Foxp3在不同的癌癥分期喉癌患者中表達的研究

陳靖昀，于書劍，肖 冬*

（1.延邊大學(xué)醫(yī)學(xué)院，吉林 延邊 133002；2.吉林大學(xué)第一醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科，長春 130021）

Foxp3 作為免疫系統(tǒng)的主要組成部分的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子,是X 染色體上基因編碼的叉頭樣轉(zhuǎn)錄因子forkhead 家族成員，并特異性表達于CD4+CD25+Treg細胞，在維持免疫自身功能的Treg 細胞中的發(fā)育成熟過程中發(fā)揮重要作用[1]，大量研究提示，F(xiàn)oxp3 基因多態(tài)性與自身免疫性疾病和癌癥的發(fā)生有關(guān)，F(xiàn)oxp3相關(guān)基因的突變或缺失會出現(xiàn)免疫系統(tǒng)疾病，如類風(fēng)濕、系統(tǒng)性紅斑狼瘡等[2]；過表達的Foxp3 在機體則會對病毒、腫瘤及器官移植產(chǎn)生免疫耐受。同時，高水平表達的Foxp3 與結(jié)直腸癌、黑色素瘤、肺癌中腫瘤的發(fā)生、復(fù)發(fā)、臨床預(yù)后有著著密切關(guān)系[3-5]。據(jù)報道，F(xiàn)oxp3 發(fā)揮作用的方式可能通過以下兩個方面是調(diào)節(jié)目標基因的轉(zhuǎn)錄水平：一方面誘發(fā)上調(diào)與Foxp3結(jié)合的CTLA-4 受體5’調(diào)節(jié)區(qū)或者編碼CD24 和IL-2受體-α，這種作用可以促進T 細胞組蛋白乙?；虲TLA-4 和CD25 的轉(zhuǎn)錄；另一方面，F(xiàn)oxp3 可以通過與IL-2、IL-7RA、IFN-γ 的啟動子結(jié)合，抑制組蛋白的乙?；腿旧|(zhì)重塑，下調(diào)IL-7R 和IL-2 的表達[6]。

喉鱗狀細胞癌是耳鼻喉高發(fā)的惡性腫瘤，在我國東北部發(fā)病率居高不下，發(fā)病率占全部頭頸惡性腫瘤的22%，我國喉癌發(fā)生率為0.35 ～1.15/10 萬人，尋找有效的治療方法一直是臨床的迫切需求。目前國內(nèi)外對于喉癌患者與Foxp3 相關(guān)表達研究較少，本研究對不同臨床癌癥分期喉癌患者標本中Foxp3 的表達量進行對比分析，對喉癌患者的治療評價有著重要意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2012年6月-2014年6月在我院就診的喉癌患者共45 例，其中男性36 例，女性9 例，年齡43 ～79 歲，平均59.2 歲；所有患者經(jīng)手術(shù)后病理切片證實均為鱗狀細胞癌，腫瘤分期參照國際抗癌協(xié)會（UICC）第六版TNM 分期系統(tǒng)，其中 I 期 2 例；II 期17 例；III 期5 例，Ⅳ期21 例。Foxp3 抗體（Abcam公司）；sp 免疫組化試劑盒（北京博奧森生物技術(shù)有限公司）；DAB 顯色試劑盒（北京博奧森生物技術(shù)有限公司）；蘇木精染液由實驗室配置；光學(xué)顯微鏡及拍照系統(tǒng)（Olympus 公司）。

1.2 免疫組化染色 患者喉癌組織切片脫蠟至蒸餾水，高壓鍋進行抗原修復(fù)10 min，冷卻至室溫。蒸餾水洗1 次5 min，PBS 洗2 次各5 min；利用sp 免疫組化試劑盒說明按順序加入3% H2O2 ，15 min 后洗脫再加入試劑A 孵育15 min，傾去，加入1：100 稀釋的一抗Foxp3 抗體，-4℃冰箱過夜孵育；第二天PSBS 洗3 次各5 min，滴加試劑B 室溫孵育15 min，PBS 洗3次各5 min，最后滴加試劑C 室溫孵育15 min，PBS 洗3 次各5 min；DAB 顯色5 ～20 min，自來水充分沖洗；蘇木精復(fù)染2 ～3 min，自來水充分沖洗分化，脫水，透明，中性樹脂封片。

利用IPP 軟件進行免疫組化吸光度表達分析，對比不同分期的喉癌患者切片組織中Foxp3的表達情況。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 所獲得數(shù)據(jù)用SPSS 軟件進行統(tǒng)計分析，因所得數(shù)據(jù)均為計量資料，以均數(shù)±標準差（±s）表示，故采用配對t檢驗，以P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義

2 結(jié)果

2.1 喉癌患者基本信息及分期 收集近3年來在我院入院治療喉癌患者的癌組織，觀察組共入組45 例，其中男性36 例，女性9 例，年齡43 ～79 歲，腫瘤分期參照國際抗癌協(xié)會（UICC）第六版TNM 分期系統(tǒng)，其中 I 期 2 例；II 期17 例；III 期5 例，Ⅳ期21 例。具體見表1。

表1 喉癌患者基本信息

2.2 喉癌患者組織中Foxp3 表達情況 利用免疫組化方法，對其中Foxp3 表達水平，免疫組化相對陽性表達區(qū)域，并結(jié)合患者病理臨床分期進行統(tǒng)計，由于I 期人數(shù)較少，不能進行統(tǒng)計學(xué)計算，這里對II 期、III 期、Ⅳ期的病例進行組間比較，與II 期喉癌患者相分別比較，III 期喉癌患者喉癌組織中和Ⅳ期喉癌患者喉癌組織中Foxp3的表達明顯增高（**P＜0.05，##P＜0.05），III 期、Ⅳ期2組間相比較有表達升高趨勢，但無明顯統(tǒng)計學(xué)差異。說明Foxp3 的表達高低可能與喉癌患者的腫瘤發(fā)展的分期相關(guān)，臨床分期越高的喉癌患者喉癌組織中Foxp3 的表達水平越高具體見圖1。

3 結(jié)論

喉癌是頭頸部腫瘤中的惡性腫瘤之一，嚴重威脅著患者的健康，尋找有效的治療方法一直是臨床的迫切需求。目前臨床上主要采取手術(shù)、放射治療，藥物靶向化療等綜合治療方法。叉頭轉(zhuǎn)錄因子Foxp3 已經(jīng)被確定是通過直接或間接調(diào)節(jié)眾多基因表達，來對Tregs 進行調(diào)節(jié)，進而促進腫瘤細胞的免疫耐受和免疫逃逸。最近一些研究也證明，不同的癌癥細胞系也會顯著表達癌癥患者的Foxp3 水平，在一些癌癥患者的組織樣本中，高表達的Foxp3 水平往往與癌癥患者的不良結(jié)果相關(guān)，如NSCLC，胃癌，食管癌或黑色素瘤，并且降低膀胱癌患者的總生存率[7-10]。所以Foxp3 的表達水平已經(jīng)成為了各種免疫治療效果和腫瘤免疫研究 的評價指標之一。

圖1 喉癌患者分期與Foxp3 的表達免疫組化結(jié)果（200×）

本研究利用免疫組化手段，研究喉癌患者組織中Foxp3 表達情況與臨床分期的具體情況，喉癌患者臨床分期越高的患者其癌癥組織中，F(xiàn)oxp3 的表達隨之上升，這可能提示我們，F(xiàn)oxp3 在喉癌的發(fā)展過程中起到促進腫瘤發(fā)展的作用，但是具體的作用機制需要進一步進行的研究與驗證。