應(yīng)用鈦表面二氧化鈦納米管誘導(dǎo)牙周膜干細(xì)胞成骨分化的實(shí)驗(yàn)研究

遲丹丹 徐海峰 李陽

種植材料對機(jī)體內(nèi)牙種植體成功植入十分重要[1]。以往臨床上多應(yīng)用鈦以及鈦合金作為種植材料，但是仍存在骨誘導(dǎo)性差、生物活性低、金屬離子釋放、塑性行變等問題[2]。目前納米仿生表面修飾逐漸應(yīng)用于鈦種植體上，研究顯示二氧化鈦納米管加在BMP-2后能夠促進(jìn)成骨細(xì)胞的黏附與生長、骨向分化[3]。牙周膜中的牙周膜干細(xì)胞(human periodontal ligament stem cells，hPDLSCs)具有成脂、成骨以及神經(jīng)分化的能力[4]。本研究通過在采用陽極氧化法在鈦金屬表面制備雙層二氧化鈦并通過羰基二咪唑、rhBMP-2化學(xué)修飾法構(gòu)建復(fù)合生物活性層，并在其上培養(yǎng)hPDLSCs，探究二氧化鈦納米管表面處理對hPDLSCs成骨分化的影響，為鈦種植體在臨床應(yīng)用提供一定的參考。

1 材料與方法

1.1 主要儀器與試劑

蛋白凝膠成像儀、熒光定量PCR儀(Bio-Red公司， 美國)； 流式細(xì)胞儀(Thermo Fisher Scientific公司，美國)； 堿性磷酸酶染色劑、β-甘油磷酸鈉、抗壞血酸、茜素紅(Sigma 公司， 美國)； 2×SYBR Premix Ex Taq II [寶生物工程(大連)有限公司]； 胎牛血清、DMEM培養(yǎng)基、 兔抗人ALP、 OCN、 CD44、 CD90、 CD146、 CD105、 BMP2、 RUNX2抗體(Gibco公司， 美國)；辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔二體(R&D公司， 美國)； RNA提取和反轉(zhuǎn)錄試劑盒均(北京天根生化科技有限公司)。

1.2 hPDLSCs分離、培養(yǎng)

選擇因正畸治療需要所拔除的第三磨牙，按常規(guī)方法分離、 原代和傳代培養(yǎng)hPDLSCs， 第三代時用于后續(xù)研究。

1.3 hPDLSCs細(xì)胞鑒定

1.3.1 顯微鏡下觀察hPDLSCs細(xì)胞形態(tài) 取原代細(xì)胞以及培養(yǎng)至第3 代的hPDLSCs細(xì)胞培養(yǎng)3 d的后置于顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)。

1.3.2 流式細(xì)胞儀檢測hPDLSCs細(xì)胞 將hPDLSCs細(xì)胞用胰蛋白酶進(jìn)行消化后，制備細(xì)胞懸浮液分別添加在4 個流式管內(nèi)，A管入5 μl CD44-FITC，B管內(nèi)加入5 μl CD105-FITC 單抗CD90-APC 單抗，C管內(nèi)加入5 μl CD146-PE單抗，D管為空白對照組。將所有流式管置于4 ℃冰箱中孵育45 min， PBS清洗后離心收集細(xì)胞，制成細(xì)胞懸浮液，流式細(xì)胞儀測定。

1.3.3 細(xì)胞生長曲線測定 將第三代培養(yǎng)的hPDLSCs細(xì)胞用胰蛋白酶進(jìn)行消化后，制備細(xì)胞懸浮液調(diào)整細(xì)胞密度為4×103個/L接種細(xì)胞培養(yǎng)板，加入成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基在37 ℃ 5% CO2培養(yǎng)箱進(jìn)行培養(yǎng)， 在450 nm波長測定培養(yǎng)液A值，繪制生長曲線。

1.4 hPDLSCs誘導(dǎo)培養(yǎng)

1.4.1 鈦片處理 鈦片尺寸(Ti-6Al-4V)為1 mm×1 mm×0.01 mm，采用鈦金屬表面處理器進(jìn)行處理，參數(shù)設(shè)置：電壓為520 V，電泳緩沖液中鈣磷比為2.14∶1，處理后采用激光切割為小鈦箔片，并用碳化硅金相砂紙將將鈦片打磨拋光，隨后在無水乙醇、丙醇溶液中進(jìn)行超聲波清洗，高壓滅菌后備用。

