子體鉛誘導(dǎo)T30695構(gòu)象改變N-甲基卟啉二丙酸Ⅸ(NMM)熒光探針檢測(cè)氡

劉紅文,劉士蒙,李詩(shī)雅,楊桂英,劉 然,呂昌銀

(南華大學(xué) 公共衛(wèi)生學(xué)院，湖南 衡陽(yáng) 421000)

氡是238U、235U和232Th等放射性核素的衰變產(chǎn)物，無(wú)色無(wú)味，易溶于水，半衰期為3.82天，其衰變產(chǎn)生的子體210Pb的半衰期長(zhǎng)達(dá)21年[1-3]。氡是室內(nèi)放射性氣體污染物的主要存在形式，人類所遭受的自然輻射劑量中有一半來(lái)自氡的輻射。氡及其衰變子體形成的氣溶膠被人體吸入后，可蓄積在人體肺細(xì)胞組織和骨骼中，衰變過(guò)程產(chǎn)生的α粒子將會(huì)破壞細(xì)胞核中的 DNA分子，造成人體呼吸系統(tǒng)、血液系統(tǒng)疾病和細(xì)胞遺傳學(xué)損傷[4-5]。氡及其子體已經(jīng)成為引發(fā)肺癌、白血病、皮膚病以及其他呼吸道疾病的重要元兇[6]。現(xiàn)代人約有80%的時(shí)間在室內(nèi)度過(guò)，氡污染引起的人體健康問(wèn)題受到越來(lái)越多的關(guān)注。因此監(jiān)測(cè)環(huán)境中氡的濃度對(duì)保障人類健康具有重要意義。

傳統(tǒng)的放射性氣體氡的檢測(cè)方法，多是基于核科學(xué)和物理學(xué)領(lǐng)域中針對(duì)氡輻射產(chǎn)生的α射線等來(lái)測(cè)定氡累積濃度的物理檢測(cè)方法。近年來(lái)，核酸適配體因其高效特異的結(jié)合能力，無(wú)毒性、易合成、穩(wěn)定性好等優(yōu)點(diǎn)，已成為重金屬檢測(cè)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)[7]。Wang等[8]篩選出可與Cd2+作用并產(chǎn)生二級(jí)結(jié)構(gòu)構(gòu)象變化的核酸適配體，并基于此構(gòu)建了一種可檢測(cè)低濃度Cd2+的生物傳感器。Zhu等[9]設(shè)計(jì)了一種銀特異性的核酸適配體，可與低濃度的Ag+形成G-四鏈體結(jié)構(gòu)，并產(chǎn)生熒光猝滅作用，實(shí)現(xiàn)對(duì)低濃度Ag+的定量檢測(cè)。Chen等[10]經(jīng)過(guò)18次的陽(yáng)性和陰性選擇，獲得了兩種具有高度結(jié)合性和特異性的核酸適配體，并據(jù)此設(shè)計(jì)了熒光生物傳感器用于Pb2+檢測(cè)。

1998年Arthanari等報(bào)道了一種不對(duì)稱的陰離子活性卟啉熒光染料—N-甲基卟啉二丙酸Ⅸ(N-methyl mesoporphyrin Ⅸ，NMM)，其最大吸收波長(zhǎng)約為399 nm，最強(qiáng)發(fā)射峰波長(zhǎng)在610 nm左右。NMM自身的熒光強(qiáng)度很弱，很難與單鏈DNA、雙螺旋結(jié)構(gòu)的DNA結(jié)合，但可與G-四鏈體結(jié)構(gòu)產(chǎn)生特異性結(jié)合，結(jié)合后體系熒光強(qiáng)度明顯增強(qiáng)[11]。作為G-四鏈體的熒光染料，NMM已經(jīng)在生物分析技術(shù)領(lǐng)域得到了廣泛地應(yīng)用。本文根據(jù)氡輻射衰變的特點(diǎn)，結(jié)合鉛離子的現(xiàn)代分析新技術(shù)，以NMM作為熒光探針，探討了Pb2+誘導(dǎo)富G序列形成G-四鏈體的特性，建立了一種基于Pb2+誘導(dǎo)富含鳥嘌呤的寡核苷酸鏈T30695構(gòu)象改變的熒光傳感器對(duì)鉛和氡進(jìn)行檢測(cè)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

F-4500熒光分光光度計(jì)(日本Hitachi公司)；J-815圓二色譜光譜儀(日本Jasco公司)；RAD7 Electronic radon detector(美國(guó)Durridgce公司)；氡室(南華大學(xué)核工業(yè)第六研究所)；混合纖維素膜(Merck Milipore公司)。

