新鮮及干燥槲樹葉揮發(fā)油的GC-MS分析及β-葡萄糖苷酶對其增香作用的研究

張麗娜，孟憲鑫，高玉瓊,郭利影,楊廣德,楊范莉

西安交通大學(xué)藥學(xué)院，西安710061

槲樹葉，又名槲若或槲葉，為殼斗科(Fagaceae)櫟屬(QuercusL.)植物槲樹(QuercusdentataThunb.)的葉。分布于東北、西南及華南各省，生于海拔2 700 m以下的山地陽坡及半陽坡[1]。自《唐本草》起就有關(guān)于槲樹葉的記錄“其味甘苦，平，無毒，主痔、止血，血痢，止渴?！薄侗静菥V目》上記載“槲樹葉具有活血，利小便，除面上齄赤，孩子淋疾?！爆F(xiàn)代研究表明其可用于治療結(jié)石[2]。多年以來槲葉的應(yīng)用價(jià)值逐漸得到開發(fā)，從早期用于養(yǎng)蠶加工絲織品到作為純天然綠色食品包裝材料遠(yuǎn)銷日韓；加工生產(chǎn)一次性可降解槲葉保健餐具[3-5]。此外我國部分地區(qū)形成的以槲樹葉包粽子的習(xí)俗，具有獨(dú)特外觀、清香的氣息的槲包也將逐漸走向商品化生產(chǎn)。在其利用價(jià)值不斷擴(kuò)大的同時(shí)則需要相關(guān)的理論依據(jù)作為支撐，然而關(guān)于槲樹的研究較少，對于槲樹葉的化學(xué)成分的研究也只有少數(shù)報(bào)道[6-12]。揮發(fā)油作為天然植物中含有的一類具有活性的物質(zhì)，在抗菌、抗炎、抗氧化等方面都顯示較好的藥理活性，一直以來都受到人們的關(guān)注[13-16]。因此本次研究將結(jié)合GC-MS對槲樹葉揮發(fā)油成分進(jìn)行分析，為以后槲葉的研究提供可科學(xué)依據(jù)。

β-葡萄糖苷酶是一種糖苷水解酶，可水解葡萄糖苷鍵釋放苷元，植物中以苷形式存在的非揮發(fā)性前體物質(zhì)可以通過酶解作用使得香氣成分得以釋放表現(xiàn)出顯著的增香作用[17,18]。本次研究通過比較β-葡萄糖苷酶加入前后其化學(xué)成分的變化研究酶對槲樹葉的增香作用。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

材料：新鮮槲樹葉及自然陰干槲樹葉，新鮮槲樹葉于2018年6月采自河南省三門峽市盧氏縣，由西安交通大學(xué)藥學(xué)院牛曉峰教授鑒定為殼斗科櫟屬植物槲樹(QuercusdentataThunb.)的葉。

試劑：β-葡萄糖苷酶(上海源葉生物科技有限公司，100 u/g)；正己烷(上海阿拉丁生化科技股份有限公司，色譜純)；無水硫酸鈉(西安化學(xué)試劑廠)；磷酸氫二鈉(河南焦作市化工三廠)；檸檬酸(成都化學(xué)試劑廠)。

儀器：GCMS-TQ8040型氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(日本島津公司)；AY120電子天平(日本島津公司)。

1.2 方法

1.2.1β-葡萄糖苷酶水解反應(yīng)

分別稱取兩份10 g新鮮槲樹葉(干燥槲樹葉)于250 mL pH5.0的磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖溶液中，一份加0.2 gβ-葡萄糖苷酶，另一份為空白對照。同時(shí)置于恒溫?fù)u床中50 °C水浴5 h。

1.2.2 揮發(fā)油的提取

水浴5 h后新鮮槲樹葉(或干燥槲樹葉)及加酶槲樹葉采用水蒸氣蒸餾方法加熱保持微沸狀態(tài)提取5 h，餾液用正己烷萃取，過無水硫酸鈉小柱定容至10 mL，濾過既得揮發(fā)油。

