選擇性加速溶劑萃取法結(jié)合超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測(cè)定杭白菊中19種三唑類殺菌劑

吳慧珍，李曉丹，汪建妹，王向軍，楊 華，徐 杰，吉小鳳，錢鳴蓉*

(1.浙江樹人大學(xué) 生物與環(huán)境工程學(xué)院，浙江 杭州 310015；2.浙江農(nóng)林大學(xué) 林業(yè)與生物技術(shù)學(xué)院，浙江 杭州 311300；3.浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究所，浙江 杭州 310021)

杭白菊(Chrysanthemummorifolium)為菊科多年生草本植物，藥食同源道地藥材，主產(chǎn)于浙江嘉興桐鄉(xiāng)、海寧等地，具有健胃通氣、平肝明目和清熱解毒之功效[1]，亦常用作飲品。在杭白菊的栽培過程中常施用殺菌劑等多類農(nóng)藥，以防治花葉病、葉枯病、根腐病、病毒病等病蟲害，故可能產(chǎn)生農(nóng)藥殘留。臺(tái)北市衛(wèi)生局對(duì)干菊花的抽樣調(diào)查顯示，近9成以上的干菊花存在農(nóng)藥殘留問題[2]。趙維良等[3]對(duì)28批菊花樣品中12種農(nóng)藥進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)多菌靈、毒死蜱的檢出率較高。方翠芬等[4]根據(jù)菊花產(chǎn)地和加工方法不同，對(duì)10批樣品中13種農(nóng)藥進(jìn)行檢測(cè)，其中三唑磷含量達(dá)0.492 mg/kg，超過限量近5倍。因此，為控制杭白菊的質(zhì)量，對(duì)其進(jìn)行農(nóng)藥殘留分析十分必要。

三唑類殺菌劑作為一種高效、低毒、廣譜的內(nèi)吸性殺菌劑，廣泛用于水果、蔬菜、中藥材等的病害防治。在藥材種植及加工、貯存等過程中過量或不當(dāng)施用農(nóng)藥，均可能產(chǎn)生藥物殘留，造成藥材污染[5]。我國(guó)對(duì)于藥材中農(nóng)殘檢測(cè)技術(shù)和監(jiān)測(cè)標(biāo)準(zhǔn)起步較晚，現(xiàn)行的GB 2762-2017《食品中污染物限量》及GB2763-2016《食品中農(nóng)藥最大殘留限量》標(biāo)準(zhǔn)中均無杭白菊中的農(nóng)藥殘留指標(biāo)[6-7]。關(guān)于菊花中農(nóng)藥殘留檢測(cè)主要集中于有機(jī)氯、菊酯類等殺蟲劑，較少涉及殺菌劑[8]。目前三唑類殺菌劑檢測(cè)的常用前處理技術(shù)有固相萃取(SPE)、QuEChERS法、分子印跡固相萃取(MISPE)、加速溶劑萃取(ASE)等，檢測(cè)方法主要為氣相色譜-質(zhì)譜法(GC-MS)和液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(HPLC-MS/MS)等[9-11]。但現(xiàn)有的前處理技術(shù)實(shí)驗(yàn)步驟繁瑣，費(fèi)時(shí)費(fèi)力。