冰醋酸(HAc，天津市福晨化學(xué)試劑廠)；三羥甲基氨基甲烷(Tris，上海阿拉丁生化科技股份有限公司)；鉛標(biāo)準(zhǔn)溶液(100.0 μg/mL，中國(guó)計(jì)量科學(xué)院)；富含鳥嘌呤的寡核苷酸鏈T30695(5’-GGGTGGGTGGGTGGGT-3’)與互補(bǔ)鏈C-T30695(5’-ACCCACCCACCCACCC-3’)(上海生工生物工程股份有限公司)；熒光染料N-甲基卟啉二丙酸Ⅸ(NMM,百靈威公司)；實(shí)驗(yàn)用水為滅菌超純水(電阻率為18.25 MΩ·cm)。

1.2 氡樣本的采樣方法

以10 mL 0.2%(體積分?jǐn)?shù))醋酸為吸收液，以直徑70 mm，高17 mm的一次性塑料培養(yǎng)皿為收集器，在平皿口加封混合纖維素膜(孔徑為0.8 μm)；設(shè)定采樣時(shí)間，將采樣器放入氡室，被動(dòng)式采集含鉛樣本。采樣后密封,室溫放置4 d，用0.2%的醋酸定容至10 mL，混勻，4 ℃冰箱保存，待測(cè)[12-14]。

1.3 Pb2+標(biāo)準(zhǔn)溶液的紫外光譜測(cè)定

將T30695及C-T30695分別配制成1 μmol/L的工作溶液，于95 ℃的金屬恒溫儀中加熱5 min，置于空氣中迅速冷卻至室溫，備用。在反應(yīng)管中，依次加入100 mmol/L Tris-HAC緩沖溶液(pH 7.25)50 μL，1 μmol/L T30695溶液20 μL，以及一定量的鉛標(biāo)準(zhǔn)溶液，混勻，于室溫孵育80 min。

加入1 μmol/L的C-T30695溶液20 μL，于室溫下孵育15 min后，加入NMM染料(1.72×10-5mol/L) 50 μL，加超純水至200 μL，混勻，室溫下避光孵育10 min后待測(cè)。設(shè)置儀器的激發(fā)波長(zhǎng)為399 nm，發(fā)射波長(zhǎng)為610 nm，測(cè)定各管的熒光強(qiáng)度值(IF)，以超純水作空白測(cè)定熒光值(IF0)，計(jì)算ΔIF=IF0-IF，建立熒光強(qiáng)度差(ΔIF)對(duì)鉛離子濃度(c)的線性回歸方程。

2 結(jié)果與討論

2.1 熒光傳感原理

氡衰變形成穩(wěn)定的子體鉛只需約3.82 d，且衰變產(chǎn)生的子體鉛210Pb非常穩(wěn)定。本實(shí)驗(yàn)以子體鉛作為目標(biāo)檢測(cè)物，建立了氡的免標(biāo)記熒光DNA傳感器生物分析新方法。用含0.2%醋酸吸收液的采樣皿進(jìn)行被動(dòng)式采樣，氡進(jìn)入采樣皿后，衰變產(chǎn)生子體鉛，隨后在稀醋酸中轉(zhuǎn)變形成鉛離子。

實(shí)驗(yàn)原理如圖1所示。NMM單獨(dú)存在時(shí)熒光很弱，在沒(méi)有Pb2+存在的條件下，富鳥嘌呤DNA單鏈T30695與互補(bǔ)鏈C-T30695結(jié)合形成雙鏈結(jié)構(gòu)，不能與NMM結(jié)合，NMM游離在溶液中，體系產(chǎn)生弱熒光；當(dāng)體系中導(dǎo)入Pb2+時(shí)，Pb2+誘導(dǎo)富G單鏈T30695發(fā)生構(gòu)型轉(zhuǎn)變，形成G-四鏈體結(jié)構(gòu)，熒光染料NMM嵌入G-四鏈體結(jié)構(gòu)中，產(chǎn)生強(qiáng)的熒光。在一定濃度范圍內(nèi)，兩體系熒光信號(hào)差值ΔIF與Pb2+濃度呈線性關(guān)系。據(jù)此，建立了基于鉛誘導(dǎo)T30695構(gòu)象改變的熒光法檢測(cè)鉛和氡。

圖1 基于Pb2+誘導(dǎo)特異性核酸適配體構(gòu)象轉(zhuǎn)變的非標(biāo)記熒光法測(cè)氡原理圖Fig.1 Schematic diagram of radon label-free fluorescent detection based on structure exchange of aptamer