1.2.3 氣相色譜-質(zhì)譜分析

1.2.3.1 色譜條件

色譜柱：SHIMADZU SH-Rxi-5sil MS毛細(xì)管柱(30 m×0.1 mm×0.25 μm)；進(jìn)樣量：1 μL；載氣：He(≥99.99%)；流速：1 mL/min；分流比：5∶1；進(jìn)樣口溫度：280 °C；接口溫度：280 °C；升溫程序：色譜柱始溫70 °C，保持2 min，3 °C/min升溫至210 °C，保持5 min，15 °C/min升溫至280 °C，保持15 min。

1.2.3.2 質(zhì)譜條件

離子源：EI；離子源電壓：60 ev；離子源溫度：250 °C；質(zhì)量掃描范圍：45～550m/z；溶劑峰切除時(shí)間為2.5 min，質(zhì)譜檢測起測時(shí)間為3.0 min。

1.2.4 數(shù)據(jù)處理

所得的色譜和質(zhì)譜信息經(jīng)數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)與其內(nèi)存譜庫(NIST)自動(dòng)檢索和解析，并用峰面積歸一法測定了各化學(xué)成分在揮發(fā)油中的相對百分含量。

2 結(jié)果

經(jīng)GC-MS分析并結(jié)合NIST譜庫檢索，鑒定出新鮮槲樹葉32種化合物，干燥槲樹葉72種化合物?？傠x子流量圖及相應(yīng)化合物分析表如下：

圖1 干燥槲樹葉揮發(fā)油的GC-MS總離子流圖Fig.1 GC-MS total ion flow diagram of essential oil from dried quercus dentata Thunb leaves

2.1 新鮮及干燥槲樹葉揮發(fā)油成分分析

對表1研究發(fā)現(xiàn)新鮮及干燥槲樹葉中所含主要成分可分為五類：醇類、醛酮類、烯烴類、酯類及雜環(huán)類。由表1可知，新鮮槲葉中醇類成分11種，相對含量26.70%。其中以葉醇(10.21%)、反式-2-己烯-1-醇(2.19%)、正己醇(2.81%)、香葉醇(3.56%)、A-畢橙茄醇(3.09%)含量較高；烯烴類成分5種，相對含量13.03%。其中以8-1,5-二甲基-1,5-二烯-環(huán)癸烷(2.79%)、α-法呢烯(7.34%)含量較高；醛酮類成分7種，相對含量14.47%。其中以壬醛(5.24%)、4-(2,3,4,6-四甲基苯異丙烯基-基)-3-丁烯-2-酮(2.48%)、3,3,6,6-四甲基-3,6,7,8-四氫-茚-1(2H)-酮(3.93%)相對含量較高；酯類成分3種，相對含量為3.19%；雜環(huán)類成分1種，相對含量11.06%，即1,2,3,4,7-五甲基-1H-吲哚。此外還有一些酚如2-甲氧基-5-丙-2-烯基苯酚(11.34%)、酸如棕櫚酸(15.09%)及短鏈烷烴類成分等。

圖2 新鮮槲樹葉揮發(fā)油的GC-MS總離子流圖Fig.2 GC-MS total ion flow diagram of essential oil from fresh Quercus dentata Thunb leaves

表1 槲樹葉揮發(fā)油化學(xué)成分分析表Table 1 Analysis of Chemical constituents of volatile oil from Quercus dentata Thunb leaves

續(xù)表1(Continued Tab.1)

