FOXA2在胰腺癌組織中的表達及其對胰腺癌細胞增殖和侵襲的影響

趙金磊，季春勇，羅紅杰，劉東亮

（鄭州大學(xué)附屬鄭州市中心醫(yī)院 肝膽胰微創(chuàng)外科，河南 鄭州 453000）

胰腺癌作為消化系統(tǒng)常見的、惡性程度極高的腫瘤類型，近年來發(fā)病率呈升高趨勢，且病死率位居惡性腫瘤第四位[1]。由于該腫瘤不易早期被診斷，多數(shù)患者確診時已進展為中晚期[2]，且手術(shù)切除后復(fù)發(fā)率高，患者預(yù)后較差，5年生存率較低[3]。有研究指出，胰腺癌發(fā)生及進展是多基因、多步驟、多因素共同作用的結(jié)果[4]。叉頭框蛋白A2（forkhead box A2，F(xiàn)OXA2）作為叉頭框蛋白家族重要成員，在進化上高度保守，廣泛存在于真菌及動物體中，與胚胎發(fā)育、細胞增殖、分化、生長及能量代謝等密切相關(guān)[5]。近年來發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)OXA2參與了腫瘤發(fā)生及浸潤轉(zhuǎn)移過程，與惡性腫瘤患者不良預(yù)后有關(guān)[6]。本研究分析FOXA2在胰腺癌組織中的表達，以及與病理特征和預(yù)后的關(guān)系，并利用小分子干擾RNA（siRNA）技術(shù)沉默人胰腺癌PANC-1細胞株，觀察其對細胞增殖、遷移和侵襲能力的影響，以期為胰腺癌發(fā)病機制研究提供基礎(chǔ)資料。

1 資料和方法

1.1 病例資料選擇

選取2010年1月至2013年1月在鄭州市中心醫(yī)院擇期行手術(shù)切除的胰腺癌患者71例，其中，男42例，女29例，年齡36～78歲，平均（59.61±10.72）歲，所選對象術(shù)前未行放化療，術(shù)后經(jīng)病理學(xué)檢查均為胰腺導(dǎo)管癌。根據(jù)第七版國際抗癌聯(lián)盟（UICC）和美國癌癥聯(lián)合委員會（AJCC）TNM分期標準：I期37例，II期18例，III期16例；分化程度：低分化21例，中分化31例，高分化19例；發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移29例。術(shù)中留取胰腺癌和腫瘤邊緣＞3 cm癌旁組織，甲醛固定，石蠟包埋保存。本研究通過醫(yī)院倫理委員會批準。所有患者從手術(shù)時間開始進行隨訪，截止時間為2018年1月31日或患者死亡時間，隨訪形式包括門診和電話，隨訪時間0.5～60個月，隨訪過程中失訪3例。

1.2 主要試劑和設(shè)備

免疫組化試劑盒（北京中杉金橋生物公司），兔抗FOXA2多克隆抗體（美國Cell Signaling Technology公司），人胰腺癌PANC-1細胞株（上海斯信生物科技公司），胎牛血清、DMEM培養(yǎng)基、RPMI1640培養(yǎng)基和0.25%胰蛋白酶（美國Gibco公司）。siRNAFOXA2和陰性對照序列由上?；瞪锕驹O(shè)計合成，F(xiàn)OXA2和內(nèi)參引物由上海生工生物公司設(shè)計合成。Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑和Trizol總RNA提取試劑（美國Invitrogen公司），逆轉(zhuǎn)錄和PCR試劑盒（日本TaKaRa公司），CCK-8檢測試劑盒（廣州碩恒生物科技有限公司），聚偏二氟乙烯膜（PVDF） （上海膜源環(huán)?？萍加邢薰荆?，Transwell小室（美國Costar公司），Matrigel基質(zhì)膠（美國BD公司），7500型實時熒光定量PCR儀（美國ABI公司）。

1.3 檢測方法

1.3.1 免疫組化SP法檢測胰腺癌和癌旁組織中FOXA2蛋白表達：取胰腺癌和癌旁組織石蠟標本，連續(xù)切片（厚度約4 μm），二甲苯脫蠟，梯度乙醇脫水，用磷酸鹽抗原修復(fù)液行抗原修復(fù)，3%雙氧水滅活內(nèi)源性過氧化物酶，血清封閉60 min，加入一抗兔抗FOXA2多克隆抗體（1:800稀釋），4 ℃過夜孵育，加入二抗，DAB顯示，蘇木素復(fù)染。經(jīng)脫水、透明、封片，上鏡觀察。以PBS替代一抗為陰性對照。結(jié)果判定：FOXA2蛋白主要表達于胞漿，以胞漿中出現(xiàn)黃色或黃褐色染色為陽性；隨機取5個高倍視野，采用半定量法[7]對結(jié)果判定：（1）染色強度：按不染色、淺黃、黃色、棕黃色分別賦分0～3分；（2）陽性細胞比例：按＜10%、10%～25%、26%～50%、51%～75%和＞75%分別賦分0～4分。上述兩項評分相乘作為最終評分，陰性：0～4分，陽性：≥5分。所有切片均由2位病理科醫(yī)師獨立完成閱片。

