劑 Platinum Taq DNA聚合酶購自南京金思特科技公司；IL-6R和IL-27引物購自上海生工公司；人外周血基因組DNA提取試劑盒購自中國康為世紀(jì)生物公司；ABI9700型PCR擴增儀購自美國Applied Biosystem公司；紫外分光光度計購自美國Bio-Rad公司；瓊脂糖凝膠電泳儀購自北京六一儀器廠。

1.4 基因組DNA的提取 全部受試者均空腹采集6 mL肘靜脈血液，用EDTA-Na進(jìn)行抗凝處理。采用DNA提取試劑盒提取各受試者的全血基因組DNA，操作步驟嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行。紫外分光光度計檢測DNA純度及濃度，OD260/280為1.8～2.0，可用于后續(xù)試驗。將DNA稀釋至20 ng/μL后分裝，保存于-20 ℃冰箱備用。

1.5 IL-6R和IL-27基因多態(tài)性的檢測 使用HapMap數(shù)據(jù)庫和Haploview軟件選擇IL-6R和IL-27的單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism，SNP)位點，最終6個SNP位點被研究。采用高分辨率溶解曲線(PCR-HRM)技術(shù)對IL-6R和IL-27基因進(jìn)行分型，引物序列見表1。PCR-HRM反應(yīng)體系的配制：10×Buffer 2.0 μL、10 mmol/L dNTPs 0.4 μL、20 μmol/L上下游引物各0.5 μL、DNA 2.0 μL、Platinum Taq DNA聚合酶0.16 μL，最后加ddH2O至20 μL；反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性3 min；95 ℃變性25 s，62 ℃退火延伸40 s，10個循環(huán)；95 ℃變性25 s，57 ℃退火20 s，72 ℃延伸30 s，27個循環(huán)；72 ℃延伸2 min。HRM條件：96 ℃變性30 s，45 ℃退火30 s，對72～90 ℃的溶解曲線數(shù)據(jù)進(jìn)行收集。根據(jù)溶解曲線峰型變化對IL-6R和IL-27基因進(jìn)行分型。

表1 IL-6R和IL-27基因各SNPs引物序列

2 結(jié) 果

2.1 兩組受試者基線資料比較 兩組受試者年齡、性別、體質(zhì)指數(shù)(BMI)、收縮壓、舒張壓等資料比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。與對照組比較，試驗組血脂指標(biāo)TG、LDL-C水平均顯著升高(P<0.05)，而TC水平顯著降低(P<0.05)。與對照組比較，試驗組凝血指標(biāo)PT顯著延長、FIB升高(P<0.05)，而TT顯著縮短(P<0.05)。詳見表2。

表2 兩組受試者基線資料比較(±s)

2.2 兩組受試者血清IL-6R基因多態(tài)性分析 PCR-HRM結(jié)果證實，IL-6R(183A/G)檢測到3種基因型：AA、AG、GG；IL-6R(exon1A/C)檢測到3種基因型：AA、AC、CC；IL-6R(exon2A/T)檢測到2種基因型：AT、TT。IL-6R基因型頻率分布符合Hardy-Weinberg平衡檢驗。IL-6R(183A/G)的基因型及等位基因頻率在試驗組和對照組間的差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。IL-6R(exon1A/C)和IL-6R(exon2A/T)的基因型及等位基因頻率在試驗組和對照組間的差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。詳見表3。

表3 兩組受試者血清IL-6R基因型及等位基因頻率 例(%)

2.3 兩組受試者血清IL-27基因多態(tài)性分析 PCR-HRM結(jié)果證實，IL-27(4730T/C)檢測到2種基因型：TT、TC；IL-27(-964A/G)檢測到3種基因型：AA、AG、GG；IL-27(2905T/G)檢測到2種基因型：TT、TG。IL-27基因型頻率分布符合Hardy-Weinberg平衡檢驗。IL-27(4730T/C)、IL-27(-964A/G)和IL-27(2905T/G)的基因型及等位基因頻率在試驗組和對照組間的差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。詳見表4。

2.4 IL-6R和IL-27基因多態(tài)性與冠心病發(fā)生風(fēng)險的關(guān)聯(lián)分析 對基因型及基因頻率在試驗組和對照組間的差異有統(tǒng)計學(xué)意義的兩個位點，即IL-6R(exon1A/C)、IL-6R(exon2A/T)，采用Logistic回歸分析這兩個位點的突變基因型與冠心病發(fā)生風(fēng)險的相關(guān)性。以野生純合型為基準(zhǔn)，突變基因型為啞變量。IL-6R(exon1A/C)的突變雜合基因型AC與野生純合型AA間的差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，而突變純合基因型CC與野生純合型AA間的差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，其突變基因型可降低冠心病的發(fā)病風(fēng)險。IL-6R(exon2A/T)的突變雜合基因型AT與野生純合型TT間的差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，其突變基因型可增加冠心病的發(fā)病風(fēng)險。詳見表5。

表4 兩組受試者血清IL-27基因型及等位基因頻率 例(%)

表5 IL-6R和IL-27基因多態(tài)性與冠心病發(fā)生風(fēng)險的Logistic回歸分析

2.5 IL-6R和IL-27基因多態(tài)性與冠心病病人血清指標(biāo)的關(guān)系 將IL-6R、IL-27基因多態(tài)性與冠心病病人血清指標(biāo)檢測結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計分析發(fā)現(xiàn)，IL-6R(exon1A/C)的基因型與血脂指標(biāo)TC、HDL-C顯著相關(guān)(P<0.05)。詳見表6。