2.2 實(shí)驗(yàn)機(jī)制可行性分析

文獻(xiàn)[15]報(bào)道，NMM與雙鏈DNA的結(jié)合能力較低，但能很好地與陽(yáng)離子誘導(dǎo)形成的穩(wěn)定G-四鏈體結(jié)合，發(fā)出較強(qiáng)的熒光。為驗(yàn)證熒光傳感原理的正確性，進(jìn)行了機(jī)制驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)。結(jié)果如圖2所示，當(dāng)體系中只存在NMM時(shí)，設(shè)定激發(fā)波長(zhǎng)為399 nm，測(cè)定NMM在560～700 nm處的熒光強(qiáng)度，結(jié)果發(fā)現(xiàn)體系的熒光強(qiáng)度IF≤400(曲線a)，說(shuō)明NMM本身的熒光較弱。

圖2 不同實(shí)驗(yàn)體系NMM染料的熒光發(fā)射光譜圖Fig.2 Fluorescence emission spectra of NMM in different systems cNMM=4.30 mmol/L,cT30695=cC-T30695=cPb2+=100 nmol/L

當(dāng)向富含鳥嘌呤的DNA單鏈T30695溶液中加入富含胞嘧啶的DNA互補(bǔ)鏈C-T30695后，通過(guò)堿基互補(bǔ)配對(duì)，T30695與其互補(bǔ)鏈結(jié)合成為雙鏈，形成雙螺旋結(jié)構(gòu)。由于NMM不能與DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)結(jié)合，使得“NMM+T30695+C-T30695”體系測(cè)定的熒光強(qiáng)度比較微弱(曲線b)，與“NMM”體系熒光強(qiáng)度相差不大。該實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明NMM與雙鏈DNA的結(jié)合能力弱，產(chǎn)生的熒光也很弱。

當(dāng)體系中同時(shí)存在Pb2+與核酸適配體T30695，進(jìn)行一段時(shí)間孵育后，T30695被Pb2+誘導(dǎo)形成G-四鏈體結(jié)構(gòu)。此時(shí)，加入熒光染料NMM可與G-四鏈體結(jié)構(gòu)的核苷酸鏈結(jié)合，體系的熒光強(qiáng)度顯著增強(qiáng)，如圖2曲線d所示，“NMM+Pb2++T30695”體系的熒光強(qiáng)度IF≈1 100，且Pb2+離子濃度越大，體系熒光強(qiáng)度增強(qiáng)越多。該實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明NMM與G-四鏈體結(jié)構(gòu)有較好的結(jié)合能力，從而產(chǎn)生較強(qiáng)熒光。

當(dāng)核酸適配體T30695被Pb2+誘導(dǎo)形成G-四鏈體結(jié)構(gòu)后，再加入互補(bǔ)鏈 C-T30695，二者很難再形成DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)。NMM仍可與G-四鏈體結(jié)構(gòu)結(jié)合發(fā)出較強(qiáng)熒光，如圖2中曲線c所示，“NMM+Pb2++T30695+C-T30695”體系的熒光強(qiáng)度IF≈800，仍然比“NMM+T30695+C-T30695”體系的熒光強(qiáng)度強(qiáng)，且兩者間熒光強(qiáng)度的變化隨著Pb2+離子濃度的增大而增大。該實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明Pb2+誘導(dǎo)T30695形成了G-四鏈體結(jié)構(gòu)，與NMM結(jié)合產(chǎn)生了較強(qiáng)熒光。

圖3 圓二色光譜圖Fig.3 Circular dichroism spectracT30695=cC-T30695=cPb2+=100 nmol/L

與“NMM+Pb2++T30695”體系相比，“NMM+Pb2++T30695+C-T30695”體系的熒光強(qiáng)度并沒(méi)有達(dá)到與之相同的水平。這可能因?yàn)轶w系中存在C-T30695和Pb2+競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合T30695，導(dǎo)致仍有少量DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)形成，該雙螺旋結(jié)構(gòu)未與NMM結(jié)合產(chǎn)生熒光。因此，熒光強(qiáng)度略低于NMM與G-四鏈體結(jié)合時(shí)的水平[16-17]。

2.3 圓二色譜實(shí)驗(yàn)

