豌豆酯酶的純化和酯酶活性表征及其對(duì)農(nóng)藥的敏感性

黃嬡，馬志強(qiáng)，王瑋，宋燕飛，李榮，陳強(qiáng)，陳祥貴，楊瀟

(西華大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院，四川 成都，610039)

農(nóng)藥的大規(guī)模廣泛使用雖然促進(jìn)了農(nóng)業(yè)的發(fā)展，但是殘留問題也造成了嚴(yán)重安全風(fēng)險(xiǎn)[1]。據(jù)統(tǒng)計(jì)，中國(guó)每年農(nóng)藥中毒人數(shù)高達(dá)上萬人，其中70%以上是有機(jī)磷農(nóng)藥中毒[2]。因此采用快速農(nóng)殘檢測(cè)方法普查食品和環(huán)境中的農(nóng)藥殘留是農(nóng)殘監(jiān)管的重要措施，而目前廣泛應(yīng)用的農(nóng)殘快檢方法為酶抑制法。與傳統(tǒng)的儀器分析方法相比，該類方法具有操作簡(jiǎn)便、成本低廉、可實(shí)現(xiàn)現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)等優(yōu)點(diǎn)[3]。在此基礎(chǔ)上發(fā)展起來的酶生物傳感器法則極大地提高了農(nóng)殘快檢的自動(dòng)化水平[4-6]。

由于酶的活性和對(duì)農(nóng)藥的敏感度，對(duì)于酶抑制法的準(zhǔn)確性和檢出限十分重要，因此關(guān)于酶源的篩選和酶性能的改良一直是研究的熱點(diǎn)。目前酶抑制法中常用酶為膽堿酶，包括乙酰膽堿酯酶(AChE，EC3.1.1.7)和丁酰膽堿酯酶(BChE，EC3.1.1.8)兩類。但是由于膽堿酶廣泛存在于動(dòng)物組織中，如目前使用的AChE主要提取于電鰻及家蠅、庫蚊等敏感昆蟲頭部，BChE主要提取于馬血。然而動(dòng)物酯酶來源有限，提取過程復(fù)雜，產(chǎn)量低，成本高，酶活性不穩(wěn)定。而植物酯酶具有來源廣泛、價(jià)格低廉等優(yōu)點(diǎn)，最近的研究表明，小麥[7-8]、大豆[9-10]和麻風(fēng)樹[11]中的植物酯酶具有與AChE相似的農(nóng)藥敏感性。

豌豆(PisumsativumLinn.),又名寒豆、麥豆、雪豆等，在全球范圍內(nèi)分布廣泛，作為植物酶源具有明顯成本優(yōu)勢(shì)。然而關(guān)于豌豆酯酶的制備與純化研究卻鮮有報(bào)道，豌豆酯酶的酶學(xué)特征和對(duì)農(nóng)藥的敏感性也并不明確，這極大地限制了豌豆酯酶在農(nóng)藥檢測(cè)中的應(yīng)用。

本研究從豌豆中分離純化了植物酯酶，通過底物和抑制劑特異性實(shí)驗(yàn)對(duì)酯酶的類型進(jìn)行了鑒別。對(duì)豌豆酯酶的酶促反應(yīng)條件進(jìn)行了優(yōu)化，并通過有機(jī)磷和氨基甲酸酯農(nóng)藥對(duì)豌豆酯酶的抑制實(shí)驗(yàn)來評(píng)估該酶對(duì)農(nóng)藥的敏感性。本研究的結(jié)果為豌豆酯酶在農(nóng)藥檢測(cè)中的應(yīng)用奠定了理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

豌豆由成都市農(nóng)林科學(xué)院提供，并由成都市農(nóng)林科學(xué)院作物研究所鑒定為蝶形花科植物豌豆(PisumsativumLinn.) 的種子。

α-醋酸萘酯(α-NA)、固藍(lán)B鹽、α-萘酚、S-乙酰硫膽堿碘化物(ATChI)、S-丁酰硫代膽堿碘化物(BTChI)、5,5′-二硫雙-2-硝基苯甲酸(DTNB)、鹽酸多奈哌齊、毒扁豆堿、磷酸雙4-硝基苯酯(BNPP)、樂果(純度≥98%)、毒死蜱(純度≥95%)、久效磷(純度≥99%)、辛硫磷(純度≥95%)、敵百蟲(純度≥99%)、殘殺威(純度≥99%)、三唑磷(純度≥98%)、氧樂果(純度≥95%)、敵敵畏(純度≥99%)、滅多威(純度≥99%)、涕滅威(純度≥99%)、克百威(純度≥99%):Sigma-Aldrich公司。

