香芹酚處理對(duì)枸杞鮮果采后黑霉病的控制

王軍節(jié),李貞彪,張懷予,王 鵬,范春霞,陳善貴,崔美麗,鄧淑芳,趙魯迺克

(1.北方民族大學(xué)植物性農(nóng)產(chǎn)品貯藏與加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,寧夏銀川 750021;2.北方民族大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院,寧夏銀川 750021;3.江西楓樹(shù)食品生態(tài)科技有限公司,江西宜春 330700)

寧夏枸杞(LyciumbarbarumL.)果實(shí)因富含營(yíng)養(yǎng)和活性成分而成為理想藥食資源,在國(guó)內(nèi)外市場(chǎng)享有盛譽(yù)[1-3]。目前,該果主要以干制、榨汁和釀酒等加工產(chǎn)品進(jìn)行商業(yè)化流通,但加工過(guò)程會(huì)造成其營(yíng)養(yǎng)和活性成分損失[4-6]。隨著消費(fèi)者對(duì)天然且新鮮果品的日益追求,其活性成分得以最大程度保留的鮮果市場(chǎng)份額將日益增大[7-8]。

枸杞漿果小而多汁,組織極易遭受真菌侵染而腐爛變質(zhì)[9-10]。鏈格孢是引起枸杞霉變的主要病原菌[11-12],因其具有潛伏侵染和耐低溫能力已成為鮮果冷鏈物流中主要問(wèn)題[13-14]。雖然殺菌劑戴挫霉可有效控制枸杞鮮果采后病害,但存在環(huán)境污染、食品安全和抗藥性等問(wèn)題,因此開(kāi)發(fā)新型安全控制防腐措施十分必要[15]。

植物精油是植物體內(nèi)具有較強(qiáng)揮發(fā)性的次生代謝產(chǎn)物,具有明顯的抑菌活性、低毒且對(duì)環(huán)境影響小,已被證明是一種具有控制采后病害潛力的安全措施[16]。這其中,香芹酚(2-甲基-5-異丙基苯酚)是一種來(lái)自牛至和百里香等植物精油,因其天然安全和良好抑菌活性，在美國(guó)和歐洲被批準(zhǔn)為食品添加劑[17-18]。研究發(fā)現(xiàn),香芹酚能控制炭疽菌(Colletotrichumgloeosporioides)、根霉(Rhizopusstolonifer)和曲霉(Aspergillusflavus)等病原引起的荔枝炭疽病[19]、桃軟腐病[20]和櫻桃番茄[21]腐爛等采后病害。然而,有關(guān)香芹酚對(duì)鏈格孢菌的直接作用以及對(duì)枸杞黑霉病抑制效果的研究鮮有報(bào)道。

本試驗(yàn)以鏈格孢菌為研究對(duì)象,通過(guò)體外分析香芹酚對(duì)其菌絲擴(kuò)展、孢子萌發(fā)和超微結(jié)構(gòu)的影響,并調(diào)查香芹酚對(duì)寧夏枸杞鮮果黑霉病發(fā)病率和病斑擴(kuò)展抑制效果,以及分析測(cè)定處理后果實(shí)體內(nèi)過(guò)氧化物酶和苯丙氨酸解氨酶的活性,以期探明香芹酚控制枸杞黑霉病效果和初步機(jī)制,旨在為香芹酚控制寧夏枸杞采后黑霉病機(jī)制提供依據(jù),也為開(kāi)發(fā)枸杞采后綠色安全防腐劑奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

寧杞5號(hào)(LyciumbarbarumL.cv.Ningqi 5) 分別于2017年7月和2018年9月購(gòu)于寧夏農(nóng)林科學(xué)院枸杞研究所,挑選無(wú)病蟲(chóng)害、大小均一的鮮果;鏈格孢菌(Alternariaalternata) 從采后枸杞自然發(fā)生黑霉病害部位中分離而得;葡萄糖、瓊脂粉等 分析純,均購(gòu)于天津市大茂化學(xué)試劑廠;香芹酚 純度為98.0%,梯希愛(ài)(上海)化成工業(yè)發(fā)展有限公司。

