5種復(fù)合藏藥對(duì)西藏牦牛源大腸桿菌抗菌活性的研究

趙燕娟,王 剛,參木友,索朗斯珠

(1.西藏農(nóng)牧學(xué)院動(dòng)物科學(xué)學(xué)院 西藏高原動(dòng)物疫病研究自治區(qū)高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,西藏 林芝 860000;2.西藏農(nóng)牧科學(xué)院草業(yè)研究所,西藏 拉薩 850000)

近年來(lái)由于抗生素的不合理使用,導(dǎo)致耐藥菌株引發(fā)的臨床感染現(xiàn)象日趨嚴(yán)峻,使得現(xiàn)有抗菌藥物對(duì)臨床耐藥菌株的療效顯著降低甚至無(wú)效,尤其對(duì)危重癥感染患者構(gòu)成嚴(yán)重威脅,目前耐藥菌感染已經(jīng)成為臨床治療的棘手問(wèn)題[1]。牦牛大腸桿菌病是由大腸埃希菌所導(dǎo)致的,只有在牦牛中發(fā)生,零星或地方性流行。每年春夏季發(fā)生,春末夏初是發(fā)病高峰期。最早發(fā)生在母牦牛,牦牛在哺乳期最容易感染,其次是1～4月齡的犢牛有易感性,公牦牛不容易感染牦牛大腸桿菌病。陳明勇報(bào)道,致病性大腸桿菌是牦牛腹瀉的主要病因[2],該報(bào)告與其他學(xué)者一致[3-4]。病牛及受污染的牦牛是感染的主要來(lái)源,它們?cè)谀翀?chǎng)和水源的糞便通過(guò)消化道污染健康牛群,導(dǎo)致健康牦牛也會(huì)感染牦牛大腸桿菌病。牦牛大腸桿菌病在西藏牧區(qū)流行較為普遍,嚴(yán)重影響牦牛健康和牦牛產(chǎn)業(yè)的發(fā)展[5];大腸桿菌已經(jīng)被確定為耐藥性檢測(cè)的指示菌株,對(duì)其耐藥性的監(jiān)測(cè)有重要意義[6]。我國(guó)傳統(tǒng)醫(yī)藥治療感染性疾病有著悠久的歷史,而且藥材資源非常豐富,從中尋找開(kāi)發(fā)新型抗菌藥物已成為國(guó)內(nèi)外研究的焦點(diǎn)[7-8]。對(duì)現(xiàn)代中藥的藥理研究表明：清熱解毒類藥能夠抗菌,抗病毒,抗癌。有較廣的抗菌譜,能抑制病毒,提高機(jī)體非特異性免疫力,對(duì)腫瘤細(xì)胞有抑制作用,具有消炎、止痛、殺菌、抑癌、排毒和退熱等作用[9]。藏藥生境獨(dú)特,藥理功效強(qiáng),其臨床療效引起國(guó)內(nèi)外的關(guān)注和日益重視[10],目前對(duì)藏藥的藥理研究報(bào)道較少,對(duì)清熱解毒復(fù)方的體外抑菌作用基本沒(méi)有研究報(bào)道,為了探討藏藥石榴健胃丸、仁青芒覺(jué)、十五味黑藥丸等5種復(fù)合藏藥發(fā)揮藥理作用的機(jī)理,闡明該藥治療胃腸疾病的作用機(jī)制以充分開(kāi)發(fā)其藥物利用價(jià)值,為民族醫(yī)藥藏藥研究開(kāi)發(fā)提供基礎(chǔ),我們進(jìn)行了石榴健胃丸、仁青芒覺(jué)、十五味黑藥丸等5種復(fù)合藏藥體外抗菌試驗(yàn)研究。

本試驗(yàn)選取五種復(fù)合藏藥進(jìn)行體外抑菌試驗(yàn),通過(guò)比較,他們對(duì)14株腸出血性大腸桿菌的抑菌效果,旨在篩選出治療腸出血性大腸桿菌病的有效的藏藥。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)菌株來(lái)源 14株西藏牦牛源腸出血性大腸桿菌均為實(shí)驗(yàn)室保存菌株;質(zhì)控菌株為大腸埃希菌ATCC 25922,購(gòu)自中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)驗(yàn)所。

1.2 藏藥來(lái)源 石榴健胃丸、仁青芒覺(jué)、十五味黑藥丸、仁青常覺(jué)、仁青二十五味馬寶丸等5種藏藥,購(gòu)自西藏自治區(qū)林芝市健民大藥房。