1.2 儀器與設(shè)備

1.3 酶活性測(cè)定

在96孔板中，加入50 μL酶液，50 μL磷酸鹽緩沖液(20 mmol/L，pH 6.5)和100 μL的α-NA(0.2 mmol/L)，混勻并在35 ℃孵育15 min。然后加入100 μL固藍(lán)B鹽溶液(2.5 g/L)，于酶標(biāo)儀中在550 nm處測(cè)量吸光度[12]。1個(gè)酶活性單位(U)被定義為：在標(biāo)準(zhǔn)測(cè)定條件下每分鐘產(chǎn)生1 μmol的酶反應(yīng)產(chǎn)物α-萘酚。

1.4 酶的提取和純化

將新鮮豌豆冷凍干燥并研磨成細(xì)粉。將2.00 g豌豆粉加入20 mL的磷酸鹽緩沖液(20 mmol/L，pH 5.0)中。將混合物于4 ℃溫和振蕩過夜，并在4 ℃下8 000×g離心10 min，上清即為粗酶液。粗酶液再通過以下步驟進(jìn)行純化：(1)在5 mL Hi-Trap SP HP柱(GE Healthcare)上進(jìn)行陰離子交換層析。用磷酸鹽緩沖液(20 mmol/L，pH 5.0，含有20 mmol/L NaCl)平衡后，將粗酶液上樣。用3倍柱體積的磷酸鹽緩沖液(20 mmol/L，pH 5.0，含有20 mmol/L NaCl)洗柱。然后用含有NaCl的磷酸鹽緩沖液(20 mmol/L，pH 5.0)進(jìn)行0.02～0.5 mol/L NaCl的線性梯度洗脫，洗脫液在4 ℃下用自動(dòng)餾分收集器按每管2 mL收集。收集的酶液按峰合并后檢測(cè)酯酶活性，選擇酶活性高的洗脫液進(jìn)行超濾濃縮。(2)在Superdex 200柱(GE Healthcare)上進(jìn)行凝膠過濾層析。將濃縮的酶液上樣到預(yù)先用磷酸鹽緩沖液(20 mmol/L，pH 5.0)平衡的柱子上，然后用磷酸鹽緩沖液(20 mmol/L，pH 5.0)按0.5 mL/min的流速洗脫。洗脫液按每管1.0 mL收集，洗脫液按峰合并后檢測(cè)酯酶活性，選擇酶活性高的洗脫液冷凍干燥，儲(chǔ)存于-20 ℃。

1.5 酶底物和抑制劑的特異性測(cè)定

分別采用ATChI、BTChI和α-NA作為底物進(jìn)行底物特異性實(shí)驗(yàn)，并根據(jù)DTNB方法[13]進(jìn)行以ATChI和BTChI為底物的酶活性測(cè)定。

分別用毒扁豆堿、鹽酸多奈哌齊和BNPP作為抑制劑進(jìn)行酶抑制劑的特異性實(shí)驗(yàn)，并通過測(cè)定酶抑制率比較酶抑制劑的特異性。

1.6 酶濃度、溫度、pH值對(duì)酶活性的影響

為了確定酶反應(yīng)的最佳酶濃度、溫度和pH，分別在不同的酶質(zhì)量濃度0.25、0.35、0.45、0.70、1.40 μg/mL，溫度20、25、30、35、40、45、50 ℃和pH值5.5、6.0、6.5、7.0、7.5下按照1.3提供方法測(cè)定酶活性。

1.7 酶動(dòng)力學(xué)參數(shù)測(cè)定

為確定米氏常數(shù)Km和最大酶反應(yīng)速度Vmax，分別測(cè)定底物α-NA在不同濃度(0.010、0.025、0.050、0.100、0.200、0.400、0.600、0.800、1.000 mmol/L)下的酶反應(yīng)速度(即單位時(shí)間內(nèi)α-萘酚的產(chǎn)生量)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果通過Origin 8.5軟件(Origin Lab)直接進(jìn)行米氏方程的非線性回歸擬合，并計(jì)算Km和Vmax值。