YXQ-LS-50A立式壓力蒸汽滅菌器 上海博迅醫(yī)療生物儀器股分有限公司;SW-CJ-2F超凈工作臺(tái) 蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司;HPS-250生化培養(yǎng)箱 中國(guó)哈爾濱東聯(lián)電子技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司;BA210-T生物顯微鏡 麥克奧迪實(shí)業(yè)集團(tuán)有限公司;S-3400N掃描式電子顯微鏡 日本日立高新技術(shù)有限公司;UV-9000S紫外可見(jiàn)分光光度計(jì) 上海元析儀器有限公司;H2100R高速冷凍離心機(jī) 湘儀離心機(jī)儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 香芹酚處理對(duì)鏈格孢菌體外抑制效果測(cè)定

1.2.1.1 病原菌的分離及純化 采集有黑霉病癥狀的枸杞果實(shí),用75%乙醇進(jìn)行果實(shí)表面消毒,再用無(wú)菌水沖洗后切取病健交界處的組織,在無(wú)菌條件下移至馬鈴薯葡萄糖(PDA)培養(yǎng)基上,然后置于28 ℃保溫培養(yǎng),待其長(zhǎng)出分生孢子后再進(jìn)行單孢子純化,并通過(guò)回接試驗(yàn)確定其致病性[22]。分離純化的病原物在馬鈴薯葡萄糖(PDA)培養(yǎng)基上保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.1.2 香芹酚對(duì)鏈格孢菌絲生長(zhǎng)的影響 參照Yao等[23]的方法并作改進(jìn)。將濃度分別為0、0.5、1、2、4和8 μL/L的香芹酚加入已滅菌并冷卻至45 ℃的PDA培養(yǎng)基中。再打取0.5 cm的鏈格孢菌菌餅接種在凝固后的培養(yǎng)基中心,于28 ℃避光條件培養(yǎng)7 d后,用十字交叉法測(cè)量菌落直徑,每個(gè)處理3次重復(fù)。

1.2.1.3 香芹酚對(duì)孢子萌發(fā)的影響 參照Liu等[24]方法并修改。香芹酚分別加入含4 mL PDB培養(yǎng)基的試管中,使其最終濃度分別為0、1、2、4和8 μL/L,再加入400 μL 振蕩均勻的濃度為1×106個(gè)/mL的孢子懸浮液,于28 ℃培養(yǎng)。每隔4 h用顯微鏡觀察孢子萌發(fā)情況,每次觀察至少200個(gè)孢子,重復(fù)3次。

1.2.1.4 香芹酚對(duì)菌落形態(tài)及菌絲超微結(jié)構(gòu)的影響 參照吳靜等[25]方法并做修改。取抑制效果最佳的含藥物PDA平板及對(duì)照組菌餅(3.0 mm×3.0 mm)若干,用體積分?jǐn)?shù)為2% 的戊二醛在4 ℃冰箱中固定2 h后,換用0.1 mol/L二甲砷酸鈉緩沖液浸泡3次,每次間隔2 h;后固定階段,除去菌餅中的緩沖液,加入體積分?jǐn)?shù)為1%鋨酸溶液將菌絲表面覆蓋,浸泡2 h,固定階段在4 ℃下進(jìn)行。脫水處理階段,用體積分?jǐn)?shù)為30%、50%、70%(4 ℃條件下進(jìn)行)、80%、90%(室溫下進(jìn)行)的系列乙醇脫水,每次10 min,再用100%乙醇脫水2次,每次15 min。75%的叔丁醇置換20 min后放置于-20 ℃冰箱中30 min。最后樣品用臨界點(diǎn)干燥器干燥。制好的掃描電鏡標(biāo)本在S-3400N掃描式電子顯微鏡下觀察并在相同倍數(shù)下收集對(duì)照組和處理組的照片。

1.2.2 香芹酚處理對(duì)果實(shí)抗病性的影響

1.2.2.1 枸杞的熏蒸處理 選擇大小、果色均勻一致、無(wú)傷無(wú)病、未經(jīng)處理的枸杞果實(shí),用75%乙醇擦拭果實(shí)表面消毒并晾干酒精,將80個(gè)左右的枸杞鮮果放入聚苯乙烯盒(PE)中,在盒蓋子中心用透明膠帶貼一張濾紙,并在蓋子中心打直徑為2 mm左右的小孔,按0、1、2、4和8 μL/L濃度梯度從不同盒子的小孔分別加香芹酚溶液到濾紙上,立即將小孔和蓋子完全密封熏蒸處理24 h,處理結(jié)束打開(kāi)蓋子平衡6 h[26]。處理果實(shí)于PE保鮮盒中在(25±2) ℃、RH 85%～95%條件下貯藏待用。