1.3 常用抗生素藥敏片 氯霉素、諾氟沙星、萬(wàn)古霉素等14種抗生素,均購(gòu)自北京天壇藥物生物技術(shù)開(kāi)發(fā)公司。

1.4 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 昆明種小鼠,購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司,體重?zé)o顯著性差異。

1.5 培養(yǎng)基 普通肉湯培養(yǎng)基、普通瓊脂培養(yǎng)基,購(gòu)自北京陸橋生物技術(shù)有限責(zé)任公司。

1.6 儀器 隔水式電熱恒溫培養(yǎng)箱、DZF-6021型真空干燥箱,均購(gòu)自北京市六一儀器廠;AB204-N型電子分析天平,購(gòu)自上海醫(yī)用核子儀器有限公司;SW-CJ-JC超凈工作臺(tái),購(gòu)自蘇州凈化設(shè)備公司;CHA-S型往復(fù)空氣恒溫?fù)u床,購(gòu)自常州金壇良友儀器有限公司。

1.7 方法

1.7.1 復(fù)壯 14株出血性大腸桿菌菌株：將大腸桿菌菌株接種于裝有LB肉湯的50 mL三角瓶,溫度設(shè)為37℃,搖床搖速為120 r/min,培養(yǎng)12～24 h。

1.7.2 藏藥的提取、分離 根據(jù)藏藥的特殊性,分別采用以下方法制備。

1.7.2.1 研磨法 將五種藏藥藥丸充分研碎后備用。

1.7.2.2 高壓滅菌法 將研碎烘干后的五種復(fù)合藏藥藥丸按50 g加水500 mL的比例煎煮,將濾液濾出,再將濾渣加水至200 mL,二次煎煮,后將兩次煎煮所得濾液加在一起,水溶液濃縮至50 mL,用容量瓶定容,裝瓶后高壓滅菌取出,放涼備用。所得復(fù)合藏藥水煎劑的濃度為1 g/mL[9]。

1.7.3 自制藏藥藥敏片 用打孔器打成直徑為5 mm的圓片,每14片放入小瓶中高壓滅菌30 min,烘干備用。取適量配制好的復(fù)合藏藥水煎劑放入小瓶?jī)?nèi)(藥液的多少以最透紙片為宜),浸泡24 h后,將多余的藏藥水煎劑倒掉并烘干,而后加蓋置4℃的冰箱中保存?zhèn)溆肹11]。

1.7.4 藥敏試驗(yàn) 將復(fù)壯成功的14株大腸桿菌用移液槍各吸取1 000 μL置于營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基中,并用涂菌棒涂抹均勻,標(biāo)號(hào)。將烘干的5種復(fù)合藏藥藥敏紙片和購(gòu)買的14種抗生素藥敏紙片按區(qū)域分別貼于培養(yǎng)基中,倒置放于37℃恒溫箱中培養(yǎng)24 h后觀察。藥敏試驗(yàn)按照CLSI(Clinical and laboratory standards Intermediate)推薦的K-B法進(jìn)行。抑菌結(jié)果的判定參照NCCLS(2013)公布的標(biāo)準(zhǔn)以敏感(Susceptible)、中介(Intermediate)、耐藥 (Resistant)3種形式對(duì)抑菌圈大小作出判定[12]。

1.7.5 動(dòng)物試驗(yàn) 將復(fù)壯成功的14株大腸桿菌用滅菌生理鹽水調(diào)整為含菌量為109CFU/mL的懸浮液,作為攻毒用菌液,其中一組分別以0.2 mL/只腹腔接種小鼠5只,同時(shí)以相同劑量的滅菌營(yíng)養(yǎng)肉湯按相同途徑接種小鼠1只,作為空白對(duì)照;另一組分別以0.2 mL/只腹腔接種小鼠5只,并以相同劑量的仁青芒覺(jué)按相同途徑接種這5只小鼠,接種后隔離飼養(yǎng),觀察5 d,觀察小鼠的死亡情況。如果發(fā)現(xiàn)有病死或發(fā)病小鼠,取其腸管、腎臟進(jìn)行細(xì)菌分離鑒定,其培養(yǎng)特性、菌落形態(tài)、血清學(xué)鑒定,觀察這些臟器內(nèi)是否還有符合攻毒原菌株的大腸桿菌。