隨著技術(shù)的發(fā)展，簡(jiǎn)單高效的前處理技術(shù)結(jié)合大型儀器精準(zhǔn)測(cè)定是殘留檢測(cè)的發(fā)展趨勢(shì)[12-14]。加速溶劑萃取法(ASE)具有溶劑用量少、操作自動(dòng)化、提取充分、速度快等優(yōu)點(diǎn)，已選為美國(guó)環(huán)保局推薦標(biāo)準(zhǔn)方法(EPA3545)，廣泛應(yīng)用于環(huán)境、食品、藥物等領(lǐng)域的樣品前處理，在農(nóng)藥方面的應(yīng)用尤為突出[15-17]。選擇性加速溶劑萃取法是在ASE的萃取池中同時(shí)裝填樣品和吸附劑，在樣品提取過程中，雜質(zhì)被分散吸附劑所吸附，提取液中只存在目標(biāo)物，樣品的提取與凈化在同一步中完成，有效減少了實(shí)驗(yàn)步驟。本文采用選擇性加速溶劑萃取法結(jié)合超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(UPLC-MS/MS)建立了簡(jiǎn)便、快速和準(zhǔn)確的杭白菊中19種三唑類殺菌劑的同時(shí)測(cè)定方法，并成功應(yīng)用于市售杭白菊樣品中三唑類殺菌劑的檢測(cè)，為菊花產(chǎn)品中殺菌劑的有效監(jiān)測(cè)提供了科學(xué)依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

LC 30AD超高效液相色譜儀(日本Shimadzu公司)，6500 QTRAP質(zhì)譜儀(美國(guó)Applied Biosystems公司)，配備Multiquant 3.0數(shù)據(jù)處理軟件；BS 2202S型電子天平(感量為0.01 g，德國(guó)Sartorius公司);Turbovap?LV濃縮儀(瑞典Biotage公司)；草藥粉碎機(jī)(荷蘭Philips公司)；ASE 350型加速溶劑萃取儀，配置34 mL萃取池(美國(guó)Thermo Scientific公司)。

甲醇和乙腈(色譜純，德國(guó)Merck公司)；乙酸(色譜純，西班牙Scharlau公司)；乙酸乙酯(分析純，華東醫(yī)藥股份有限公司)。吸附劑：N-丙基乙二胺(PSA，40～60 μm)、C18(40～60 μm)、石墨化碳(GCB，120～400目)均購(gòu)于Agela Technologies公司。硅藻土(80～100目)購(gòu)于美國(guó)Thermo Scientific公司。實(shí)驗(yàn)用水為超純水，采用美國(guó)Millipore凈化裝置自制。三唑類殺菌劑標(biāo)準(zhǔn)品(純度均≥95%)均購(gòu)自德國(guó)Dr.Ehrenstorfer公司。

將待測(cè)殺菌劑標(biāo)準(zhǔn)品溶于甲醇中，配成質(zhì)量濃度為100～300 mg/L的儲(chǔ)備液，將儲(chǔ)備液用甲醇水(1∶1,體積比)稀釋配成5 mg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)中間液。用空白樣品提取液配制不同質(zhì)量濃度的基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，于-4 ℃保存，現(xiàn)用現(xiàn)配。

1.2 樣品處理

1.2.1 樣品制備市購(gòu)?fù)慌胃稍锖及拙?，?jīng)草藥粉碎機(jī)充分粉碎，過50目篩后保存于真空袋中，置干燥處備用。

圖1 加速溶劑萃取池內(nèi)樣品和吸附劑裝填示意圖Fig.1 Schematic diagram of sample and adsorbent loading in accelerated solvent extraction tank

1.2.2 加速溶劑萃取過程在34 mL不銹鋼萃取池內(nèi)，從下至上依次將濾紙、3 g硅藻土、2 g凈化吸附劑(PAS+C18+GCB)、1 g藥材和2 g硅藻土裝填至萃取池內(nèi)(圖1)。萃取溶劑為乙腈；萃取壓力為6.9 MPa；萃取溫度為90 ℃；加熱時(shí)間為5 min；靜態(tài)萃取時(shí)間為10 min；萃取循環(huán)次數(shù)為1次；沖洗體積為40%；氮?dú)獯祾邥r(shí)間為90 s。提取完成后，將萃取液置于Turbovap?LV濃縮儀中氮?dú)獯蹈?。殘?jiān)? mL甲醇水(1∶1)復(fù)溶，取1 mL復(fù)溶液至1.5 mL離心管，以10 000 r/min離心3 min，取上清液過0.22 μm濾膜，待儀器分析。