1.8 農(nóng)藥對(duì)酶的抑制率測(cè)定

有機(jī)磷和氨基甲酸酯類農(nóng)藥對(duì)植物酯酶的抑制率測(cè)定根據(jù)PRUETT等報(bào)道的方法[14]并做改進(jìn)。即在96孔板中，加入50 μL不同濃度(2×10-9～2×10-3mol/L)的農(nóng)藥樣品和50 μL酶液(1 mU/mL)，混勻并在35 ℃孵育30 min，再通過1.3提供方法測(cè)定3 min的吸光度的變化。對(duì)照組在反應(yīng)體系中用50 μL蒸餾水替代農(nóng)藥樣品。根據(jù)公式(1)計(jì)算抑制率：

(1)

式中：ΔA0為對(duì)照組吸光度變化;ΔA1為樣品吸光度變化。用該方法進(jìn)行農(nóng)藥殘留檢測(cè)時(shí)，以抑制率≥50%作為農(nóng)藥被檢出的閾值[15]。

根據(jù)不同農(nóng)藥濃度對(duì)酶的抑制率，參照何紹志等[16]報(bào)道的方法，擬合酶抑制曲線方程，計(jì)算抑制率為50%時(shí)的農(nóng)藥濃度，即為該農(nóng)藥對(duì)酶的IC50值。再根據(jù)下式計(jì)算該酶應(yīng)用于酶抑制法檢測(cè)該農(nóng)藥的檢出限(LOD),如公式(2)所示。

(2)

式中：IC50為該農(nóng)藥對(duì)豌豆酯酶的IC50值(mol/L);M為該溶液的摩爾質(zhì)量(g/mol);0.5為根據(jù)國(guó)標(biāo)方法[17]有機(jī)提取液揮干后用加入0.5 mL緩沖液定容;2為果蔬樣品2.00 g;1 000為1 g等于1 000 mg。

1.9 數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換和統(tǒng)計(jì)分析

所有數(shù)據(jù)均以3個(gè)獨(dú)立樣本(n=3)的(x±SEM表示。采用SPSS 22.0 軟件(IBM)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，兩組之間數(shù)據(jù)使用Student′st檢驗(yàn)進(jìn)行比較，多組數(shù)據(jù)通過單因素方差分析后，再使用Duncan檢驗(yàn)進(jìn)行多重比較。以P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 豌豆酯酶的純化

目前已有不同來源的植物酯酶通過如離子交換層析和凝膠層析等方法被純化和表征(包括小米[18]、擬南芥[19]、麻瘋樹[11]、燕麥[20]、蘋果[21]和西葫蘆[22])。但不同來源的植物酯酶其性質(zhì)也不盡相同。

本研究主要通過Hi-Trap SP HP柱的陽離子交換層析和Superdex 200柱的凝膠過濾層析對(duì)豌豆酯酶進(jìn)行純化，表現(xiàn)出較好的純化效果。表1中給出了每個(gè)純化階段的回收率、純化倍數(shù)和比酶活性。從中可知豌豆酯酶的最終純化倍數(shù)達(dá)41倍，回收率為21.6%，比酶活性為0.695 U/mg。從陽離子交換層析的洗脫圖(圖1-A)可知，有2個(gè)蛋白峰被洗脫，峰I具有較高的酯酶活性(圖1-C)。收集峰I流分進(jìn)行凝膠過濾層析，有5個(gè)蛋白質(zhì)峰被洗脫(圖1-B)，其中峰Ⅶ具有最高的酯酶活性(圖1-C)。通過SDS-PAGE確認(rèn)純化所得的豌豆酯酶的分子質(zhì)量和純度(圖1-D)可知，純化的豌豆酯酶為單一條帶。已有的研究發(fā)現(xiàn)，大多數(shù)植物酯酶具有低分子質(zhì)量，并含有單一的多肽鏈，分子質(zhì)量范圍為20～60 kDa[23-25]。從SDS-PAGE中發(fā)現(xiàn)，豌豆酯酶的分子量約為26.0 kDa。