1.2.2.2 香芹酚處理對(duì)枸杞果實(shí)黑霉病的控制 取在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)7 d的鏈格孢菌,用無(wú)菌蒸餾水配制濃度為1×106個(gè)/mL孢子懸浮液[27]。用75%乙醇擦拭枸杞果實(shí)表面消毒,接種針經(jīng)酒精燈火焰滅菌并晾涼,取出香芹酚熏蒸處理24 h后的枸杞果實(shí),在每個(gè)果實(shí)赤道部位刺1 mm大小均勻的孔,并在孔內(nèi)接種2 μL孢子懸浮液,晾干后果實(shí)放入PE保鮮盒中并置于(25±2) ℃、RH 85%～95%貯藏。按下式計(jì)算發(fā)病率;用游標(biāo)卡尺進(jìn)行十字交叉法測(cè)量病斑直徑,并計(jì)算病斑面積,每個(gè)處理重復(fù)3次。

1.2.2.3 POD和PAL酶活性測(cè)定 分別取室溫貯藏0、1、2、3、4、5 d各個(gè)處理果實(shí)進(jìn)行酶活測(cè)定樣品制備。首先將枸杞籽去除,然后將果肉組織混勻并用錫箔紙包裹,液氮速凍后在-80 ℃超低溫冰箱中保存待用。每個(gè)時(shí)間點(diǎn)每處理用果30個(gè),重復(fù)3次。

POD活性測(cè)定:參照Wang等[28]方法并修改。取3.0 g果肉組織,加3 mL pH7.5的50 mmol/L磷酸提取緩沖液(內(nèi)含4% PVP(W/V),1 mmol/L聚乙二醇,1 mmol/L苯甲基磺酰氟(PMSF),0.01% TritonX-100(V/V)),冰浴條件下研磨成勻漿,4 ℃ 15000×g條件下離心20 min,取上清液為粗酶液。POD酶活反應(yīng)體系為:2.7 mL 25 mmol/L愈創(chuàng)木酚、50 μL粗酶提取液和250 μL 250 mmol/L H2O2,分別加入后迅速混合,記錄反應(yīng)體系在波長(zhǎng)470 nm處的吸光度,觀察3 min內(nèi)吸光度的變化并每隔1 min記錄1次吸光度。酶活以每分鐘內(nèi)OD470變化為1個(gè)活力單位U,活性表示為每克鮮重果肉組織活性,即為U/g FW,每樣品重復(fù)測(cè)3次。

PAL活性測(cè)定:參照Wang等[28]方法并修改。取3.0 g果肉組織,加入3 mL 0.1 mol/L的硼酸緩沖液(pH8.8,內(nèi)含10% PVP(W/V),1 mmol/L EDTA 和50 mmol/Lβ-巰基乙醇),冰浴條件下充分研磨,然后于4 ℃ 15000×g條件下離心30 min,收集上清液并立即用于酶活性測(cè)定。PAL酶活性反應(yīng)體系為:2.7 mL 7 mmol/L底物混合液(L-苯丙氨酸用硼酸緩沖液配置),20 μL粗酶液,30 ℃下反應(yīng)30 min,立即加入200 μL 6 mol/L HCl終止反應(yīng)。在290 nm處測(cè)定吸光度值,酶活以每分鐘內(nèi)OD290變化為1個(gè)活力單位U,活性表示每克鮮重果肉組織活性,即為U/g FW,每樣品重復(fù)測(cè)3次。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用SPSS 16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理,計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)偏差或進(jìn)行Duncan’s多重差異顯著性分析,p<0.05時(shí)為差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 香芹酚處理對(duì)鏈格孢菌的體外抑制效果