種類Group保留時(shí)間Retention time(min)化合物Compounds分子式Molecular formula相對峰面積Relative peak area(%)鮮槲樹葉Fresh Quercus dentata Thunbleaves鮮槲樹葉?Fresh Quercus dentata Thunbleaves干槲樹葉Dried Quercus dentata Thunbleaves干槲樹葉?Dried Quercus dentata Thunbleaves32.844(+/-)-沉香螺萜醇 (+/-)-agarospirol C15H26O1.6932.855茅蒼術(shù)醇 agarospirol C15H26O0.280.3532.944(1R,4S,4aR,8aR)-4-異丙基-1,6-二甲基-1,2,3,4,4a,7,8,8a-八氫萘-1-醇 (1R,4S,4aR,8aR)-4-isopropyl-1,6-dimethyl-1,2,3,4,4a,7,8,8a-octahydronaphthalen-1-olC15H26O1.521.521.141.4633.155(1R,4S,4aR,8aS)-1,6-二甲基-4-丙-2-基-3,4,4a,7,8,8a-六氫-2H-萘-1-醇 (1R,4S,4aR,8aS)-1,6-dimethyl-4-propan-2-yl-3,4,4a,7,8,8a-hexahydro-2H-naphthalen-1-olC15H26O0.130.1033.459A-畢橙茄醇 (-)-a-cadinol C15H26O3.095.643.174.47醛酮Aldehydeone3.4372-已烯醛 (2E)-hexenal C6H10O2.991.494.242庚醛 heptanal C7H14O0.190.165.665苯甲醛 benzaldehyde C7H6O0.680.377.003(E,E)-2,4-庚二烯醛 (E,E)-2,4-heptadienal C7H10O0.188.066苯乙醛 phenylacetaldehyde C8H8O1.031.140.720.3410.293壬醛 nonanal C9H18O5.246.253.172.3311.204龍腦烯醛 α-campholenaldehyde C10H16O0.250.4212.201反,反-2,6-壬二烯醛 (E,E)-2,6-nonadienal C9H14O0.5512.517反式-2-壬醛 (2E)-2-nonenal C9H16O0.1415.067β-環(huán)檸檬醛 β-cyclocitral C10H16O0.580.440.4215.876檸檬醛 b neral C10H16O0.200.1816.119D-香芹酮 (+)-carvone C10H14O5.2616.936反式-2-癸烯醛 (2E)-2-decenal C10H18O0.490.740.130.1917.174檸檬醛 a citral C10H16O0.300.2117.744紫羅蘭酮 lonone C13H20O0.500.310.4218.9982-羥基-5-甲基苯乙酮1-(2-hydroxy-5-methylphenyl)ethanone C9H10O20.800.690.320.2926.320β-紫羅蘭酮 β-lonone C13H20O1.181.0027.625二環(huán)己基甲酮 dicyclohexyl ketone C13H22O0.210.2235.799十四醛 tetradecanal C14H28O0.3935.804十五醛 pentadecanal C15H30O0.721.6236.2424'-叔丁基-2',6'-二甲基苯丁酮1-(4-tertbutyl-2,6-dimethylphenyl)butan-1-one C16H24O0.5637.8204-(2,3,4,6-四甲基苯基)-3-丁烯-2-酮 4-(2,3,4,6-tetramethylphenyl)-3-buten-2-one C14 H18 O2.481.751.722.1039.540十六醛 1-hexadecanal C16H32O0.090.4340.417植酮 6,10,14-trimethyl-2-pentadecanone C18H36O0.550.240.3042.1133,3,6,6-四甲基-3,6,7,8-四氫-茚-1(2H)-酮 3,3,6,6-tetramethyl-3,6,7,8-tetrahydro-as-indacen-1(2H)-one C16H20O3.934.013.003.4942.763法尼基丙酮 farnesyl acetone C20H34O0.23

續(xù)表1(Continued Tab.1)