表1 豌豆酯酶純化效果Table 1 Purification of esterases from pea

A-Hi-Trap SP HP離子交換色譜的洗脫圖譜; B-Superdex 200凝膠過濾層析的洗脫圖譜;C-通過離子交換層析和凝膠過濾層析洗脫峰的酯酶活性; D-酯酶粗酶和純化酶的SDS-PAGE圖1 豌豆酯酶的純化和SDS-PAGEFig.1 Purification and SDS-PAGE of pea esterase注：數(shù)據(jù)以表示，用不同字母表示各組差異顯著，P <0.05。

2.2 豌豆酯酶的分類

酯酶分為羧酸酯酶(EC 3.1.1.1)，芳基酯酶(EC 3.1.1.2)，乙酰酯酶(EC 3.1.1.6)和膽堿酯酶(乙酰膽堿酯酶，EC 3.1.1.7和丁酰膽堿酯酶，EC 3.1.1.8)。其中只有羧酸酯酶和膽堿酯酶可被有機(jī)磷和氨基甲酸酯農(nóng)藥抑制，可用于農(nóng)藥檢測(cè)。

豌豆酯酶的底物特異性實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，底物的活性按α-NA> ATChI> BTChI的順序降低，且后兩者底物幾乎無酶活性(圖2-A)。因此豌豆酯酶更像羧酸酯酶。在其他豆類[26]、麻風(fēng)樹種子[11]和小米[18]酯酶的底物特異性研究中使用的苯基酯，甘油酯和萘基酯的實(shí)驗(yàn)結(jié)果也顯示，這些酯酶通常優(yōu)先水解短鏈酯。這一特異性對(duì)植物生長(zhǎng)和發(fā)育過程中短鏈脂肪酸酯的水解可能具有重要作用[27]。

A-對(duì)不同底物豌豆酯酶的活性；B-不同抑制劑對(duì)豌豆酯酶的抑制率圖2 豌豆酯酶鑒定Fig.2 Classification of pea esterase注：數(shù)據(jù)以表示，用不同字母表示各組差異顯著，P<0.05。

為了進(jìn)一步確認(rèn)豌豆酯酶的類型，分別采用酯酶廣譜抑制劑毒扁豆堿，乙酰膽堿酯酶特異抑制劑鹽酸多奈哌齊和羧酸酯酶抑制劑BNPP進(jìn)行酶抑制實(shí)驗(yàn)。酶抑制率按BNPP>毒扁豆堿>鹽酸多奈哌齊順序遞減，BNPP抑制率顯著高于后兩者(圖2-B)。由于BNPP已被證明是淡色庫蚊[28]和大鼠[23]中的羧酸酯酶特異性抑制劑。因此豌豆酶可被BNPP抑制，卻不能被鹽酸多奈哌齊[29]抑制的結(jié)果，進(jìn)一步證明了豌豆酯酶可能屬于羧酸酯酶類。

2.3 酶質(zhì)量濃度、pH和溫度對(duì)酶活性的影響和酶動(dòng)力學(xué)參數(shù)測(cè)定

從酶濃度實(shí)驗(yàn)可知酶濃度對(duì)酶促反應(yīng)有顯著影響(圖3-A)。隨著酶質(zhì)量濃度的增加，550 nm的吸光度值也增大，呈現(xiàn)濃度依賴性。然而，根據(jù)朗伯比爾定律，測(cè)定底物濃度的線性范圍在吸光度0.2～0.8，所以0.45 μg/mL為最佳酶質(zhì)量濃度。

A-不同酶濃度下的酶反應(yīng)的吸光度；B-不同溫度下的豌豆酯酶活性；C-不同pH值的豌豆酯酶活性；D-以α-NA為底物的豌豆酯酶的米氏方程非線性回歸曲線圖3 酶質(zhì)量濃度、pH和溫度對(duì)酶活性的影響和酶動(dòng)力學(xué)參數(shù)測(cè)定Fig.3 Effects of enzyme concentration, pH and temperature on enzyme activity and enzyme kinetics注：數(shù)據(jù)以表示，用不同字母表示各組差異顯著，P<0.05。