2.1.1 香芹酚對(duì)鏈格孢菌菌絲生長(zhǎng)的影響 香芹酚處理對(duì)鏈格孢菌菌落直徑擴(kuò)展的影響如圖1所示。由圖可知,不同濃度香芹酚處理均能顯著抑制菌落直徑擴(kuò)展,菌落直徑隨著香芹酚濃度增加而減小,其中0.5和1 μL/L濃度處理后菌落直徑無(wú)顯著差異,而8 μL/L濃度處理菌落直徑為1.6 cm,僅為對(duì)照的19.19%。因此,8 μL/L對(duì)鏈格孢菌菌落生長(zhǎng)抑制效果最佳。

圖1 香芹酚處理對(duì)鏈格孢菌落直徑擴(kuò)展的影響

2.1.2 香芹酚對(duì)鏈格孢菌孢子萌發(fā)的影響 香芹酚處理對(duì)鏈格孢菌孢子萌發(fā)的影響如圖2所示。由圖可知,鏈格孢孢子萌發(fā)率隨培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸增加,香芹酚處理后鏈格孢的孢子萌發(fā)率在各時(shí)間段內(nèi)均顯著低于對(duì)照,且濃度越大,抑制效果越明顯,但低濃度香芹酚(<4 μL/L)處理鏈格孢的孢子萌發(fā)抑制效果不明顯。而在16 h時(shí),8 μL/L高濃度香芹酚處理組其孢子萌發(fā)率僅為38.5%,顯著低于對(duì)照組的萌發(fā)率(89.9%)(p<0.05)。因此,8 μL/L對(duì)鏈格孢菌孢子萌發(fā)抑制效果最好。

圖2 香芹酚處理對(duì)鏈格孢菌孢子萌發(fā)的影響

2.1.3 香芹酚對(duì)鏈格孢菌菌絲和孢子形態(tài)超微結(jié)構(gòu)的影響 香芹酚處理對(duì)鏈格孢菌菌絲和孢子形態(tài)超微結(jié)構(gòu)的影響如圖3所示。由圖可知,在500倍掃描電鏡下觀察發(fā)現(xiàn)對(duì)照組的菌絲粗細(xì)均勻,沒(méi)有出現(xiàn)不規(guī)則分支、塌陷等現(xiàn)象(圖3A),香芹酚處理過(guò)的鏈格孢菌絲量較少,表面粗糙,出現(xiàn)不規(guī)則分支,粗細(xì)不均勻,折疊扭曲盤(pán)繞,部分出現(xiàn)塌陷變形現(xiàn)象(圖3B)。在5000倍掃描電鏡下觀察發(fā)現(xiàn)處理組的孢子數(shù)量較對(duì)照組稀疏(圖3C、圖3D),處理組孢子表面有白色粒狀物且細(xì)胞腫脹變形(圖3D)。

圖3 香芹酚對(duì)鏈格孢菌絲和孢子形態(tài)超微結(jié)構(gòu)的影響

2.2 香芹酚處理對(duì)果實(shí)抗病性的影響

2.2.1 香芹酚處理對(duì)枸杞果實(shí)黑霉病發(fā)病率和病斑面積的影響 不同濃度的香芹酚處理枸杞果實(shí)后損傷接種A.alternata,發(fā)病率和病斑面積均隨著貯藏時(shí)間延長(zhǎng)而增加(圖4)。4 μL/L能顯著抑制2 d后黑霉病的發(fā)病率,該濃度處理后2、3、4 d的發(fā)病率分別比同期對(duì)照低33.3%、60%和39.99%(圖4A)。接種第4 d僅4 μL/L的香芹酚處理顯著抑制了病斑的擴(kuò)展,隨著時(shí)間延長(zhǎng),其它濃度香芹酚處理也能顯著抑制病斑面積擴(kuò)展,其中以4 μL/L效果最佳(圖4B)。

圖4 香芹酚處理對(duì)枸杞果實(shí)損傷接種黑霉病發(fā)病率(A)和病斑面積(B)的影響

2.2.2 香芹酚處理對(duì)果實(shí)過(guò)氧化酶和苯丙氨酸解氨酶活性的影響 香芹酚處理對(duì)枸杞果實(shí)POD和PAL活性的影響如圖5所示。枸杞果實(shí)短期貯藏期間POD活性呈先降低后略有升高趨勢(shì),各個(gè)濃度香芹酚處理均能提高短期貯藏(2～5 d)POD活性,其中4 μL/L效果最明顯(圖5A),該濃度香芹酚處理后果實(shí)第2、3、4、5 d的POD活性分別為同期對(duì)照的2.24、1.55、2.09和1.55倍(圖5A)。PAL在短期貯藏期間呈先略有降低再略有升高趨勢(shì),4 μL/L在處理2 d后的各個(gè)階段均顯著高于對(duì)照,其中第3、4、5 d最明顯,分別比同期對(duì)照高33.34%、52.04%和27.41%(圖5B)。