1.4.2 二氧化鈦納米管制備 在電解槽中添加濃度為88 mmol/L的氟化銨乙二醇電解液，試件為陽極，石墨作為陰極，預(yù)先活化電解液30 min，隨后采取兩步法制備雙層二氧化鈦納米管：①電壓設(shè)置為60 V，電解2 h后超聲清洗去掉表面阻擋層；②恒定電壓設(shè)為12 V，電解40 min后完成雙層二氧化鈦納米管，用去離子水超聲清洗后，干燥后備用。

1.4.3 羰基二咪唑-rhBMP-2處理二氧化鈦納米管 將雙層二氧化鈦納米管置于20 g/L含丙酮的羰基二咪唑溶液中充分混勻30 min，用丙酮溶液清洗后，干燥后備用。將預(yù)處理后的羰基二咪唑加入500 μl 0.1 g/L rhBMP-2/PBS溶液，清置于37 ℃搖床上， 30 r/min 24 h，丟掉上層溶液后，在PBS溶液中清洗2 次后干燥后置于4 ℃冰箱中備用。

1.4.4 實(shí)驗(yàn)分組 實(shí)驗(yàn)主要分為3 組。實(shí)驗(yàn)組：將處理后鈦片置入培養(yǎng)板內(nèi)，取單細(xì)胞懸浮液，調(diào)整細(xì)胞密度為5×104/ml，接種鈦片表面，添加DMEM培養(yǎng)基沒過鈦片培養(yǎng)，3 d后在電鏡下觀察鈦片表面hPDLSCs細(xì)胞粘附情況。陽性對照組：取單細(xì)胞懸浮液，接種于成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基(含10%胎牛血清， 0.1 μmol/L地塞米松， 0.5 mmol/L β-甘油磷酸鈉， 50 mg/L維生素C的DMEM)進(jìn)行培養(yǎng)?？瞻捉M：取單細(xì)胞懸浮液，接種于DMEM培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。

1.5 堿性磷酸酶(Alkaline phosphatase,ALP)與茜素紅染色檢測

取單細(xì)胞懸浮液接種于放置載玻片的6 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，培養(yǎng)11 d后進(jìn)細(xì)胞染色，培養(yǎng)結(jié)束PBS溶液清洗細(xì)胞，加入多聚甲醛進(jìn)行固定30 min，PBS溶液清洗后，加入ALP與茜素紅染色劑染色30 min，PBS清洗后，將切片置于顯微鏡下觀察記錄。

1.6 RT-PCR法測定hPDLSCs細(xì)胞DMP-1、Runx-2、Osterix、OCN表達(dá)

將培養(yǎng)11 d后的細(xì)胞收集后進(jìn)行RNA提取并反轉(zhuǎn)錄為cDNA，RT-PCR反應(yīng)體系：10×cDNA模板1 μl, 上下游引物各0.5 μl, H2O 8 μl,10 μl 2×SYBR Mix。按照反應(yīng)程序95 ℃ 3 min， 94 ℃ 10 s、 60 ℃ 20 s， 72 ℃ 2 min， 30 cycles， 72 ℃10 min, 以GAPDH作為內(nèi)參按照2-ΔΔCq算法進(jìn)行基因相對定量表達(dá)分析。

1.7 Western blot檢測hPDLSCs細(xì)胞DMP-1、Runx-2、Osterix、OCN蛋白表達(dá)

收集hPDLSCs細(xì)胞，加入蛋白裂解液在冰上裂解后離心收集上清，提取總蛋白后采用PAGE-SDS電泳分離蛋白，結(jié)束后將蛋白凝膠轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，行轉(zhuǎn)膜反應(yīng)，加入封閉液后，加入一抗稀釋液(DMP-1、 Runx-2、 Osterix、 OCN抗體)， 4 ℃震蕩過夜，清洗后加入二抗稀釋液，室溫下孵育2 h，用凝膠成像儀對蛋白表達(dá)結(jié)果進(jìn)行分析。