為了優(yōu)化反應(yīng)溫度，在20～50 ℃測(cè)定酶活性。隨著溫度的升高，酶促反應(yīng)加速，使酶活性升高，但在高溫下酶活可能由于蛋白質(zhì)變性而受到抑制，該酶的最適反應(yīng)溫度為40 ℃(圖3-B)。其他植物酯酶如來源于小米[18]、大戟科植物[25]和西葫蘆[22]的酯酶的最適溫度也在上述范圍內(nèi)。

pH值也可以顯著影響酶活性，每種酶都具有最適的pH范圍。在植物酯酶中，小麥[7-8]的最適pH為6.5，黧豆屬種子[24]的最佳pH為7.0，小米[18]和大戟科植物[25]的最適pH為7.5。豌豆酯酶在5.5～7.5的pH范圍內(nèi)均顯示出活性，但在pH 6.5時(shí)觀察到最大的酶活性(圖3-C)。

米氏常數(shù)Km值可近似表征酶與底物的親和力。根據(jù)米氏方程進(jìn)行非線性回歸(圖3-D)確定了豌豆酯酶作用于α-NA的Km和Vmax值分別為0.119 mmol/L和9.23 μmol/min。

2.4 豌豆酯酶粗酶和純化酶的對(duì)農(nóng)藥的敏感性

根據(jù)酯酶與農(nóng)藥的相互作用，一般將酯酶分為3種類型，A型酯酶不受有機(jī)磷農(nóng)藥抑制，卻能水解有機(jī)磷農(nóng)藥，C型酯酶不水解有機(jī)磷農(nóng)藥，也不被有機(jī)磷農(nóng)藥抑制[30]。只有B型酯酶很容易被有機(jī)磷農(nóng)藥抑制，可用于農(nóng)藥檢測(cè)。

為了解豌豆酯酶對(duì)農(nóng)藥的敏感性，對(duì)不同濃度(2×10-9～2×10-3mol/L)的8種有機(jī)磷農(nóng)藥和4種氨基甲酸酯農(nóng)藥進(jìn)行酶抑制率測(cè)定。當(dāng)使用酶抑制法檢測(cè)農(nóng)藥時(shí)，通常以酶抑制率大于或等于50%作為樣品中農(nóng)藥被檢出的閾值。因此，可以使用IC50值來計(jì)算豌豆酯酶用于農(nóng)殘檢測(cè)的LOD值。表2中列出了豌豆酯酶粗酶和純化酶的對(duì)不同農(nóng)藥的IC50值和LOD值，并將其與不同農(nóng)藥的最大殘留限量值(MRL)[31]進(jìn)行比較。

從表2中可知，純化后的豌豆酯酶IC50值均小于粗酶，這意味著對(duì)農(nóng)藥的檢測(cè)靈敏度顯著提高。通過純化使得豌豆酯酶對(duì)一些農(nóng)藥的檢出限達(dá)到MRL。然而，仍有2種有機(jī)磷農(nóng)藥(久效磷，毒死蜱)的檢出限高于其MRL，說明豌豆酯酶對(duì)不同類型農(nóng)藥的敏感性差異較大。該結(jié)果表明，豌豆酯酶(B型酯酶)可以代替AChE用于酶抑制法檢測(cè)有機(jī)磷農(nóng)藥和氨基甲酸酯農(nóng)藥。

3 結(jié)論

本研究從豌豆中提取的植物酯酶通過陽離子交換層析和凝膠過濾層析被純化。通過底物和抑制劑特異性實(shí)驗(yàn)將豌豆酯酶鑒定為羧酸酯酶。豌豆酯酶在酶濃度為0.45 μg/mL，緩沖液pH 6.5和反應(yīng)溫度40 ℃時(shí)，具有最好的催化活性。有機(jī)磷和氨基甲酸酯農(nóng)藥可抑制豌豆酯酶活性。這表明豌豆酯酶屬于B型酯酶，因此可以代替AChE，用于酶抑制法檢測(cè)有機(jī)磷和氨基甲酸酯類農(nóng)藥殘留。經(jīng)過純化的豌豆酯酶通過酶抑制法檢測(cè)農(nóng)藥的LOD值顯著低于粗酶，滿足大多數(shù)農(nóng)藥MRL檢測(cè)的要求。