1.3 色譜-質(zhì)譜條件

色譜條件：BEH C18色譜柱(2.1 mm×100 mm，1.7 μm，Waters公司)；柱溫：40 ℃；進(jìn)樣量：5 μL；流速：0.2 mL/min；流動(dòng)相：A為2 mmol/L甲酸銨(含0.1%甲酸)，B為甲醇，梯度洗脫程序：0～1 min，70% A，1～1.1 min，70%～40% A，1.1～3 min，40% A，3～8 min，40%～10% A，8～12 min，10% A，12～12.1 min，10%～70% A，12.1～15 min，70% A。

質(zhì)譜條件：電噴霧電離源(ESI)，正離子模式；掃描方式：多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)；噴霧電壓：5.0 kV；霧化氣和輔助氣(氮?dú)?壓力：345 kPa：氣簾氣(氮?dú)?壓力：276 kPa；離子源溫度：500 ℃。三唑類殺菌劑的MRM參數(shù)見表1。

*quantitative ion pair;bromuconazole,cyproconazol and difenoconazole are based on the sum of the peak areas of the two isomers(定量離子對(duì)；糠菌唑、環(huán)唑醇和苯醚甲環(huán)唑以兩個(gè)異構(gòu)體的峰面積之和計(jì))

2 結(jié)果與討論

2.1 選擇性加速溶劑萃取條件的優(yōu)化

2.1.1 萃取溶劑與吸附劑的選擇在參考文獻(xiàn)[17-18]基礎(chǔ)上，比較了乙腈(ACN)、1%乙酸乙腈(AA)、乙酸乙酯(EAC) 3種萃取溶劑在不同吸附劑凈化條件下對(duì)目標(biāo)化合物回收率的影響。由于菊花主要含有黃酮類、揮發(fā)油和氨基酸等小分子化合物以及色素等大分子化合物[8]，為除去雜質(zhì)干擾，減少基質(zhì)效應(yīng)，選擇不同吸附劑組合進(jìn)行凈化。吸附劑組合為：PSA、C18、GCB、PSA+GCB(1∶1)、C18+GCB(1∶1)、PSA+C18(1∶1)和PSA+C18+GCB(1∶1∶1)。其中，PSA的極性選擇范圍較廣，能夠吸附脂肪酸、有機(jī)酸、極性色素及糖；C18適合吸附非極性或弱極性的物質(zhì)；GCB去除色素效果較好，但過量使用可能對(duì)目標(biāo)化合物產(chǎn)生吸附[19-20]。在加標(biāo)50 μg/kg的空白杭白菊樣品中，比較了上述萃取溶劑和吸附劑(用量均為1.0 g)對(duì)目標(biāo)化合物的提取效率及凈化效果。結(jié)果顯示，在萃取溫度60 ℃，萃取壓力276 kPa，靜態(tài)萃取5 min，萃取循環(huán)3次的條件下，以乙酸乙酯為萃取溶劑時(shí)，采用上述7種吸附劑凈化對(duì)目標(biāo)化合物的萃取效率均較低(圖2)，可能由于乙酸乙酯的滲透性差，無法對(duì)目標(biāo)物進(jìn)行有效提取。而乙腈的提取效果相對(duì)較好，這可能是由于乙腈的極性較強(qiáng)，不僅可減少色素和糖分等雜質(zhì)的溶出，且能夠保證較好的提取效率[21]。