1.8 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié) 果

2.1 hPDLSCs細(xì)胞鑒定

顯微鏡觀察顯示原代細(xì)胞培養(yǎng)第4～5 天細(xì)胞逐漸聚集形成纖維狀，細(xì)胞呈梭形，緊密相鄰(圖 1A)。細(xì)胞培養(yǎng)至第三代時，細(xì)胞迅速貼壁均勻生長細(xì)胞形態(tài)較單一，恢復(fù)至長梭形(圖 1B)。生長曲線見圖 2。

流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果顯示，hPDLSCs表面CD44陽性表達(dá)率為99.2%，CD146為29.3%，CD105為3.7%，CD90為99.5%，符合牙周膜干細(xì)胞表面特異性標(biāo)記物特征(圖 3)。

2.2 鈦片表面變化以及hPDLSCs細(xì)胞粘附情況

圖 1 hPDLSCs細(xì)胞形態(tài) (×100) 圖 2 hPDLSCs生長曲線

Fig 1 Morphology of hPDLSCs (×100) Fig 2 Growth curve of hPDLSCs

圖 3 hPDLSCs細(xì)胞表面抗原細(xì)胞(FCM)

掃描電鏡顯示羰基二咪唑、rhBMP-2處理后的鈦片表面雙層納米管陣排列整齊，內(nèi)外管緊密相連，表面出現(xiàn)粟粒狀顆粒(圖 4)，hPDLSCs細(xì)胞細(xì)胞粘附于鈦片表面，表面飽滿光滑，突起狀互相連接(圖 4)。

2.3 ALP、茜素紅染色結(jié)果

hPDLSCs細(xì)胞ALP染色顯示細(xì)胞核染色呈藍(lán)紫色，細(xì)胞質(zhì)呈淡紫色(圖 5)，陽性對照組以及實(shí)驗(yàn)組ALP陽性細(xì)胞數(shù)、鈣結(jié)節(jié)數(shù)量明顯多于空白對照組(圖 5)。

2.4 DMP-1、Runx-2、Osterix、OCN基因表達(dá)

與空白對照組相比，陽性對照組與實(shí)驗(yàn)組 hPDLSCs細(xì)胞DMP-1、Runx-2、Osterix、OCN基因表達(dá)量均升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)(圖 6)。

2.5 DMP-1、Runx-2、Osterix、OCN蛋白表達(dá)

Western blot 結(jié)果顯示，陽性對照組與實(shí)驗(yàn)組 hPDLSCs細(xì)胞DMP-1、Runx-2、Osterix、OCN蛋白表達(dá)量均高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)(圖 7， 表 1)。

圖 4 掃描電鏡觀察

3 討 論

對鈦表面氧化層進(jìn)行預(yù)處理后能夠改變表面生物活性，使有機(jī)硅烷以及光敏物質(zhì)與氧化層強(qiáng)力結(jié)合，將多肽、細(xì)胞生長因子等固定其表面，引導(dǎo)發(fā)生特異組織學(xué)行為[5]。近期較多研究對鈦表面進(jìn)行處理使其發(fā)生羥基化后再經(jīng)過交聯(lián)劑向外接枝偶聯(lián)來構(gòu)建新型表面生物活性材料[6]。目前常用的交聯(lián)劑主要有羥基二咪唑、聚多巴胺、硅烷化、聚乙二醇等[7]。本研究將二氧化鈦納米管陣列作為基體，羰基二咪唑作為中間體，外接rhBMP-2，因?yàn)槎趸伡{米管表面粗糙，具有抑菌作用，rhBMP-2能夠?yàn)樵缙诩?xì)胞生長提供一定的微環(huán)境， 但由于半衰期較短因此通過虹吸與二氧化鈦表面緩解其釋放速度；羰基二咪唑與rhBMP-2通過共價結(jié)合產(chǎn)生更為穩(wěn)定的物理吸附作用，在機(jī)體內(nèi)存留的時間更為持久。

圖 5 hPDLSCs細(xì)胞ALP、茜素紅染色

(×100)

Fig 5 ALP and alizarin red staining of hPDLSCs

(×100)

