補(bǔ)體C9分子原核表達(dá)與多克隆抗體的制備

鄧亦寧,張云科,吳文學(xué)

(中國農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院,北京 海淀 100193)

補(bǔ)體是一種不耐熱、活化后具有酶活性的血清蛋白質(zhì)[1]。在病原菌入侵時,能起到調(diào)理免疫細(xì)胞對細(xì)菌吞噬作用、促進(jìn)趨化因子的產(chǎn)生、形成鞏膜復(fù)合體(Membrane attack complex,MAC),在非特異性免疫和特異性免疫效應(yīng)發(fā)揮關(guān)鍵作用[2]。激活補(bǔ)體系統(tǒng)共有3條途徑：經(jīng)典途徑(Classical pathway)、凝集素途徑(Lectin pathway)、替代途徑(Alternative pathway),3種途徑都將匯聚為相同的終末補(bǔ)體途徑,形成鞏膜復(fù)合物[3]。MAC可通過直接裂解或干擾代謝過程導(dǎo)致細(xì)菌、紅細(xì)胞、有核細(xì)胞等死亡[3]。此外,人血清中的溶菌酶可能通過水解細(xì)菌細(xì)胞壁增強(qiáng)MAC介導(dǎo)的細(xì)菌裂解作用[4]。

最新研究表明,MAC呈“開口擋圈”狀,而非之前所認(rèn)為的閉合環(huán)狀結(jié)構(gòu),長305 ?,內(nèi)徑110 ?,外徑為240 ?,由22個蛋白亞基組成,包括 C5b、C6、C7、C8α,C8β、C8γ 和 C9 等 7 種補(bǔ)體 蛋白 形式[5-6]。除C5分子外,其他補(bǔ)體蛋白均含有一個膽固醇依賴性細(xì)胞溶解素/鞏膜復(fù)合體/穿孔素樣(Cholesterol-dependent cytolysin/MAC/perforin-like,CDC/MACPF)區(qū)域,由中心4鏈經(jīng)β折疊成“L”形,側(cè)翼有一系列對膜孔插入3個螺旋束[7-9]。在此區(qū)域中,可溶性小分子物質(zhì)、水和離子可進(jìn)入進(jìn)行被動交換,但大分子物質(zhì)(如蛋白質(zhì))由于體積過大不可從胞漿逸出,從而導(dǎo)致滲透性溶解和破壞細(xì)胞[10-11]。MAC只能在靶細(xì)胞上才能完成,若C5b,6,7在溶液中,會與抑制物S-蛋白結(jié)合,形成可溶性MAC(soluble MAC,sMAC),不能溶解細(xì)胞,可以誘發(fā)炎性反應(yīng)[12]。

補(bǔ)體C9分子是一個79 ku的單鏈血清蛋白,當(dāng)C9在C5b,6,7,8上聚合到4個分子,就足以使微生物和一些真核細(xì)胞發(fā)生溶解[13-14]。多個C9分子聚合于C5-8部位形成MAC[15]。近年來,有研究表明,poly-C9是由22C9單體組成的閉環(huán)結(jié)構(gòu),即在poly-C9中,最后一個C9分子可以插入第一個C9分子成環(huán),其證明了血小板反應(yīng)蛋白-1(TSP1)結(jié)構(gòu)域?qū)9-C9寡聚化有重要影響[16-17]。

在本研究中,主要擴(kuò)增了兔補(bǔ)體C9分子部分基因序列,并構(gòu)建了重組質(zhì)粒pBlunt-C9,隨后誘導(dǎo)表達(dá)、純化及鑒定了重組蛋白C9并制備多克隆抗體,測定其效價,最后運(yùn)用Western Blotting檢測沉積在菌體上的C9分子。

1 材料與方法

1.1 細(xì)菌及載體 金黃色葡萄球菌8030株,購自中國醫(yī)學(xué)細(xì)菌菌種保藏管理中心(CMCC);鏈球菌B1株由本實(shí)驗室分離保存。大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞DH5α、BL21(DE3)菌株及表達(dá)載體 pEASY?-Blunt E1 Expression Vector,均購自北京全式金生物技術(shù)有限公司。