由圖2可知，采用上述3種萃取溶劑時(shí)，單獨(dú)使用PSA、C18和GCB吸附劑凈化得到的目標(biāo)化合物回收率集中在60%～70%，而組合使用吸附劑的回收率優(yōu)于單一吸附劑，19種殺菌劑的回收率集中在60%～80%，因此采用組合吸附劑。當(dāng)以乙腈為萃取溶劑時(shí)，使用4種吸附劑組合得到的回收率接近，均高于以1%乙酸乙腈和乙酸乙酯為萃取溶劑時(shí)的回收率，但以PSA+GCB(1∶1)和C18+GCB(1∶1)為吸附劑時(shí)部分目標(biāo)化合物的回收率小于70%(圖2)。而使用PSA+C18(1∶1)和PSA+C18+GCB(1∶1∶1)得到的回收率差異不明顯，均在70.8%～84.8%之間。由于添加適量GCB能有效去除色素，可得到澄清萃取溶液，因此最終選擇乙腈為萃取溶劑，PSA+C18+GCB(1∶1∶1)為吸附劑。

圖2 不同萃取溶劑和吸附劑對(duì)三唑類殺菌劑回收率的影響Fig.2 Effects of different extraction solvents and adsorbents on recoveries of triazole fungicidesACN;AA;EAC

2.1.2 吸附劑用量的優(yōu)化考察了吸附劑用量(0.5、1.0、2.0、3.0 g)對(duì)目標(biāo)化合物回收率的影響。結(jié)果表明，當(dāng)吸附劑用量為0.5 g和1.0 g時(shí)，19種殺菌劑的回收率為59.5%～84.8%，而吸附劑用量為2.0 g時(shí)回收率增至78.6%～91.6%。繼續(xù)增加吸附劑用量時(shí)回收率無明顯提升，且烯效唑、戊菌唑等的回收率降低，這可能是由于吸附劑對(duì)目標(biāo)物也產(chǎn)生了一定吸附作用，因此選擇最佳吸附劑用量為2.0 g。

表2 正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 2 Orthogonal experimental design and results

A.extraction temperature;B.static extraction time;C.extraction times

2.2 基質(zhì)效應(yīng)

基質(zhì)效應(yīng)是由于提取液中基質(zhì)和待測(cè)物共存而導(dǎo)致待測(cè)組分在儀器中響應(yīng)信號(hào)有不同程度的抑制或增強(qiáng)，是復(fù)雜基質(zhì)的常見現(xiàn)象。將空白杭白菊樣品按優(yōu)化方法處理后配制成基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液，同時(shí)用甲醇水(1∶1)配制相同濃度的溶劑標(biāo)準(zhǔn)溶液。按下式計(jì)算基質(zhì)效應(yīng)(C%)：C%=(1-Ss/Sm)×100，其中Ss為基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率，Sm為溶劑標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率。當(dāng)結(jié)果為正表示基質(zhì)抑制，為負(fù)則表示基質(zhì)增強(qiáng)[23]。平均基質(zhì)效應(yīng)(增強(qiáng)或抑制)超過20%時(shí)，則表明基質(zhì)效應(yīng)對(duì)定量檢測(cè)具有顯著影響[24]。結(jié)果表明杭白菊中的基質(zhì)效應(yīng)為32%～42%，顯示存在基質(zhì)抑制。因此采用基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線定量，以減少基質(zhì)對(duì)檢測(cè)結(jié)果的影響。

2.3 方法驗(yàn)證

2.3.1 線性關(guān)系、檢出限與定量下限在優(yōu)化條件下，19種三唑類殺菌劑可獲得較好的分離，圖3為空白杭白菊樣品中加標(biāo)10 μg/kg的定量離子色譜圖。以空白樣品提取液添加不同質(zhì)量濃度(1.0、2.0、5.0、10.0、20.0、50.0、100.0 μg/L)的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，在優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件下測(cè)定，結(jié)果表明，19種三唑類殺菌劑在1.0～100.0 μg/L范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)(r2)≥0.99；在10 μg/kg加標(biāo)水平下，根據(jù)3倍和10倍信噪比分別確定該方法的檢出限(LOD)為0.6～3.0 μg/kg，定量下限(LOQ)為2.1～10.0 μg/kg(見表3)。