種類Group保留時(shí)間Retention time(min)化合物Compounds分子式Molecular formula相對峰面積Relative peak area(%)鮮槲樹葉Fresh Quercus dentata Thunbleaves鮮槲樹葉?Fresh Quercus dentata Thunbleaves干槲樹葉Dried Quercus dentata Thunbleaves干槲樹葉?Dried Quercus dentata Thunbleaves烯Alkene5.0412-蒎烯 pinene C10H1623.7723.895.450莰烯 (+)-camphene C10H160.830.835.540 4-亞甲基-1-(1-甲基乙基)-二環(huán)[3.1.0]己-2-烯 4-methylene-1-(1-methylethyl)-bicyclo[3.1.0]hex-2-ene C10H140.120.225.993檜烯 (±)-sabinene C10H160.120.136.161(-)-β-蒎烯 (-)-β-pinene C10H161.591.567.500P-傘花烴 P-cymene C10H140.610.157.662(+)-檸檬烯 (+)-(R)-limonene C10H162.100.537.819(3E)-3,7-二甲基-1,3,6-辛三烯 (3E)-3,7-dimethyl-1,3,6-octatriene C10H160.2421.970(-)-α-蒎烯 (-)-α-pinene C15H240.1022.321β-波旁烯 (-)-β-bourbonene C15H241.801.810.590.2623.408長葉烯(+)-longifolene C15H241.802.4923.852β-石竹烯 (-)-β-caryophyllene C15H242.471.8824.282白菖烯 1,1,7,7a-tetramethyl-2,3,5,6,7,7b-hexahydro-1aH-cyclopropa[a]naphthalen C15H240.710.6026.200異長葉烯 isolongifolene C15H240.100.2226.438環(huán)賽車烯 cycloseychellene C15H240.5026.4458-異丙烯基-1,5-二甲基-1,5-二烯-環(huán)癸烷 (1E,6E,8S)-1-methyl-5-methylene-8-(1-methylethyl)-1,6-cyclodecadiene C15H242.793.981.1426.895(+)-喇叭烯 viridiflorene C15H240.1827.210α-衣蘭油烯 α-muurolene C15H240.390.680.200.2927.473α-法呢烯 (E,E)-α-farnesene C15H247.342.720.270.2928.921α-二去氫菖蒲烯 α-calacorene C15H200.360.5230.553石竹素 caryophyllene oxide C15H24O1.451.8731.659(1R,3Z,7Z,11S)-1,5,5,8-四甲基-12-氧雜雙環(huán)[9.1.0]十二碳-3,7-二烯 (1R,3Z,7Z,11S)-1,5,5,8-tetramethyl-12-oxabicyclo[9.1.0]dodeca-3,7 -diene C15H24O0.2043.979海松-8(14),15-二烯 pimara-8(14),15-diene C20H320.400.68酯Ester6.773乙酸葉醇酯 (3Z)-3-hexen-1-yl acetate C8H14O21.902.9913.901水楊酸甲酯 methyl salicylate C8H8O30.601.6817.940乙酸龍腦酯 (+)-bornyl acetate C12H20O22.923.8722.051乙酸香葉酯 acetic acid geranyl ester C12H20O20.130.3724.6612,6-二甲基-1-環(huán)己烯-1-基乙酸酯 2,6-dimethyl-1-cyclohexen-1-yl acetate C10H16O20.690.260.5430.098順式-3-己烯醇苯甲酸酯 (3Z)-3-hexen-1-yl benzoate C13H16O20.9139.838肉豆蔻酸異丙酯 isopropyl myristate C17H34O20.630.12雜環(huán)Heterocyclic 6.3962-正戊基呋喃 2-pentylfuran C9H14O0.730.516.646反式-2-(2-戊烯基)呋喃 trans-2-(2-pentenyl)furan C9H12O0.480.32

續(xù)表1(Continued Tab.1)

種類Group保留時(shí)間Retention time(min)化合物Compounds分子式Molecular formula相對峰面積Relative peak area(%)鮮槲樹葉Fresh Quercus dentata Thunbleaves鮮槲樹葉?Fresh Quercus dentata Thunbleaves干槲樹葉Dried Quercus dentata Thunbleaves干槲樹葉?Dried Quercus dentata Thunbleaves34.6351,2-二氫-8-甲氧基-2,2,4-三甲基-喹啉 1,2-dihydro-8-methoxy-2,2,4-trimethyl-quinoline C13H17NO0.751.4436.9111,2,3,5,7-五甲基-1H-吲哚 1,2,3,4,7-pentamethyl-1H-indole C13H17N11.067.657.828.88烷烴Alkane4.8161,7,7-三甲基三環(huán)[2.2.1.02.6]庚烷 1,7,7-trimethyltricyclo[2.2.1.0.2,6]heptane C10H160.180.196.4322,2,4,6,6-五甲基庚烷 2,2,4,6,6-pentamethylheptane C12H260.181.0225.3671,5,9,9-四甲基-1,4,7-環(huán)十一碳 1,5,9,9-tetramethyl-1,4,7,-cycloundecatriene C15H280.230.3335.4352,6,10-三甲基十二烷 2,6,10-trimethyldodecane C15H320.48酚Phenol24.945(E)-2-甲氧基-4-(1-丙烯基苯酚) trans-isoeugenol C10H12O20.850.250.3820.849 2-甲氧基-5-丙-2-烯基苯酚 2-methoxy-5-prop-2-enylphenol C10H12O211.3413.515.934.38其他Something else9.6461-(5-乙烯基四氫-5-甲基-2-呋喃基)-1-甲基乙基碳酸(1-5-vinyltetrahydro-5-methyl-2-furyl)-1-methylethyl carbonate C10H18O20.3113.588萘 naphthalene C10H80.6024.459順式-α-佛手甘氨酸 cis-a-bergamotene C15H240.7228.024(1S,8aR)-1-異丙基-4,7-二甲基-1,2,3,5,6,8a-六氫萘 (1S,8aR)-1-isopropyl-4,7-dimethyl-1,2,3,5,6,8a-hexahydronaphthalene C15H241.851.410.441.1134.981非那西丁 phenacetin C10H13NO22.0237.947菲 phenanthrene C14H100.560.5139.7182,3-二氫-1,1,4,5,6-五甲基-1H-茚 1,1,4,5,6-pentamethyl-2,3-dihydro-1H-indene C14H203.093.111.232.6444.526棕櫚酸 palmitic acid C16H32O215.099.225.587.85