1.2 主要試劑 TransStart?FastPfu高保真DNA聚合酶、EasyTaq?DNA 聚合酶,Trans5K DNA Marker、Blue Plus II Protein Marker,均購自北京全式金生物技術(shù)有限公司;異丙基 -β-D硫代半乳糖苷(IPTG)、鹽酸胍,購自北京索萊寶科技有限公司;完全弗氏佐劑及不完全弗氏佐劑,購自美國Sigma公司;His標(biāo)簽蛋白純化試劑盒,購自康為世紀(jì)生物科技有限公司;鼠抗His標(biāo)簽單克隆抗體、HRP標(biāo)記山羊抗鼠IgG(H+L),購自武漢愛博泰克生物科技有限公司;動物組織總RNA提取試劑盒(DP431),購自天根生化科技(北京)有限公司;TransScript First-Strand cDNA合成試劑盒,購自北京全式金生物技術(shù)有限公司。

1.3 實(shí)驗動物 6-8周齡雌性BALB/c小鼠,購自北京維通利華實(shí)驗動物技術(shù)有限公司,飼養(yǎng)于中國農(nóng)業(yè)大學(xué)實(shí)驗動物平臺。

1.4 兔補(bǔ)體C9分子部分基因序列擴(kuò)增

1.4.1 兔肝組織RNA提取及cDNA文庫合成 取少量健康新西蘭大白兔肝臟組織,參照動物組織總RNA提取試劑盒說明書提取兔肝臟總RNA,經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測提取RNA完整性后,合成cDNA文庫,保存于-20℃?zhèn)溆谩?/p>

1.4.2 擴(kuò)增C9部分基因序列 根據(jù)GenBank上公布的兔C9的基因序列(GeneID：100009197),利用Primer Premier5.0軟件設(shè)計PCR引物C9-F/C9-R用于擴(kuò)增兔補(bǔ)體C9部分基因序列,引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成,見表1。

表1 引物序列

以合成的cDNA文庫為模板,根據(jù)表1的引物C9-F/C9-R,用FastPfu高保真DNA聚合酶進(jìn)行PCR以擴(kuò)增兔C9部分基因序列,PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系：2×FastPfu高保真DNA聚合酶25 μL,上下游引物C9-F/C9-R 各1 μL,DNA 模板4 μL,雙蒸水補(bǔ)至50 μL。

1.5 重組表達(dá)載體pBlunt-C9的構(gòu)建 將目的基因片段的膠回收產(chǎn)物,采用pEASY?-Blunt E1 Expression Vector試劑盒進(jìn)行連接,反應(yīng)體系：pEASY?-Blunt E1 Expression Vector 1 μL,PCR 回收產(chǎn)物4 μL,混合均勻置于25℃恒溫儀連接10 min,將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞DH5α宿主菌后涂布于LB平板,37℃倒置培養(yǎng)。挑取單菌落進(jìn)行PCR鑒定為陽性,再送檢進(jìn)行DNA測序進(jìn)一步確認(rèn)。測定正確的重組質(zhì)粒按照質(zhì)粒提取試劑盒說明書提取質(zhì)粒并保存于-20℃冰箱,命名為pBlunt-C9。

1.6 重組蛋白C9誘導(dǎo)表達(dá)、純化及鑒定 將驗證正確的pBlunt-C9轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞。挑取單菌落接種于LB培養(yǎng)液(含100 μg/mL Amp)中,于37℃,200 r/min離心培養(yǎng),待菌體密度至 OD600值為 0.6～0.8時,加入終濃度為1mmol/LIPTG繼續(xù)37℃培養(yǎng)6 h后,離心收集菌體沉淀。沉淀經(jīng)PBS洗滌后,冰浴條件下進(jìn)行超聲破碎,分別收集上清和沉淀,進(jìn)行SDS-PAGE電泳,鑒定表達(dá)的重組蛋白,并優(yōu)化誘導(dǎo)條件,將重組蛋白大量表達(dá)。

1.7 重組蛋白的純化與鑒定 將誘導(dǎo)表達(dá)后的菌體沉淀超聲破裂,收集沉淀,完全溶解于包涵體裂解緩沖液(6 mol/L鹽酸胍、100 mmol/L NaCl、50 mmol/L Tris-HCl),使用Ni-NTA親和層析柱純化重組蛋白,通過Millipore超濾管(NMWL為10 K)濃縮收集液,用BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度,同時用 SDS-PAGE檢測純化效果,并進(jìn)行 Western Blotting鑒定重組蛋白。