2.3.2 回收率與相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差將空白杭白菊樣品按本方法處理，分別在10、50、100 μg/kg水平下進(jìn)行加標(biāo)實(shí)驗(yàn)，每個(gè)水平重復(fù)測(cè)定5次。結(jié)果顯示，19種三唑類殺菌劑的平均回收率為70.3%～95.3%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為0.60%～12%(見表3)。

2.4 實(shí)際樣品分析

選取當(dāng)?shù)爻泻褪袌?chǎng)10批杭白菊樣品，采用本方法進(jìn)行檢測(cè)。由表4可知，共檢出6種三唑類殺菌劑，檢出量為0.58～86.3 μg/kg，其中檢出率最高的為苯醚甲環(huán)唑、三唑酮、戊唑醇和烯唑醇，粉唑醇、氟環(huán)唑分別有1例和2例檢出。我國(guó)目前對(duì)菊花中三唑類殺菌劑尚無限量標(biāo)準(zhǔn)，鑒于菊花被廣泛用作花茶，參照日本“肯定列表制度”規(guī)定，11種三唑類殺菌劑在茶葉中的最大殘留限量為0.1～50 mg/kg[25]，本實(shí)驗(yàn)檢出的6種三唑類殺菌劑均未超過限量標(biāo)準(zhǔn)。

圖3 空白杭白菊中19種三唑類殺菌劑的定量離子色譜圖(加標(biāo)10 μg/kg)Fig.3 Quantitative ion chromatograms of 19 triazole fungicides in blank Chrysanthemum morifolium(spiked 10 μg/kg)

CompoundLOD(μg/kg)LOQ(μg/kg)Spiked10μg/kgSpiked50μg/kgSpiked100μg/kgRecovery/%RSD/%Recovery/%RSD/%Recovery/%RSD/%Flutriafol2.06.683.31183.21.778.44.6Triadimefon2.89.388.62.992.01.283.51.9Myclobutanil1.03.380.26.383.72.482.10.90Bromuconazole0.82.680.69.383.71.579.22.2Triadimenol3.010.086.11282.42.588.23.0Cyproconazole2.99.780.65.882.72.182.21.9Triticonazole3.010.076.17.470.32.078.04.5Epoxiconazole0.72.375.50.6074.27.178.68.1Tetraconazole0.62.184.45.278.33.781.61.7Simeconazole1.96.386.33.884.31.982.71.9Fenbuconazole1.65.272.75.178.65.984.74.7Flusilazole0.72.285.68.582.03.383.93.2Uniconazole1.96.574.84.577.13.882.35.4Penconazole1.34.378.54.377.92.082.62.5Tebuconazole0.82.885.06.789.32.892.62.4Propiconazole2.17.079.35.995.31.286.92.1Hexaconazole2.89.379.78.087.92.480.43.7Difenoconazole1.96.283.21190.35.282.73.2Diniconazole3.010.081.82.383.74.887.78.0

3 結(jié) 論

本文建立了選擇性加速溶劑萃取結(jié)合UPLC-MS/MS同時(shí)測(cè)定杭白菊中19種三唑類殺菌劑的方法。樣品采用乙腈提取，PSA、C18和GCB組合吸附劑同步凈化，經(jīng)色譜分離后進(jìn)行質(zhì)譜檢測(cè)。采用該方法對(duì)市售10個(gè)杭白菊樣品進(jìn)行檢測(cè)，共檢出6種三唑類殺菌劑，檢出量為0.58～86.3 μg/kg。與傳統(tǒng)的加速溶劑萃取法相比，選擇性加速溶劑萃取將樣品的提取和凈化同步完成，簡(jiǎn)單、快速，自動(dòng)化程度高，可用于中藥材中多殘留的痕量檢測(cè)。

表4 杭白菊樣品中三唑類殺菌劑的測(cè)定結(jié)果Table 4 Determination results of triazole fungicide in Chrysanthemum morifolium samples w/(μg·kg-1)

*not detected or detected value is below the limit of quantitation