1.3.2 細胞培養(yǎng)和處理：人胰腺癌PANC-1細胞用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，AsPC-1細胞用含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基培養(yǎng)，培養(yǎng)條件：37 ℃、飽和濕度、5% CO2。24 h后，胰酶消化，傳代培養(yǎng)。取對數(shù)生長期細胞，按轉(zhuǎn)染試劑盒說明進行轉(zhuǎn)染。分組方法：（1）siRNA-FOXA2組：轉(zhuǎn)染FOXA2的siRNA序列：5'-ACCAGTGGATCATGG ACCT-3'；（2）siRNA-NC組：轉(zhuǎn)染陰性對照序列：5'-T TCTCCGAACGTGTCATGT-3'；（3）對照組：不作任何處理。轉(zhuǎn)染后各組繼續(xù)培養(yǎng)48 h完成后續(xù)實驗。

1.3.3 實時熒光定量PCR技術(shù)檢測細胞中FOXA2基因表達：取各組轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)48 h細胞，加入細胞裂解液，用Trizol總RNA提取試劑提取細胞中總RNA，使用紫外分光光度計檢測純度，標準為A260/A280在1.80～2.20。用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒對RNA進行逆轉(zhuǎn)錄，用實時熒光定量PCR儀，按PCR試劑盒說明對引物進行擴增。引物序列：FOXA2：上游：5'-TGGAGCAGC TACTATGCAG-3'，下游：5'-CGTGTTCATGCCGTT CATC-3'；GAPDH：上游：5'-ATGTTCGTCATGGGT GTGAA-3'；下游：5'-GGTGCTAAGCAGTTGGTGG T-3'。PCR反應(yīng)條件：94 ℃ 3 min，94 ℃ 30 s，94 ℃30 s，60 ℃ 30 s，76 ℃ 30 s，連續(xù)循環(huán)38次。每個樣品設(shè)平行復(fù)孔6個。用2-△△Ct法獲得細胞中FOXA2 mRNA相對表達量。

1.3.4 Western blotting檢測細胞中FOXA2蛋白表達：各組細胞培養(yǎng)48 h后，提取總蛋白，并按BCA法測定濃度。取50 μg總蛋白，行SDS-PAGE凝膠電泳分離，電轉(zhuǎn)移至PVDF膜，室溫下用10%脫脂奶粉封閉120 min，加入一抗兔抗FOXA2多克隆抗體，4 ℃過夜孵育，TBST沖洗3次，加入二抗，室溫孵育60 min，TBST沖洗3次，加入ECL暗室下反應(yīng)10 min，拍照，用Image J軟件對蛋白條帶分析。

1.3.5 CCK-8法檢測細胞增殖活性：取各組轉(zhuǎn)染后細胞，制備單細胞懸液，濃度為6×104/mL，各取100 μL加入至96孔板，置于37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，分別于24、48、72和96 h時，棄培養(yǎng)液，加入CCK-8液，37 ℃培養(yǎng)60 min，用酶聯(lián)免疫儀取450 nm波長處檢測各孔吸光度值（OD），每組設(shè)6個復(fù)孔。

1.3.6 Transwell法檢測細胞遷移能力：取各組轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)48 h細胞，胰酶消化，離心后取細胞沉淀，用無血清培養(yǎng)液重懸，調(diào)整密度為5×104個/mL，取200 μL加入到Transwell小室上室，下室則加入600 μL的含10%胎牛血清的培養(yǎng)液，培養(yǎng)條件同1.2.2。24 h后取出小室，多聚甲醛固定，結(jié)晶紫染色，用棉簽將散落的細胞去除，鏡下隨機取5個視野計數(shù)穿膜細胞數(shù)。

1.3.7 Transwell法檢測細胞侵襲能力：取液態(tài)Matrigel基質(zhì)膠，用預(yù)冷無血清培養(yǎng)液按1:6體積稀釋，取40 μL加入到Transwell小室上室，風(fēng)干備用。其余步驟同1.2.4。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析