圖5 香芹酚處理對(duì)枸杞果實(shí)POD(A)和PAL(B)活性的影響

3 討論與結(jié)論

本研究體外試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn):不同濃度香芹酚對(duì)鏈格孢菌的體外抑制效果存在濃度依賴(lài)效應(yīng)。該結(jié)果與王新偉等[29]研究香芹酚對(duì)黑曲霉、胡珊等[19]研究香芹酚等多種精油對(duì)荔枝炭疽病菌(Colletotrichumgloeosporioides)、以及Pérez-Alfonso等[30]研究香芹酚對(duì)青霉(Penicilliumitalicium)作用效果基本一致。電鏡觀察結(jié)果表明:香芹酚對(duì)鏈格孢菌絲和孢子形態(tài)超微結(jié)構(gòu)產(chǎn)生了破壞作用,由此推測(cè)香芹酚可能是通過(guò)改變菌絲體及孢子的細(xì)胞膜和細(xì)胞壁等細(xì)胞器的形態(tài)結(jié)構(gòu),造成細(xì)胞不可逆損傷,最終導(dǎo)致微生物死亡[31];或者是通過(guò)影響病原菌的細(xì)胞代謝從而來(lái)抑制菌絲生長(zhǎng)和孢子萌發(fā)[32-33];此外,香芹酚是一種酚類(lèi)化合物,酚可以與膜蛋白相互作用,這可能導(dǎo)致膜結(jié)構(gòu)和功能的變形[32],而膜的變形和功能障礙可干擾真菌細(xì)胞內(nèi)ATP的產(chǎn)生,主要抑制ATP產(chǎn)生的酶和底物使用[34-35],最終表現(xiàn)出對(duì)病原真菌很強(qiáng)的抑制能力。

香芹酚處理能夠抑制損傷接種果實(shí)的發(fā)病率和病斑面積的擴(kuò)展,并且對(duì)黑霉病控制與誘導(dǎo)果實(shí)POD和PAL活性相關(guān)。POD 是植物體內(nèi)重要的抗氧化酶,在植物抵抗病原菌中發(fā)揮重要作用,可以通過(guò)催化H2O2和酚類(lèi)物質(zhì)聚合增強(qiáng)結(jié)構(gòu)抗性[27]。PAL為苯丙烷代謝途徑中的第一關(guān)鍵酶,參與酚類(lèi)、植保素和木質(zhì)素等抗菌物質(zhì)的合成來(lái)提高植物的防衛(wèi)反應(yīng)[36-37]。因此,香芹酚處理枸杞提高了果實(shí)POD和PAL活性有利于其抵抗黑霉病。汪開(kāi)拓等[38]研究表明茉莉酸甲酯(MeJA)處理可顯著抑制葡萄果實(shí)在貯藏期間腐爛率和失重率的上升,同時(shí)可顯著誘導(dǎo)植保素合成相關(guān)酶的活性來(lái)提高果實(shí)抗病性。潘磊慶等[39]研究發(fā)現(xiàn)丁香精油可有效抑制灰葡萄孢及匍枝根霉的生長(zhǎng),并誘導(dǎo)櫻桃番茄防御性酶POD活性的升高。王雙輝等[40]研究發(fā)現(xiàn)香芹酚浸泡處理能顯著降低楊梅果實(shí)的腐爛程度,表現(xiàn)出良好的抑菌效果。由此可知,香芹酚不但具有對(duì)病原菌直接治愈效果,還能通過(guò)誘導(dǎo)抗病性起到預(yù)防目的,具有控制枸杞鮮果采后黑霉病潛力。但有關(guān)香芹酚的直接抑菌和誘導(dǎo)抗性的深層機(jī)理尚有待進(jìn)一步研究。