2 結(jié)果與分析

2.1 藏藥藥敏紙片抑菌法結(jié)果 經(jīng)培養(yǎng)24 h后,取出觀察,測(cè)量其抑菌圈包括藥敏紙片的直徑,用cm表示,判斷標(biāo)準(zhǔn)：直徑大于1.5～2.0 cm為強(qiáng)抑菌,用“+++”表示;1.0～1.4 cm為抑菌,用“++”表示;0.9 cm以下為弱或不完全抑菌,用“-”表示。由表中數(shù)據(jù)可以得知,14株牦牛源腸出血性大腸桿菌對(duì)5種復(fù)合藏藥的藥敏檢測(cè)結(jié)果顯示：14株牦牛源腸出血性大腸桿菌對(duì)仁青芒覺(jué)表現(xiàn)為中度敏感;對(duì)石榴健胃丸、十五味黑藥丸、仁青二十五味馬寶丸、仁青芒覺(jué)均表現(xiàn)為耐藥,其中對(duì)石榴健胃丸耐藥的有9株,耐藥率64.29%;其對(duì)仁青芒覺(jué)的有3株,耐藥率21.43%;中對(duì)十五味黑藥丸耐藥的有8株,耐藥率57.14%;對(duì)仁青常覺(jué)的有10株,耐藥率71.43%;對(duì)仁青二十五味馬寶丸耐藥的有9株,耐藥率64.29%。14株牦牛源腸出血性大腸桿菌對(duì)14種常用抗生素的藥敏檢測(cè)結(jié)果顯示：14株牦牛源腸出血性大腸桿菌對(duì)萬(wàn)古霉素、青霉素、紅霉素表現(xiàn)為耐藥;對(duì)呋喃妥因表現(xiàn)為中度敏感;對(duì)氯霉素、諾氟沙星、萬(wàn)古霉素、頭孢唑啉等10種抗生素均表現(xiàn)為敏感(表 1、表 2、表3、圖1)。

表1 5種藏藥藥敏片法抑菌結(jié)果

表2 常用的14種抗生素的藥敏片法抑菌結(jié)果

CHL：氯霉素;NOR：諾氟沙星;VAN：萬(wàn)古霉素;CFZ：頭孢唑啉;STR：鏈霉素;PEN：青霉素;AMK：丁胺卡那霉素;TCY：四環(huán)素;AZM：阿奇霉素;SXT：復(fù)方新諾明;ERY：紅霉素;NIT：呋喃妥因;GEN：慶大霉素;FOX：頭孢西丁

表3 14株牦牛源腸出血性大腸桿菌對(duì)五種藏藥及抗生素的藥敏試驗(yàn)結(jié)果

圖1 5種藏藥及14種抗生素耐藥率對(duì)比結(jié)果

2.2 五種復(fù)合藏藥耐藥譜型分析結(jié)果及多重耐藥結(jié)果 14株牦牛源腸出血性大腸桿菌對(duì)5種復(fù)合藏藥的藥敏檢測(cè)結(jié)果顯示：14株牦牛源腸出血性大腸桿菌中有4株腸出血性大腸桿菌表現(xiàn)為3重耐藥,有1株腸出血性大腸桿菌表現(xiàn)為4重耐藥,有3株表現(xiàn)為5重耐藥(表4、圖2)。

2.3 動(dòng)物試驗(yàn)結(jié)果 14株牦牛源腸出血性大腸桿菌的動(dòng)物致病性試驗(yàn)結(jié)果可以看出,只接種攻毒液沒(méi)有注射仁青芒覺(jué)的分離菌株均能引起大多數(shù)小鼠死亡,均具有高致病性,致死率達(dá)到95%,而注射了仁青芒覺(jué)復(fù)合藏藥的試驗(yàn)組,死亡情況明顯降低,從死亡小鼠實(shí)質(zhì)器官中均能分離回收到與攻毒用相同的細(xì)菌,在麥康凱瓊脂培養(yǎng)基上形成典型的紅色菌落,回收得到的細(xì)菌涂片染色表現(xiàn)為革蘭陰性小桿菌,菌體兩端著色較深,符合大腸桿菌的特征。

