正畸加力過程中外周血和脾臟中炎性單核細(xì)胞比例和CD226分子表達(dá)水平變化

王憲 馬千里 金作林 陳麗華

正畸牙齒移動(dòng)(OTM)和生理牙齒移動(dòng)被認(rèn)為是以破骨細(xì)胞和成骨細(xì)胞動(dòng)態(tài)平衡引發(fā)骨重塑為特征的反應(yīng)過程；而不同之處則在于正畸牙齒移動(dòng)過程中牙齒移動(dòng)的速度更快，正畸力引起的組織變化更加顯著和廣泛[1]。正畸力需要作用于牙周膜和牙槽骨才能啟動(dòng)正畸牙齒移動(dòng)這一反應(yīng)。正畸力的大小、方向和持續(xù)時(shí)間等都會(huì)對(duì)牙齒移動(dòng)的效果產(chǎn)生影響, 1951 年Reitan[2]的研究結(jié)果使人們開始重視“牙齒移動(dòng)是一系列骨吸收及改建的過程”這一理論。而破骨細(xì)胞作為目前可以溶解骨組織的重要細(xì)胞參與了正畸牙齒移動(dòng)過程中骨吸收及骨改建的過程。破骨細(xì)胞由單核/巨噬細(xì)胞而來(lái)，現(xiàn)已證明在體外誘導(dǎo)的情況下，單核細(xì)胞在M-CSF與RANKL的共同刺激下可以誘導(dǎo)分化為成熟的破骨細(xì)胞[3]，而在正畸過程中牙周膜內(nèi)的基質(zhì)細(xì)胞及成骨細(xì)胞所表達(dá)的RANKL和OPG等分子均參與了破骨細(xì)胞的分化和成熟過程[4-5]。但是這些分子的誘導(dǎo)作用首先都需要破骨前體細(xì)胞成功地從血管內(nèi)皮細(xì)胞間遷出血管到達(dá)作用部位才能得以實(shí)現(xiàn)。單核細(xì)胞是骨髓來(lái)源的細(xì)胞，存在于外周血和脾臟，被認(rèn)為是破骨細(xì)胞的前體[6]，正畸加力可以使脾臟和外周血中炎性單核細(xì)胞的比例在加力初期有所減少，但是加力7 d時(shí)炎性單核細(xì)胞比例恢復(fù)正常[7]，但是具體影響單核細(xì)胞比例變化的機(jī)制尚不明確。CD226分子是炎性單核細(xì)胞表面重要的分子標(biāo)志[8]，參與炎性單核細(xì)胞的遷移和功能[9]，但其在正畸加力過程中炎性單核細(xì)胞表面表達(dá)水平未見報(bào)道。鑒于此，本研究以小鼠為實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?，在觀測(cè)正畸加力過程中小鼠脾臟和外周血中炎性單核細(xì)胞比例改變的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步觀測(cè)CD226分子表達(dá)水平的變化。

1 材料與方法

1.1 主要材料及試劑

正畸用鎳鈦拉簧(上海埃蒙迪)；電子測(cè)力計(jì)(SF-5，浙江艾普)；0.1 mm結(jié)扎鋼絲(上海晨曦)；酸蝕劑(西湖巴爾)；EasyBond粘接劑、 Z350復(fù)合樹脂(3M， 美國(guó))；開口器及可移動(dòng)實(shí)驗(yàn)平臺(tái)(自制)；光固化燈(LED.B，廣西啄木鳥)；戊巴比妥鈉(默克，德國(guó))；流式熒光抗體(Biolegend，美國(guó))；小鼠淋巴細(xì)胞分離液(達(dá)優(yōu)，深圳達(dá)科為)； RPMI培養(yǎng)基(Hyclone， 美國(guó))；體式顯微鏡(Leica，德國(guó))。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

6～8 周齡無(wú)特定病原體(SPF級(jí))的雌性C57小鼠(空軍軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供)，體重18～20 g(飼養(yǎng)于第四軍軍醫(yī)大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院免疫教研室動(dòng)物房)，提供消毒飼料及消毒飲用水。