本研究培養(yǎng)的hPDLSCs符合典型細(xì)胞特征[8]。流式細(xì)胞儀檢測顯示hPDLSCs細(xì)胞CD90、CD44高表達(dá)，CD146、CD105低表達(dá)，與國外相關(guān)文獻(xiàn)報道結(jié)果相符合[9]。較多研究均證實(shí)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞、牙髓干細(xì)胞均能夠在鈦表面進(jìn)行成骨分化[10]。動物研究研究發(fā)現(xiàn)成骨細(xì)胞能夠粘附在鈦表面進(jìn)行增殖分化[11]，還有相關(guān)研究顯示鈦表面的粗糙、內(nèi)部多孔構(gòu)造，能夠使提高材料表面的生物相容性，加大親水性，促進(jìn)細(xì)胞的吸附，細(xì)胞在鈦金屬表面粘附率達(dá)70%[12]。本研究掃描電鏡顯示羰基二咪唑、rhBMP-2處理后的鈦片表面雙層納米管陣排列整齊， 內(nèi)外管緊密相連，表面出現(xiàn)粟粒狀顆粒，表明二氧化鈦納米管-羥基二咪唑-rhBMP-2復(fù)合生物層內(nèi)部結(jié)構(gòu)有利于細(xì)胞粘附生長。ALP與鈣結(jié)節(jié)染色是評價細(xì)胞成骨能力的重要檢測方法，ALP是成骨細(xì)胞中重要的膜結(jié)合蛋白，能夠分解磷酸化合物產(chǎn)生磷酸鹽離子，聚集于骨組織中， 茜紅素能使富含鈣離子物質(zhì)著色[13]， 本研究顯示陽性對照組以及實(shí)驗(yàn)組ALP染色程度均明顯高于空白對照組， 提示hPDLSCs細(xì)胞在二氧化鈦納米管-羥基二咪唑-rhBMP-2復(fù)合生物層具有成骨分化能力，進(jìn)一步說明鈦片上存在骨基質(zhì)，hPDLSCs細(xì)胞趨向成熟礦化。

圖 6 hPDLSCs細(xì)胞DMP-1、 Runx-2、 Osterix、 OCN基因表達(dá)情況

Fig 7 Protein expression of DMP-1, Runx-2, Osterix and OCN in hPDLSCs

Runx2在充質(zhì)間干細(xì)胞分化成骨祖細(xì)胞過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，是成骨重要性標(biāo)準(zhǔn)，Osterix位于Runx2下游，兩者均屬于細(xì)胞核內(nèi)重要轉(zhuǎn)錄因子[14]。動物研究證實(shí)Runx-2基因缺失后骨細(xì)胞無分化能力，Osterix基因敲除后成骨細(xì)胞喪失分化功能，骨形成受到阻礙[15]。DMP-1屬于磷酸化非膠原蛋白，在牙本質(zhì)和骨骼中大量表達(dá)，在牙本質(zhì)形成中起到關(guān)鍵性作用。動物研究顯示敲除DMP-1后小鼠出現(xiàn)骨軟化、佝僂病等骨骼缺陷病癥，還有研究顯示DMP-1由于具有自身結(jié)構(gòu)具有酸性結(jié)構(gòu)域能夠集合鈣離子形成磷酸鈣結(jié)晶，因此與骨細(xì)胞礦化關(guān)系密切[16]。OCN主要存在于牙本質(zhì)、軟骨、 骨中是骨形成標(biāo)志性物質(zhì)。本研究結(jié)果顯示陽性對照組與實(shí)驗(yàn)組 hPDLSCs細(xì)胞DMP-1、 Runx-2、Osterix、OCN基因、蛋白相對表達(dá)量均高于對照組，說明hPDLSCs細(xì)胞在二氧化鈦納米管-羥基二咪唑-rhBMP-2復(fù)合生物層上培養(yǎng)也具有一定的成骨分化能力，可能通過控制成骨相關(guān)基因DMP-1、Runx-2、Osterix、OCN來實(shí)現(xiàn)。

Tab 1 Scanning gray values of DMP-1, OCN, Runx-2 and Osterix protiens in hPDLSCs

n=10)

注： ①與陽性對照組相比，P<0.05； ②與實(shí)驗(yàn)組相比，P<0.05

綜上所述，hPDLSCs細(xì)胞在二氧化鈦納米管-羥基二咪唑-rhBMP-2復(fù)合生物層上粘附生長具有一定的成骨分化能力，能夠影響成骨相關(guān)蛋白DMP-1、Runx-2、Osterix、OCN的表達(dá)。本研究也存在一定的局限，未對比不同鈦材料對hPDLSCs細(xì)胞成骨分化的影響，有待后續(xù)進(jìn)行深入研究。