注：*加β-葡萄糖苷酶。

Note:*β-glucosidase.

對比表中新鮮槲樹葉及干燥槲樹葉成分發(fā)現(xiàn)：干燥槲樹葉與新鮮槲樹葉中共有相同成分22種，其中醛酮類成分有7種保持不變，醇類成分有5種保持不變，烯烴類成分有4種成分保持不變，酯類、雜環(huán)類及酚均有1種保持不變，這些化合物多為高沸點(diǎn)化合物。此外，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明干燥品與新鮮品間化合物差異較大，干燥槲樹葉揮發(fā)油中所含化合物更多，化合物相對含量也有所改變：醇類成分增加3種，相對含量由新鮮品的26.70%降至8.99%；醛酮類成分增加15種，相對含量由14.47%增加到22.44%；烯烴類成分增加13種，相對含量由13.03%增加至38.16%；雜環(huán)類增加3種，相對含量由11.06%降至9.78%；酯類增加1種，相對含量由3.19%增加至4.90%。

植物表現(xiàn)出香味往往因?yàn)槠浜泻芏嗟南憔惓煞?，不同的香精成分表現(xiàn)出不同的氣味。如2-己烯醛表現(xiàn)為新鮮水果、綠葉清香；桃金娘烯醇可呈現(xiàn)出草香、木香、樟腦樣香氣；檸檬醛表現(xiàn)出濃郁的檸檬香味；此外還有一部分物質(zhì)可用于增香如庚醛；定香使香氣持久如β-石竹烯等。植物表現(xiàn)出的具體的香味會隨這些成分的種類及相對含量的變化而變化。相較于干燥前較淡的清香氣息，干燥后槲樹葉香氣變得濃郁并能夠體現(xiàn)槲樹葉的特征香氣，推測槲葉干燥過程中發(fā)生一系列復(fù)雜的變化，產(chǎn)生槲樹葉特有的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)[19,20]。如干燥后出現(xiàn)的烯烴類成分2-蒎烯(23.77%)、(+)-檸檬烯(2.10%)、(-)-β-蒎烯(1.59%)、莰烯(0.83%)、檜烯(0.12%)等與吳章文[3]等關(guān)于槲樹葉精氣成分的研究結(jié)果一致。從化學(xué)成分來看：烯烴類、醛酮類及酯類成分種類及相對含量都有所增加，而醇酚類、雜環(huán)成分種類雖有增加但相對含量下降。推測干燥過程：由于含水量的減少使得化合物濃度升高，一些在新鮮槲葉揮發(fā)油中檢測不出的成分得以檢測，化合物種類增多；由于受熱、酶、氧化等作用使得一部分化學(xué)成分發(fā)生變化并產(chǎn)生一些新的成分，槲樹葉特征香氣成分得以凸顯，且使香氣更加濃郁持久。