1.3 小鼠牙齒正畸加力模型的建立

選擇雌性C57小鼠，隨機(jī)分為3 組(加力1 d組、加力3 d組和加力7 d組)，每組中分為實(shí)驗(yàn)組及對(duì)照組(加力3 d組、加力7 d組各4 只， 加力1 d組中實(shí)驗(yàn)組5 只，對(duì)照組3 只)。使用0.01 g/ml的戊巴比妥鈉對(duì)小鼠進(jìn)行進(jìn)行腹腔注射(回抽無(wú)血，避免傷及內(nèi)臟)，注射量為1.5 ml。小鼠麻醉后將小鼠仰臥固定于實(shí)驗(yàn)臺(tái)上，使用自制開口器打開小鼠口腔，充分暴露左側(cè)上頜第一磨牙，使用乙醇棉球清潔牙面后酸蝕牙面，酸蝕60 s后使用酒精棉球擦拭牙面，吹干至牙齒表面呈現(xiàn)白堊色，涂布粘接劑后光固化10 s；拉簧長(zhǎng)度修建至4 mm，將一側(cè)第一圈彎折90°，另一側(cè)與0.1 mm結(jié)扎絲固定。將彈簧彎折側(cè)放置于第一磨牙上，使用適量粘接樹脂進(jìn)行粘接，而后光固化40 s。相同方法在雙側(cè)切牙上粘接一“綠豆?！贝笮〉臉渲?，將結(jié)扎絲置于樹脂球兩側(cè)，與測(cè)力計(jì)連接；移動(dòng)實(shí)驗(yàn)平臺(tái)待測(cè)力計(jì)數(shù)值顯示為0.39 N時(shí)停止在此位置上進(jìn)行結(jié)扎。術(shù)后喂以面包，每日早晚2 次觀察口內(nèi)彈簧如出現(xiàn)脫落，及時(shí)重新進(jìn)行粘接；加力7 d在3 d時(shí)再次對(duì)彈簧進(jìn)行加力。

1.4 標(biāo)本采集

小鼠在加力1、 3、 7 d后，摘除眼球法采集外周血于抗凝管中用以后續(xù)的流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)；之后將小鼠浸泡于70%乙醇溶液中5 min進(jìn)行消毒，而后將小鼠置于解剖臺(tái)上分離獲得脾臟，采用研磨的方法獲得脾臟的單細(xì)胞，用于流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)； 迅速分離小鼠上頜骨，放入多聚甲醛固定液中固定24 h后取出小鼠上頜骨標(biāo)本置于10% EDTA溶液中常溫進(jìn)行脫鈣， 3 d換脫鈣液， 3 周后使用針刺法檢查脫鈣情況；脫鈣結(jié)束后將骨標(biāo)本進(jìn)行修整，僅保留小鼠左側(cè)上頜磨牙，而后進(jìn)行包埋，石蠟切片進(jìn)行免疫組化及HE染色。

1.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)

加入小鼠淋巴細(xì)胞分離研磨獲得的小鼠脾臟單細(xì)胞懸液上放置1.5 ml RPMI培養(yǎng)基，在800 g下離心30 min(去剎車)，可見明顯的“白膜層”，使用彎頭滴管小心吸取白膜層細(xì)胞，注意勿將下層分離液吸出。使用5 ml流式洗液在1 000 r/min離心5 min， 2 遍后將細(xì)胞稀釋為10 ml，進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，根據(jù)計(jì)數(shù)結(jié)果每個(gè)流式管中放入1 ×106個(gè)細(xì)胞進(jìn)行檢測(cè)，每只小鼠設(shè)ISO(同型對(duì)照組)，F(xiàn)MO(熒光減一組)及EXP(實(shí)驗(yàn)組)分別進(jìn)行檢測(cè)，在每個(gè)流式管內(nèi)加入相應(yīng)流式熒光抗體，常溫下孵育20 min，洗滌兩遍后將細(xì)胞稀釋至適宜濃度進(jìn)行檢測(cè)。每管中加入外周血100 μl， 分組同脾臟，在每個(gè)流式管內(nèi)加入相應(yīng)流式熒光抗體，常溫下孵育20 min后每管中加入1 ml紅細(xì)胞裂解液，裂解紅細(xì)胞20 min(如20 min裂解不徹底可再次裂解)，而后使用流失洗液清洗2 遍后進(jìn)行檢測(cè)。

1.6 HE染色

常規(guī)HE染色封片， 光鏡下觀察小鼠第一磨牙牙根近遠(yuǎn)中根的不同部位來(lái)確定是否有破骨細(xì)胞生成。

1.7 免疫熒光染色

常規(guī)染色封片， 熒光顯微鏡下觀察小鼠第一磨牙牙根近遠(yuǎn)中根的不同部位破骨細(xì)胞生成情況。

1.8 統(tǒng)計(jì)方法

應(yīng)用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件(SPSS Inc，Chicago，USA)對(duì)所取得的數(shù)據(jù)資料進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，所取得的計(jì)量資料均選擇兩樣本Kolmogorov-Smirnov檢驗(yàn)(K-S檢驗(yàn))進(jìn)行統(tǒng)計(jì)對(duì)比分析， 檢驗(yàn)水平取0.05，雙側(cè)檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1 成功建立小鼠牙齒正畸移動(dòng)模型