使用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析，計數(shù)資料采用率值表示，組間比較采用χ2檢驗，計量資料采用（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析和LSD-t檢驗，生存分析采用Kaplan-Meier法和Log-Rank檢驗，影響患者預(yù)后的危險因素分析采用COX比例風(fēng)險回歸模型，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 胰腺癌和癌旁組織中FOXA2蛋白表達情況

胰腺癌組織中FOXA2蛋白陽性表達率32.39%（23/71），低于癌旁組織的83.10%（59/71），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=37.405，P＜0.001），見圖1。

圖1 胰腺癌和癌旁組織中FOXA2蛋白表達（免疫組化，×200）

2.2 胰腺癌組織中FOXA2蛋白表達與臨床病理指標間的關(guān)系

胰腺癌組織中FOXA2蛋白陽性表達與年齡、性別、腫瘤大小、腫瘤部位和分化程度無關(guān)（P＞0.05），而與TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和脈管癌栓有關(guān)（P＜0.05），見表1。

2.3 胰腺癌組織中FOXA2蛋白表達與預(yù)后的相關(guān)性

表1 胰腺癌組織中FOXA2蛋白表達與臨床病理指標間的關(guān)系

根據(jù)胰腺癌組織中FOXA2蛋白表達情況，將患者分為陽性組（n=22）和陰性組（n=46），Kaplan-Meier生存分析結(jié)果顯示，陽性組患者平均生存時間（28.46±3.30）個月，高于陰性組的（15.17±1.83）個月，Log-Rank檢驗差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=11.135，P=0.001），見圖2。

2.4 胰腺癌患者生存時間的影響因素分析

Cox比例風(fēng)險回歸模型結(jié)果顯示，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、脈管癌栓和FOXA2蛋白陰性表達是影響患者預(yù)后的風(fēng)險因素（P＜0.05），見表2。

表2 影響胰腺癌患者生存時間的多因素Cox比例風(fēng)險回歸模型分析

圖2 Kaplan-Meier法分析胰腺癌組織中FOXA2蛋白表達對預(yù)后的影響

2.5 各組細胞中FOXA2 mRNA和蛋白表達情況

siRNA-NC組和對照組細胞中FOXA2 mRNA和蛋白表達量無統(tǒng)計學(xué)差異（P=0.345和0.106），siRNA-FOXA2組細胞中FOXA2 mRNA和蛋白表達量低于siRNA-NC組和對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見表3。

2.6 FOXA2基因沉默對各組細胞增殖活性的影響

CCK-8實驗結(jié)果顯示，siRNA-FOXA2組24、48、72和96 h時OD值均高于siRNA-NC組和對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見表4。

2.7 FOXA2基因沉默對各組細胞遷移和侵襲能力的影響

siRNA-NC組和對照組遷移細胞數(shù)和侵襲細胞數(shù)均無差異（P＞0.05），siRNA-FOXA2組遷移細胞數(shù)和侵襲細胞數(shù)均高于siRNA-NC組和對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見表5、圖3和圖4。

3 討論

臨床研究發(fā)現(xiàn)，胰腺癌患者確診時超過80%的已出現(xiàn)遠處轉(zhuǎn)移，從而錯失了最佳的手術(shù)根治時機[8]。研究表明，高侵襲轉(zhuǎn)移性是導(dǎo)致胰腺癌患者病情進展快、病死率高的重要因素[9]。因此，積極探討影響胰腺癌侵襲轉(zhuǎn)移的相關(guān)機制及敏感基因?qū)Ω纳苹颊哳A(yù)后具有積極意義。FOXA2作為調(diào)控胚胎發(fā)育的重要基因，在細胞增殖、分化、器官形成中發(fā)揮重要作用[10]；同時，研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)OXA2在肝癌、乳腺癌、肺腺癌、胃癌等多種惡性腫瘤組織中表達缺失，可能發(fā)揮抑癌基因的功能[11-14]。本研究結(jié)果顯示，胰腺癌組織中FOXA2蛋白陽性表達率低于癌旁組織，說明FOXA2蛋白在胰腺癌組織中呈低表達，可能發(fā)揮抑癌基因的功能而參與胰腺癌發(fā)生。在與臨床病理特征之間的關(guān)系分析發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)OXA2蛋白在TNM分期III期、發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及出現(xiàn)脈管癌栓的胰腺癌組織中陽性表達率更低，說明FOXA2蛋白低表達與胰腺癌惡性進行有關(guān)，提示FOXA2可能參與了胰腺癌惡性化過程。Kaplan-Meier生存分析結(jié)果顯示，F(xiàn)OXA2蛋白陽性組患者平均生存時間高于陰性組，說明FOXA2蛋白表達與胰腺癌患者預(yù)后有關(guān)，陽性表達者總體生存時間長于陰性者。Cox比例風(fēng)險回歸模型結(jié)果顯示，F(xiàn)OXA2蛋白陰性表達是影響患者預(yù)后的風(fēng)險因素，進一步說明FOXA2蛋白與胰腺癌患者預(yù)后有關(guān)，是影響預(yù)后的風(fēng)險因素。