2.2 加酶前后槲樹葉揮發(fā)油成分分析

對比表1新鮮有酶及無酶槲樹葉揮發(fā)油成分發(fā)現(xiàn)：化合物種類增加12種，減少3種。其中醇類成分增加2種,減少1種；烯烴及雜環(huán)類成分保持不變；醛酮類成分增加5種，減少1種；酯類成分增加1種，減少1種。醇、醛酮及酯類成分相對含量均有增加：醇類由26.70%增加至28.85%；醛酮類由14.47%增加至17.21%；酯類由3.19%增加至5.58%。測定得到的成分里A-畢橙茄醇、8-異丙烯基-1,5-二甲基-1,5-二烯-環(huán)癸烷、乙酸葉醇酯、水楊酸甲酯的相對含量增加較多分別為2.55%、1.19%、1.09%、1.08%，增長率達(dá)到82.52%、42.65%、57.37%、180.00%，呈現(xiàn)出明顯的增長趨勢。此外2,2,4,6,6-五甲基庚烷、壬醛、乙酸葉醇酯、反式-橙花叔醇等的相對含量也有所增加。

對比表1干燥有酶及無酶槲樹葉揮發(fā)油成分發(fā)現(xiàn)：化合物種類增加8種，減少8種。其中醇類成分增加3種減少1種；烯烴類成分增加4種減少2種；醛酮類成分增加1種減少3種；酯類、雜環(huán)類成分保持不變。醇類、酯類及雜環(huán)類化合物相對含量有所上升：醇類由8.99%上升至13.56%；酯類由3.94%上升至4.90%；雜環(huán)類由9.78%上升至11.15%。測定得到的化合物中相對含量增加的有41種，下降的23種。其中常見的鍵合態(tài)揮發(fā)性物質(zhì)如芳樟醇、A-畢橙茄醇等成分均有增長，此外乙酸龍腦酯、愈創(chuàng)醇、十五醛等的相對含量也有增加。

有研究表明植物中存在的β-葡萄糖苷酶鍵合態(tài)揮發(fā)性物質(zhì)主要為萜烯類物質(zhì)、苯衍生物、C13-降異戊二烯類物質(zhì)、醛類、醇類、羥基酯類[21]。本次研究表明新鮮槲樹葉中醇、醛酮及酯類成分相對含量增加，干燥槲樹葉中醇及酯類成分有所增加。表明β-葡萄糖苷酶對新鮮及干燥槲樹葉均有增香作用。

3 結(jié)論

本次研究建立了槲樹葉揮發(fā)油的GC-MS分析方法，測定得到新鮮槲樹葉中32中化合物，干燥槲樹葉中72中化合物并進(jìn)行數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)槲樹葉揮發(fā)油中化合物主要為醇類、烯烴類、醛酮類、酯類及雜環(huán)類成分并含有一定量的酚、短鏈烷烴及酸類化合物，為進(jìn)一步開發(fā)研究槲樹及槲樹葉資源提供科學(xué)依據(jù)。

本次研究中新鮮槲樹葉具有淡淡的清香氣息，而干燥之后呈現(xiàn)出槲樹葉的特征香氣且香味濃郁持久，提示干燥過程可能對于槲樹葉香氣成分的呈現(xiàn)具有重要意義。通過新鮮及干燥槲樹葉揮發(fā)油成分的比較，發(fā)現(xiàn)干燥后揮發(fā)油化合物種類增加且部分化合物種類及含量發(fā)生較大變化?；衔锓N類總體呈增加趨勢，部分高沸點(diǎn)的化合物得到保留，部分化合物損失或發(fā)生改變。推測干燥過程槲樹葉含水量的變化及其受熱、氧化、內(nèi)源性酶的作用使得化合物發(fā)生種類、相對含量上的變化。

通過對酶解前后槲樹葉揮發(fā)油的比較，發(fā)現(xiàn)β-葡萄糖苷酶可能對新鮮及干燥槲樹葉均有增香作用。有研究表明植物精油多為醇、醛酮、烯及酯類等成分，本次研究中新鮮槲樹葉揮發(fā)油成分加酶后種類及相對含量有明顯增加，種類多為醇、醛酮類及酯類物質(zhì)，干燥槲樹葉經(jīng)酶水解后醇及酯類成分相對含量明顯增加，這些成分對于槲樹葉香氣的呈現(xiàn)有重要作用且有研究表明其為β-葡萄糖苷酶的水解底物。這些成分種類及相對含量的增加提示了β-葡萄糖苷酶可以水解新鮮槲樹葉中香氣前體物質(zhì)，釋放香氣成分，對槲樹葉起到增香作用。