模型建立期間均未出現(xiàn)拉簧脫落的情況，加力1、 3、 7 d后均可在體式顯微鏡下觀察到小鼠上頜第一磨牙遠(yuǎn)中存在間隙，證明小鼠上頜第一磨牙近中移動(dòng)有效，實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ徒⒊晒?圖 1A)；在體式顯微鏡下進(jìn)行拍照，測(cè)量間隙，并將數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，加力1 d時(shí)小鼠第一磨牙近中移動(dòng)(50.76±7.483) μm，加力3 d時(shí)小鼠第一磨牙近中移動(dòng)(85.95±4.532) μm，而加力7 d時(shí)小鼠第一磨牙近中移動(dòng)(121.1±7.468) μm,組間比較P<0.05。 將小鼠上頜骨標(biāo)本制作切片后行免疫熒光染色可見在加力7 d時(shí)， 小鼠近中根牙周膜近中側(cè)出現(xiàn)破骨細(xì)胞(圖 1B)。

2.2 正畸加力后脾臟及外周血中的炎性單核細(xì)胞比例和CD226分子表達(dá)水平發(fā)生變化

取小鼠脾臟和外周血單個(gè)核細(xì)胞進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)， 檢測(cè)發(fā)現(xiàn)脾臟及外周血中的炎性單核細(xì)胞比例均在正畸加力過程中出現(xiàn)了變化(圖 2A、2B)。 在脾臟中加力1 d時(shí)實(shí)驗(yàn)組中炎性單核細(xì)胞較對(duì)照組無(wú)明顯差異， 加力3 d時(shí)實(shí)驗(yàn)組中的炎性單核細(xì)胞(2.88%)比例較對(duì)照組(0.93%)中明顯增高，而到加力7 d時(shí)實(shí)驗(yàn)組中的炎性單核細(xì)胞比例仍較對(duì)照組無(wú)明顯差異， 在加力3 d時(shí)和加力7 d時(shí)脾臟炎性單核細(xì)胞表面CD226分子的平均熒光強(qiáng)度分別為5941和4997，均低于對(duì)照組(9758和8770)(圖 3A、3B)，在外周血中可見加力1 d時(shí)外周血中的炎性單核細(xì)胞比例(1.16%)較對(duì)照組(2.46%)出現(xiàn)了明顯的下降，而在加力3 d時(shí)外周血中的炎性單核細(xì)胞比例(9.02%)較對(duì)照組(2.23%)

圖 1 第一磨牙移動(dòng)和牙周膜中破骨細(xì)胞生成

(×25)

Fig 1 The movement of first molar and the osteoclasts in periodontal ligaments

圖 2 加力不同天數(shù)小鼠脾臟和外周血中炎性單核細(xì)胞比例變化

Fig 2 The ratio of inflammatory monocytes in the spleen and the peripheral blood of mouse in different periods

出現(xiàn)了明顯的升高，而在加力7 d時(shí)外周血中的炎性單核細(xì)胞比例(6.97)與對(duì)照組(1.81%)相比仍增高，但相比加力3 d組比例有所減少(圖 2B)。相較于對(duì)照組(6854和10078)，外周血中的炎性單核細(xì)胞表面CD226的平均熒光強(qiáng)度也在加力3 d(4302)及加力7 d(6766)時(shí)出現(xiàn)降低(圖 3B)。在加力1、 3、 7 d時(shí)炎性單核細(xì)胞中CD226+細(xì)胞比例均無(wú)明顯差異(圖 3C)。

2.3 小鼠正畸加力后牙周組織的變化及破骨細(xì)胞生成

取對(duì)照組、加力1 d、加力3 d和加力7 d組小鼠標(biāo)本制作石蠟切片行HE染色，光鏡下觀察，發(fā)現(xiàn)加力1 d時(shí)小鼠第一磨牙近中側(cè)牙周膜間隙變窄，但未見明顯破骨細(xì)胞；在加力3日時(shí)可見在近中側(cè)牙周膜處出現(xiàn)破骨細(xì)胞(1.5±0.29)；加力7 d時(shí)可見在近中側(cè)牙周膜處出現(xiàn)更多的破骨細(xì)胞(2.5±0.29)(圖 4A)，并隨著加力時(shí)間的延長(zhǎng)破骨細(xì)胞的數(shù)量有所增加(圖 4B)。