1.8 多克隆抗體的制備 用純化的C9蛋白作為抗原,選擇6只SPF級的雌性6～8周齡BALB/c小鼠,免疫前采血0.5 mL作為樣本對照。將得到的重組蛋白C9蛋白作為抗原,首次免疫與等量完全弗氏佐劑混合均勻,背部皮下多點(diǎn)注射抗原50 μg/只。2周后進(jìn)行加強(qiáng)免疫,與等量不完全弗氏佐劑混合,免疫劑量50 μg/只,免疫2次,每次間隔1周,第3次免疫后10 d摘眼球采血,分離血清,用間接ELASA檢測小鼠血清抗體的效價。

1.9 Western Blotting檢測沉積菌體表面的C9分子

革蘭陽性菌可激活機(jī)體補(bǔ)體系統(tǒng)形成MAC沉積在菌體表面[18]。將金黃色葡萄球菌8030株、鏈球菌B1株分別按照1∶100的比例接種LB液體培養(yǎng)基中,37℃ 220 r/min震蕩培養(yǎng),當(dāng)菌體OD600值達(dá)到1.0時,離心收集菌體沉淀,PBS洗滌3次。加入1 mL含有10%兔血清的反應(yīng)緩沖液(0.01 mol/L PBS,1 mmol/L CaCl2,5 mmol/L MgCl2)37℃孵育1.5 h,對照組中不加兔血清,離心收集沉淀,PBS洗滌3次。用100 μL PBS沖懸沉淀,加入蛋白Loading Buffer煮沸10 min,進(jìn)行 SDS-PAGE電泳,轉(zhuǎn)印至PVDF膜,轉(zhuǎn)膜條件：120 V,90 min。轉(zhuǎn)膜結(jié)束后用PBST(0.01 mol/L PBS,0.01%Tween20)洗滌PVDF膜3次,每次5 min。用5%脫脂奶室溫封閉2 h,PBST洗滌3次,將PVDF膜置于一抗稀釋液(用PBST按照1∶1 000稀釋鼠抗C9多克隆抗體)中,室溫孵育1 h后,PBST洗滌3次。再將PVDF置于二抗稀釋液(用PBST按照1∶5 000稀釋HRP標(biāo)記山羊抗鼠IgG)中室溫孵育45 min,PBST洗滌3次,用ECL化學(xué)發(fā)光法檢測,通過Tanon 5200收集信號。

2 結(jié)果

2.1 PCR擴(kuò)增C9基因序列 以兔肝臟cDNA文庫為模板,擴(kuò)增C9部分基因片段,PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳,在750～1 000 bp之間可見單一擴(kuò)增條帶(圖1),條帶大小與預(yù)期相符。將PCR產(chǎn)物進(jìn)行回收,連接至表達(dá)載體pEASY?-Blunt E1,并轉(zhuǎn)化到大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞DH5α,挑取菌落進(jìn)行菌液PCR鑒定(圖2),選取陽性樣品送去測序鑒定,獲得在質(zhì)粒中連接方向正確且測序正確的重組表達(dá)質(zhì)粒命名為pBlunt-C9。

圖1 C9基因的PCR擴(kuò)增

圖2 重組表達(dá)質(zhì)粒的PCR鑒定

2.2 重組C9蛋白的表達(dá)及可溶性分析 將重組表達(dá)載體pBlunt-C9轉(zhuǎn)化到表達(dá)宿主菌BL21(DE3)中,通過IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá),經(jīng)超聲裂解后分別取未誘導(dǎo)全菌蛋白、誘導(dǎo)全菌蛋白、超裂后上清液及沉淀進(jìn)行SDS-PAGE電泳,分析蛋白表達(dá)情況及表達(dá)形式。結(jié)果表明,重組蛋白C9在BL21(DE3)中能夠正常表達(dá),大小約為35 kDa,為包涵體表達(dá)(圖3)。