表6 IL-6R和IL-27基因多態(tài)性與冠心病病人血清指標(biāo)的關(guān)系

3 討 論

冠心病是一種遺傳和環(huán)境因素相互作用造成的復(fù)雜性疾病。有研究發(fā)現(xiàn)，家族遺傳因素與冠心病的發(fā)生密切相關(guān)，那么發(fā)掘與冠心病相關(guān)的基因多態(tài)性，成為防治冠心病的關(guān)鍵[9]。動脈粥樣硬化是冠心病發(fā)生的主要危險因素，而動脈粥樣硬化是由血管管壁慢性炎癥反應(yīng)所致，細(xì)胞因子如白細(xì)胞介素、腫瘤壞死因子、C-反應(yīng)蛋白等在該過程中發(fā)揮重要作用[10]。細(xì)胞因子的生成由基因所調(diào)控，基因多態(tài)性可能會影響細(xì)胞因子的表達(dá)[11]。因此，細(xì)胞因子多態(tài)性可能與疾病的發(fā)生有關(guān)。IL-6主要是由單核巨噬細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞、Th2細(xì)胞等細(xì)胞合成分泌，在血液中廣泛存在，介導(dǎo)各種免疫、炎癥反應(yīng)。IL-6的主要功能有促進(jìn)活化B細(xì)胞分化成熟，促進(jìn)T細(xì)胞活化增殖，促進(jìn)肝細(xì)胞在急性炎癥期合成炎性因子等。IL-6與其靶細(xì)胞表面的IL-6R特異性結(jié)合后，可激活gp130并與其結(jié)合成三元復(fù)合物，啟動Janus家族酪氨酸激酶信號傳導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄活化因子(JAK/STAT3)途徑和絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)途徑發(fā)揮作用[12-13]。大量研究證實，冠心病病人血清中的IL-6、IL-6R表達(dá)量顯著高于正常對照組，表明IL-6、IL-6R可能參與冠心病的發(fā)病過程[14]。另有研究證實，血清IL-6含量可預(yù)測冠心病的發(fā)病風(fēng)險，且與冠心病的病情進(jìn)展、預(yù)后均有關(guān)[15]。由于IL-6、IL-6R表達(dá)量由基因所調(diào)控，因此分析IL-6、IL-6R基因多態(tài)性與冠心病易感性的關(guān)系可為該病的發(fā)病機制提供新線索。目前關(guān)于IL-6基因多態(tài)性的研究相對較多，但關(guān)于IL-6R基因多態(tài)性的研究還很少。本研究就IL-6R基因多態(tài)性與冠心病易感性的關(guān)系進(jìn)行了研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)IL-6R(exon1A/C)和IL-6R(exon2A/T)在試驗組和對照組間的差異均有統(tǒng)計學(xué)意義，IL-6R(exon1A/C)的突變純合基因型CC可降低冠心病的發(fā)病風(fēng)險，而IL-6R(exon2A/T)的突變雜合基因型AT可增加冠心病的發(fā)病風(fēng)險，說明IL-6R基因多態(tài)性與冠心病易感性有關(guān)。IL-6R(exon1A/C)的基因型與血脂指標(biāo)TC、HDL-C顯著相關(guān)，說明IL-6R基因多態(tài)性與脂質(zhì)代謝也有關(guān)。

IL-27是一種新型的IL6/IL12家族炎性因子，在炎癥反應(yīng)的不同階段或不同刺激下發(fā)揮雙向調(diào)控作用，一方面能促進(jìn)初始CD4+T細(xì)胞分化成Th1型細(xì)胞，促進(jìn)炎癥反應(yīng)的發(fā)生；另一方面又能抑制Th17細(xì)胞合成分泌IL-17，從而發(fā)揮抗炎作用[16]。IL-27在冠心病中的作用目前尚有爭議。有研究發(fā)現(xiàn)，急性心力衰竭病人血清中IL-27水平顯著高于正常對照組，故而認(rèn)為IL-27可促進(jìn)缺血性心臟病的發(fā)生[17]。另有研究發(fā)現(xiàn)，IL-27可通過抑制巨噬細(xì)胞的活性來減緩小鼠動脈粥樣硬化的病情進(jìn)展[18]。目前從遺傳角度研究IL-27基因與冠心病關(guān)系的報道還很少。本研究就IL-27基因多態(tài)性與冠心病易感性的關(guān)系進(jìn)行了研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)IL-27(4730T/C)檢測到2種基因型：TT、TC；IL-27(-964A/G)檢測到3種基因型：AA、AG、GG；IL-27(2905T/G)檢測到2種基因型：TT、TG。但I(xiàn)L-27(4730T/C)、IL-27(-964A/G)和IL-27(2905T/G)的基因型及等位基因頻率在試驗組和對照組間的差異均無統(tǒng)計學(xué)意義，而且IL-27基因型與血脂指標(biāo)(TC、TG、LDL-C、HDL-C)及凝血指標(biāo)(PT、APTT、TT、FIB)均無關(guān)，說明IL-27基因多態(tài)性與冠心病易感性、脂質(zhì)代謝均無關(guān)。

本研究結(jié)果初步表明，血清IL-6R(exon1A/C)、IL-6R(exon2A/T)多態(tài)性與冠心病易感性有關(guān)，且IL-6R(exon1A/C)的基因型與血脂指標(biāo)TC、HDL-C顯著相關(guān)，而IL-27基因多態(tài)性與冠心病易感性無關(guān)。IL-6R基因多態(tài)性與冠心病易感性及脂質(zhì)代謝的相關(guān)性，可能為冠心病的發(fā)生機制提供一定的參考價值。