3 討 論

破骨細(xì)胞在正畸治療過程中具有重要的功能，因此對(duì)于破骨細(xì)胞的研究一直是正畸領(lǐng)域的熱點(diǎn)問題。目前為止正畸過程中牙周膜內(nèi)破骨細(xì)胞的分化增殖過程已基本清晰，當(dāng)正畸力加載于牙周膜，壓力側(cè)的牙周膜被壓縮，同時(shí)伴隨牙周膜血管的壓縮，造成局部供血不暢，形成局部的氧缺乏微環(huán)境。這將引發(fā)局部的炎癥反應(yīng)，炎癥因子如IL-1β、TNFα、PGE2、CSF-1、VEGF等大量分泌，這些因子的分泌使得局部血管通透性改變，大量成骨前體細(xì)胞募集至牙周膜，在局部成骨細(xì)胞和基質(zhì)細(xì)胞表達(dá)的RANKL刺激下使得破骨前體細(xì)胞逐漸分化為破骨細(xì)胞，從而產(chǎn)生破骨作用[10-12]。有文獻(xiàn)表明，CD226分子作為炎性單核細(xì)胞表面一種高表達(dá)的分子在單核細(xì)胞遷移出血管內(nèi)皮的過程中發(fā)揮重要作用[9,13]，因此本實(shí)驗(yàn)通過觀測(cè)正畸加力過程中小鼠體內(nèi)炎性單核細(xì)胞比例和CD226分子表達(dá)水平的動(dòng)態(tài)變化，旨在進(jìn)一步探索和明確正畸加力過程中的細(xì)胞和分子機(jī)制。

Zeng等[7]在研究正畸力對(duì)于炎性單核細(xì)胞的影響時(shí)發(fā)現(xiàn)，在加力初期不論是脾臟還是外周血中，炎性單核細(xì)胞的比例均下降， 而在后期出現(xiàn)回升, 相較于Zeng等的研究， 本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)， 在小鼠牙齒正畸加力模型建立1 d時(shí)，只有外周血中的單核細(xì)胞比例發(fā)生了下降，而脾臟和炎性單核細(xì)胞表面CD226分子表達(dá)水平均無(wú)明顯變化。正畸加力初始階段，組織反應(yīng)需要在一定的時(shí)間內(nèi)才能啟動(dòng)，加力1 d時(shí)，牙周膜局部的變化只能招募外周血中的單核細(xì)胞募集至作用部位，但是脾臟中的單核細(xì)胞受到加力影響的效果尚未體現(xiàn)，骨髓中的新生單核細(xì)胞尚未補(bǔ)充至外周血及脾臟；而在加力3 d時(shí)脾臟及外周血中的單核細(xì)胞數(shù)量有所增加，同時(shí)CD226分子表達(dá)降低。有文獻(xiàn)表明脾臟中貯存有大量的炎性單核細(xì)胞， 在炎癥發(fā)生時(shí)可以快速補(bǔ)充至外周血，進(jìn)而抵達(dá)作用部位[14]，而脾臟中的炎性單核細(xì)胞由骨髓中的單核細(xì)胞遷移而來(lái)[15]，在加力3 d時(shí)由于力量的持續(xù)刺激，脾臟中原有的炎性單核細(xì)胞補(bǔ)充至血液中，同時(shí)骨髓中產(chǎn)生的炎性單核細(xì)胞大量補(bǔ)充至外周血及脾臟，使得脾臟和外周血中炎性單核細(xì)胞比例均增加。而CD226分子表達(dá)水平降低可能是由于原本高表達(dá)CD226分子的炎性單核細(xì)胞已經(jīng)移動(dòng)至外周的作用部位所引起。加力7 d時(shí)，脾臟中炎性單核細(xì)胞比例與對(duì)照組無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，而CD226分子的表達(dá)出現(xiàn)降低可能是由于加力7 d時(shí)骨髓新生的炎性單核細(xì)胞已經(jīng)通過血液補(bǔ)充至脾臟，但是由于血中炎性單核細(xì)胞的CD226分子表達(dá)低，因此補(bǔ)充至脾臟的炎性單核細(xì)胞表面CD226分子表達(dá)水平依舊較對(duì)照組降低。由于本實(shí)驗(yàn)采用的拉簧和流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)方法與Zeng等[7]研究中所使用實(shí)驗(yàn)條件均不同，可能實(shí)驗(yàn)結(jié)果存在差異，故在后期實(shí)驗(yàn)中將加大樣本量，確保實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。

圖 3 加力不同天數(shù)小鼠脾臟和外周血中CD226+炎性單核細(xì)胞比例和平均熒光強(qiáng)度變化

Fig 3 The ratio and the MFI of CD226+inflammatory monocytes in the spleen and the peripheral blood of mouse in different periods

圖 4 加力不同天數(shù)小鼠第一磨牙近中根牙周膜中破骨細(xì)胞數(shù)量變化

正畸力的加載可以影響外周血和脾臟中炎性單核細(xì)胞比例的變化，同時(shí)加力后炎性單核細(xì)胞表面CD226分子的表達(dá)水平也存在變化，說明在正畸過程中CD226分子極有可能參與了正畸力作用下的牙齒移動(dòng)過程。CD226分子對(duì)正畸牙齒移動(dòng)過程產(chǎn)生影響的細(xì)胞和分子機(jī)制尚須進(jìn)一步深入探討。