汶香附中生物堿類物質(zhì)的提取及其體外抗氧化研究

吳會晗，韓 晨，丁麗雪，方永晟，王學震,何 珊

(山東中醫(yī)藥大學 藥學院，山東 濟南 250300)

香附為莎草科植物莎草(Cyperus rotundus) 的干燥根莖， 味辛、微苦、甘，性平，具有疏肝解郁、調(diào)經(jīng)止痛、理氣調(diào)中的功效，是中醫(yī)常用婦科藥。香附主要成分為揮發(fā)油類物質(zhì)，也包括多種萜類化合物及其氧化物等[1]。香附還含有糖類、黃酮類、生物堿類等各種化合物， Jeong 等[2]從香附中分離鑒定出了 3 個生物堿化合物，分別為羅通定 A(rotundine A) 、羅通定 B(rotundine B)、羅通定 C(rotundine C)，其結(jié)構骨架是基于一種新的倍半萜烯類型[3]。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

醋香附：購自濟南宏濟堂(北園路藥店)，產(chǎn)地山東泰安；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)自由基(南京建成生物科技有限公司)、2,2-聯(lián)氮基雙(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)自由基(ABTS+)(上海遠慕生物科技有限公司)；95%乙醇、甲醇、鹽酸、氨水、雷氏銨鹽、二氯甲烷、無水硫酸鈉、丙酮、過硫酸鉀均為分析純。

1.2 儀器與設備

UV-2000型紫外可見分光光度計；FA2004B型十萬分之一電子分析天平：賽多利斯科學儀器(北京)有限公司；粉碎機；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀；水浴鍋。

1.3 試驗方法

1.3.1 香附生物堿制備

取一定量醋香附，洗凈，烘干并用粉碎機研成粉末得到醋香附干粉。精確稱取70.00 g香附粉末于索氏提取器中，用200 mL 95%乙醇進行索氏提取2 h。將乙醇倒出，取少部分等量溶液于兩個小試管中，用5%的鹽酸溶液酸化至pH值至5～6，各滴加改良碘化鉍鉀溶液與雷氏銨鹽試液兩滴進行生物堿的定性實驗。將剩余乙醇溶液放置于蒸餾燒瓶中，蒸出乙醇直至燒瓶中僅剩20 mL液體，此時將液體倒入磨口錐形瓶中，加入100 mL 1%鹽酸溶液，放置過夜后，抽濾，用氨水調(diào)節(jié)濾液pH值至9～10，用75 mL二氯甲烷萃取，分離有機相，用氨水調(diào)節(jié)上層清液pH值至 9～10，再用50 mL二氯甲烷萃取2次。合并所有萃取液，用40 g無水硫酸鈉脫水1 h，將萃取液置于蒸餾燒瓶中，蒸出二氯甲烷，直至燒瓶內(nèi)液體近干，再加10 mL丙酮溶液將殘留物溶出，放置于磨口錐形瓶中。再于60℃下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，刮下生物堿提取物以供下述實驗用。

1.3.2 香附生物堿抗氧化能力的測定

1.3.2.1 樣品溶液制備

精確稱取香附生物堿提取物0.06 g，使用甲醇溶液作為溶劑，配置質(zhì)量濃度為4.0 mg/mL樣品液。再使用甲醇將上述溶液分別稀釋至0.25、0.5、1.0、2.0、4.0 mg/mL。

1.3.2.2 DPPH自由基清除率的測定

DPPH自由基為暗紫色棱柱狀結(jié)晶，是一種很穩(wěn)定的氮中心自由基，其醇溶液呈紫色，在波長520 nm左右有一強吸收。在DPPH自由基清除試驗中，DPPH自由基與受試物給出的氫原子結(jié)合，使反應溶液的顏色變淺，吸光度變小。受試物的抗氧化活性可以根據(jù)實驗組溶液吸光度的變化來判定。

參考單虹宇[4]方法，用無水乙醇配置0.1 mmol/L的自由基溶液，無光下保存該溶液，并使溫度保持在5℃左右。取1.3.2.1中不同濃度的香附生物堿溶液2 mL與配置好的2 mL DPPH自由基溶液，混合兩種溶液并充分振搖，避光條件下反應25 min，在520 nm波長處測定吸光度。按照下公式計算DPPH自由基的清除率。重復測定3次。

DPPH 自由基清除率(%) = (1-(As-Ab)/Ac)×100

式中：

As為樣品組的吸光度值；

Ab為本底組的吸光度值；

Ac為空白組的吸光度值。

1.3.2.3 ABTS自由基清除率的測定

ABTS在氧化劑的作用下氧化成為綠色的自由基陽離子ABTS+·，ABTS+·易溶于水和酸性乙醇溶液，最大吸收值在734 nm左右。在ABTS自由基清除試驗中，加入抗氧化物質(zhì)后，部分ABTS+·自由基被清除，溶液的吸光度降低，得到香附提取物對ABTS+·的清除效果。在室溫避光條件下將7 mmol/LABTS+水溶液和2.45 mmol/L的過硫酸鉀反應15 h，制得ABTS+·自由基標準溶液。取該溶液適量，用蒸餾水將其稀釋至OD734nm=0.700±0.005，制得ABTS+·自由基工作液。將0.1 mL ABTS+·自由基工作液3.9 mL與1.3.2.1中不同濃度的香附生物堿溶液混合并且充分振搖，避光條件下反應4～6 min，在波長734 nm處測定吸光度[5-6]。計算ABTS+·自由基的清除率并重復測定3次。

ABTS+清除率(%)=(1-(As-Ab)/Ac)×100

式中：

As為樣品組的吸光度值；

Ab為本底組的吸光度值；

Ac為空白組的吸光度值。

2 結(jié)果與分析

2.1 香附生物堿對DPPH自由基清除率的測定

香附中生物堿對DPPH自由基有一定的清除作用，如圖1為香附生物堿提取物對DPPH自由基的清除率。(生物堿對DPPH自由基的清除能力在(0.5～1) mg/mL內(nèi)增加的幅度最大)，回歸方程為：Y=0.7358 + 0.0807 X(式中X為樣品濃度，Y為清除率)，半抑制率(IC50值)為0.173688 mg/mL。

表1 不同濃度生物堿的清除作用Table 1 Scavenging effects of different concentrations of alkaloids

圖1 不同濃度生物堿的清除作用
Fig.1 Scavenging effects of different concentrations of alkaloids

2.2 香附生物堿對ABTS+自由基清除率的測定

由圖2可見香附生物堿提取物對ABTS+有一定清除作用，且回歸方程為Y=0.1838X+0.3466(式中X為樣品濃度，Y為清除率)，半抑制率(IC50值)為 0.56383 mg/mL。

表2 不同濃度生物堿的清除率Table 2 Clearance of different concentrations of alkaloids

圖2 不同濃度生物堿的清除率
Fig.2 Clearance of different concentrations of alkaloids

3 結(jié)論

本文探究了香附中生物堿提取的方法，以及其抗氧化活性，生物堿的定性實驗結(jié)果表明，索氏提取可以提取出香附中的生物堿，并且提取出的生物堿具有一定的抗氧化能力，其清除ABTS+·自由基和DPPH自由基的IC50值分別為0.5638、0.1737 mg/mL。香附藥用價值較高，分布廣泛，香附中生物堿在目前研究還較少，可以對香附中生物堿進行進一步的研究。