表3 各組細胞中FOXA2 mRNA和蛋白表達比較（n=6， ±s）

表3 各組細胞中FOXA2 mRNA和蛋白表達比較（n=6， ±s）

注：與對照組比較，*P＜0.05；與siRNA-NC組比較，#P＜0.05

組別 FOXA2 mRNA FOXA2蛋白siRNA-FOXA2組 1.23±0.12*# 0.23±0.04*#siRNA-NC組 2.46±0.12 0.84±0.06對照組 2.55±0.23 0.79±0.07 F值 118.669 213.467 P值 ＜0.001 ＜0.001

表4 各組細胞不同時點吸光度OD值比較（n=6，±s）

表4 各組細胞不同時點吸光度OD值比較（n=6，±s）

注：與對照組比較，*P＜0.05；與siRNA-NC組比較，#P＜0.05

組別 24 h 48 h 72 h 96 h siRNA-FOXA2組 0.32±0.05*# 0.48±0.04*# 0.72±0.12*# 0.85±0.05*#siRNA-NC組 0.15±0.07 0.31±0.02 0.43±0.02 0.62±0.03對照組 0.19±0.04 0.27±0.09 0.46±0.04 0.66±0.05 F值 16.427 21.073 30.959 53.869 P值 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001

圖3 Transwell法檢測細胞遷移能力（結(jié)晶紫染色，×200）

圖4 Transwell法檢測細胞侵襲能力（結(jié)晶紫染色，×200）

本研究利用siRNA技術(shù)特異性下調(diào)PANC-1細胞中FOXA2基因，結(jié)果顯示，siRNA-FOXA2組細胞中FOXA2 mRNA和蛋白表達量均低于siRNA-NC組和對照組，說明兩種細胞中FOXA2基因表達被成功抑制。王曦等[15]研究指出，過表達FOXA2后會抑制結(jié)直腸癌細胞的增殖，促進癌細胞的凋亡。本研究CCK-8實驗結(jié)果顯示，siRNA-FOXA2組24、48、72和96 h時OD值均高于siRNA-NC組和對照組，說明沉默F(xiàn)OXA2基因表達可明顯增強細胞的增殖活性。有研究指出，F(xiàn)OXA2信號通路與腫瘤細胞侵襲轉(zhuǎn)移過程密切相關(guān)[16]。本研究結(jié)果顯示，siRNA-FOXA2組遷移細胞數(shù)和侵襲細胞數(shù)均低于siRNA-NC組和對照組，說明特異性下調(diào)PANC-1細胞中FOXA2表達，細胞遷移和侵襲能力均增強，提示FOXA2基因可能參與了胰腺癌細胞遷移和侵襲過程，但具體機制尚待進一步研究明確。

表5 不同組PANC-1和AsPC-1遷移細胞數(shù)和侵襲細胞數(shù)比較（n=6，±s）

表5 不同組PANC-1和AsPC-1遷移細胞數(shù)和侵襲細胞數(shù)比較（n=6，±s）

注：與對照組比較，*P＜0.05；與siRNA-NC組比較，#P＜0.05

組別 遷移細胞數(shù) 侵襲細胞數(shù)siRNA-FOXA2組 112.85±5.32*# 104.03±7.20*#siRNA-NC組 76.30±4.77 83.15±9.58對照組 79.44±6.87 85.80±16.93 F值 75.376 13.100 P值 ＜0.001 ＜0.001

綜上所述，胰腺癌組織中FOXA2蛋白呈低表達，且與腫瘤惡性化及患者預(yù)后有關(guān)，是影響患者預(yù)后的風(fēng)險因素，F(xiàn)OXA2基因可能參與了胰腺癌細胞增殖、遷移和侵襲過程，沉默F(xiàn)OXA2基因表達，胰腺癌細胞增殖、遷移和侵襲力明顯增強。FOXA2基因有望為胰腺癌臨床診療提供新的潛在靶點，為藥物研發(fā)提供新的線索。