圖3 C9蛋白的SDS-PAGE檢測

2.3 重組C9蛋白的純化及鑒定 將表達(dá)菌大量表達(dá),通過超聲波裂解獲得包涵體沉淀,使用鹽酸胍溶解沉淀,由Ni-NTA親和層析柱獲得純化重組蛋白,通過鹽酸胍梯度透析法進(jìn)行復(fù)性,使蛋白可正確折疊。復(fù)性后經(jīng)10 kDa超濾管透析濃縮,經(jīng)SDS-PAGE凝膠電泳及Western Blotting鑒定,獲得的重組蛋白為目的蛋白,其分子量大小為35 kDa,條帶較為單一,蛋白純度達(dá)到90%以上,BCA法測定蛋白濃度為1 000 μg/mL,滿足后期免疫要求。

圖4 重組C9蛋白的純化及鑒定

2.4 抗體效價測定 將純化的C9重組蛋白作為免疫原免疫BALB/c小鼠,經(jīng)3次免疫后,采集小鼠血液分離得到抗體血清。經(jīng)飽和硫酸銨粗純、protein A+G親和層析柱純化得到補(bǔ)體C9多克隆抗體,間接ELISA檢測抗體效價為1∶12 800。

圖5 間接ELISA法檢測C9蛋白多克隆抗體的效價

2.5 Western Blotting檢測沉積菌體表面的C9分子 將金黃色葡萄球菌、鏈球菌分別孵育10%兔陰性血清,收集菌體沉淀,以鼠抗兔C9多克隆抗體為一抗進(jìn)行Western Blotting檢測,結(jié)果表明,金黃色葡萄球菌和鏈球菌均可激活補(bǔ)體系統(tǒng)形成MAC沉積到菌體上(見圖6)。

圖6 Western Blotting檢測沉積菌體表面的C9分子

3 討論

在本研究中,主要通過提取兔肝組織RNA合成cDNA文庫,并設(shè)計PCR引物C9-F/C9-R擴(kuò)增了兔補(bǔ)體C9分子的部分基因序列,并構(gòu)建了重組表達(dá)載體pBlunt-C9。經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá),Ni-NTA親和層析柱獲得重組蛋白,SDS-PAGE檢測重組蛋白分子量大小為35 kDa,純度達(dá)到90%以上。以鼠抗His標(biāo)簽為一抗Western Blotting鑒定重組蛋白表達(dá)正確,BCA法定量蛋白濃度為1 mg/mL。將其作為免疫原免疫BALB/c小鼠,提取小鼠血清,經(jīng)飽和硫酸銨粗純、Protein A+G親和層析柱純化得到了補(bǔ)體C9多克隆抗體,抗體效價為1∶12 800,并能特異性識別沉淀菌體表面的C9分子。

補(bǔ)體介導(dǎo)的細(xì)胞溶解(Cell lysis)是抗感染的重要機(jī)制,盡管現(xiàn)在MAC殺菌機(jī)理并不十分清楚,但已有研究發(fā)現(xiàn),MAC具有的高度脂質(zhì)選擇性和孔隙柔韌性可破壞細(xì)菌的細(xì)胞膜成分[19-21]。革蘭陽性菌有較厚的肽聚糖層,可以阻止MAC造成的膜損傷,此外,已有幾種革蘭陽性細(xì)菌(如釀膿鏈球菌)被發(fā)現(xiàn)可分泌干擾C5b-9形成的蛋白質(zhì)[22]。對于革蘭陰性菌,其細(xì)胞壁由內(nèi)膜和外膜兩層膜構(gòu)成,僅破壞細(xì)菌細(xì)胞壁外膜并不能導(dǎo)致細(xì)菌死亡,MAC需要同時破壞細(xì)菌的外膜和內(nèi)膜來殺死細(xì)菌。關(guān)于MAC如何破壞內(nèi)膜,目前存在多種假說,有研究表明,盡管單個C9分子在脫離C5-8情況下沒有活性,但通過質(zhì)粒將全長C9蛋白表達(dá)在細(xì)胞膜間質(zhì)可殺死細(xì)菌,而蛋白在細(xì)胞質(zhì)表達(dá)時就失去了殺菌作用,但仍然缺乏直接證據(jù)表明天然構(gòu)象的C9分子具有殺菌作用[23-26]。

本研究成功制備了鼠抗兔C9多克隆抗體并檢測了其效價,為進(jìn)一步研究補(bǔ)體的生物學(xué)功能、MAC抗細(xì)菌感染機(jī)制以及建立補(bǔ)體反應(yīng)鑒別診斷方法奠定了基礎(chǔ)。