表4 14株腸出血性大腸桿菌對(duì)5種藏藥的耐藥譜分析

圖2 5種藏藥的多重耐藥性分析

3 討論

腸出血性大腸埃希菌是一群重要的能夠引起人類致病的食源性病原菌,主要寄生在反芻動(dòng)物腸道內(nèi),是一種人獸共患傳染病的病原,可以引起人的血樣腹瀉、出血性結(jié)腸炎和溶血性尿毒綜合征。溶血性尿毒綜合征主要表現(xiàn)為腎臟衰竭、溶血性貧血及血小板減少等[13]。通常人們認(rèn)為病原菌攜帶毒力因子才會(huì)具有致病性,檢測(cè)這些毒力因子可以有效地分辨出任意1株大腸桿菌是否具有潛在的致病能力[14]。動(dòng)物試驗(yàn)結(jié)果可以看出：只接種攻毒液沒(méi)有注射仁青芒覺(jué)的分離菌株均能引起大多數(shù)小鼠死亡,均具有高致病性,致死率達(dá)到95%,而注射了仁青芒覺(jué)復(fù)合藏藥的試驗(yàn)組,死亡情況明顯降低。這說(shuō)明仁青芒覺(jué)這味復(fù)合藏藥對(duì)牦牛源腸出血性大腸桿菌有一定的抑制作用,我們認(rèn)為大腸桿菌病的治療方面除了臨床上常用的抗生素,復(fù)合藏藥也是一個(gè)很不錯(cuò)的選擇,特別是在耐藥性日趨肆虐的今天,就顯得很有研究?jī)r(jià)值。

14株牦牛源腸出血性大腸桿菌對(duì)5種復(fù)合藏藥的藥敏檢測(cè)結(jié)果顯示：14株牦牛源腸出血性大腸桿菌對(duì)仁青芒覺(jué)表現(xiàn)為中度敏感;對(duì)石榴健胃丸、十五味黑藥丸、仁青二十五味馬寶丸、仁青芒覺(jué)均表現(xiàn)為耐藥。而14株牦牛源腸出血性大腸桿菌對(duì)14種常見(jiàn)抗生素的藥敏檢測(cè)結(jié)果顯示：14株牦牛源腸出血性大腸桿菌對(duì)萬(wàn)古霉素、青霉素、紅霉素表現(xiàn)為耐藥,對(duì)呋喃妥因表現(xiàn)為中毒敏感;對(duì)氯霉素、諾氟沙星、萬(wàn)古霉素、頭孢唑啉等10種抗生素均表現(xiàn)為敏感。雖然從試驗(yàn)結(jié)果看出這5種藏藥對(duì)腸出血性大腸桿菌病的抑菌效果并不如常用抗生素的抑菌效果好,但是這并不能說(shuō)明藏藥對(duì)腸出血性大腸桿菌病沒(méi)有一定的治療效果。由于廣譜抗菌藥的濫用以及細(xì)菌間耐藥基因的轉(zhuǎn)導(dǎo)等因素,導(dǎo)致耐藥菌增多,尤其是大腸桿菌對(duì)常用抗菌藥物耐藥的發(fā)展越來(lái)越令人擔(dān)憂[15]。因此我們要尋求抗生素以外的抑菌產(chǎn)品,就顯得尤為重要,這也是本文研究藏藥對(duì)腸出血性大腸桿菌抑菌活性的意義。

現(xiàn)如今,國(guó)內(nèi)乃至國(guó)際上對(duì)于腸出血性大腸桿菌病的治療沒(méi)有有效的方法[16],特別是在耐藥性泛濫的形勢(shì)下,我們可以適當(dāng)選擇這種復(fù)合藏藥進(jìn)行治療,從我們本次試驗(yàn)中就可以看出,仁青芒覺(jué)這種藏藥對(duì)腸出血性大腸桿菌有一定的抑制作用,所以我們認(rèn)為選擇藏藥來(lái)治療腸出血性大腸桿菌病是切實(shí)可行的,特別是在耐藥性問(wèn)題日趨嚴(yán)重的今天,顯得尤為重要。臨床用藥時(shí)應(yīng)避免交叉耐藥的藥物同時(shí)使用,不僅起不到治療效果,還會(huì)進(jìn)一步的促進(jìn)耐藥性的產(chǎn)生。此外,臨床用藥應(yīng)注意交叉用藥,輪換用藥,穿梭用藥減少耐藥性的產(chǎn)生[17]。

仁青芒覺(jué)主要成分是降香、沉香、訶子(去核)、天竺黃、西紅花、檀香、體外培育牛黃、人工麝香、熊膽、琥珀、松石、坐臺(tái)等140味,據(jù)傳統(tǒng)藏藥醫(yī)書記載其中松石、麝香、人工牛黃等具有清熱解毒、抑制病毒的作用[9],試驗(yàn)首次從其清熱解毒的藥理作用出發(fā)對(duì)仁青芒覺(jué)進(jìn)行體外抑菌活性研究,結(jié)果表明14株牦牛源腸出血性大腸桿菌對(duì)仁青芒覺(jué)表現(xiàn)為中度敏感,其余4種藏藥均無(wú)明顯抑菌作用。