為進(jìn)一步探究熒光強(qiáng)度變化與核酸適配體T30695構(gòu)象改變間的關(guān)系，從分子結(jié)構(gòu)的角度，更好地說(shuō)明Pb2+誘導(dǎo)T30695發(fā)生的構(gòu)象變化，進(jìn)行了圓二色譜驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，結(jié)果如圖3所示。核酸適配體T30695單鏈狀態(tài)下在265 nm處有一個(gè)正峰(曲線a)，加入Pb2+誘導(dǎo)T30695形成G-四鏈體結(jié)構(gòu)后，在265 nm處的正峰顯著升高，并于245 nm處出現(xiàn)了一個(gè)負(fù)峰(曲線b)，這一結(jié)果符合順式平行結(jié)構(gòu)G-四鏈體的特征[18]。單獨(dú)將T30695與互補(bǔ)鏈C-T30695孵育一段時(shí)間后，在260～285 nm處掃描出正峰，在240 nm左右處掃描出一個(gè)明顯的負(fù)峰(曲線d)，這一結(jié)果符合較典型的多聚鳥嘌呤與胞嘧啶寡核苷酸鏈形成B型雙螺旋結(jié)構(gòu)的圓二色光譜圖特征[16,19]，證明T30695與C-T30695結(jié)合形成了B型雙螺旋結(jié)構(gòu)。核酸適配體T30695與Pb2+孵育一段時(shí)間后，再加入互補(bǔ)鏈C-T30695，掃描得到一個(gè)不是很典型的圓二色光譜圖，245 nm處有一個(gè)負(fù)峰，265～285 nm處出現(xiàn)了一個(gè)較大的正峰(曲線c)，可能是因?yàn)檫@一體系中同時(shí)存在G-四鏈體結(jié)構(gòu)和B型雙螺旋結(jié)構(gòu)，因此在245 nm處有負(fù)峰，265 nm和285 nm均有正峰[16]。

2.4 實(shí)驗(yàn)條件優(yōu)化

在pH 6.5～8.0的酸度范圍內(nèi)對(duì)pH值的影響進(jìn)行了研究。結(jié)果顯示，酸度對(duì)ΔIF值影響較大。pH 6.75～7.25時(shí)，ΔIF值逐漸上升；pH 7.25～8.00時(shí)，ΔIF值逐漸下降，所以，實(shí)驗(yàn)選擇pH 7.25的Tris-HAc緩沖液維持體系的酸堿性。同時(shí)考察了Tris-HAc用量對(duì)檢測(cè)性能的影響，隨著Tris-HAc用量的增加，熒光差值ΔIF逐漸增高，在45 μL左右達(dá)到平臺(tái)，45～70 μL體積范圍內(nèi)，熒光差值ΔIF趨于穩(wěn)定。因此，實(shí)驗(yàn)選擇加入50 μL的Tris-HAc緩沖溶液進(jìn)行后續(xù)研究。

對(duì)反應(yīng)體系中Pb2+與T30695的孵育時(shí)間進(jìn)行研究，結(jié)果顯示，75 min之前ΔIF值逐漸增大，說(shuō)明隨著反應(yīng)時(shí)間的增加，形成G-四鏈體的量增加，其與NMM染料結(jié)合后，熒光強(qiáng)度(IF)增強(qiáng)，導(dǎo)致熒光差值(ΔIF)也逐漸增加。75 min以后，Pb2+離子已經(jīng)與之完全結(jié)合，ΔIF值的變化趨于平緩。據(jù)此，選擇孵育時(shí)間為80 min。同時(shí)考察了C-T30695孵育時(shí)間對(duì)實(shí)驗(yàn)體系的影響，根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選擇15 min作為互補(bǔ)鏈C-T30695的孵育時(shí)間。

圖4 共存物質(zhì)對(duì)測(cè)定體系的影響Fig.4 Responses of the Pb2+ sensors over other competing metal ions concentration：50 nmol/L for Pb2+,5 μmol/L for Bi3+, 2.5 μmol/L for Mn2+,Cr3+,Zn2+

熒光染料NMM的反應(yīng)時(shí)間與濃度對(duì)測(cè)定結(jié)果有一定影響。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，加入NMM染料前5 min，體系的熒光差值(ΔIF)變化非常大，5 min后，ΔIF的變化趨于平緩，說(shuō)明此時(shí)NMM與G-四鏈體結(jié)合已基本完成并發(fā)出較強(qiáng)熒光。10 min后體系熒光差值有稍許下降，但變化趨于平緩，可能的原因是，體系中的C-T30695與部分T30695結(jié)合，導(dǎo)致熒光差值些許下降，但隨著時(shí)間的增長(zhǎng)，體系達(dá)到穩(wěn)定狀態(tài)，熒光差值變化趨于平緩。因此，實(shí)驗(yàn)選擇10 min作為NMM染料的反應(yīng)時(shí)間。通過(guò)考察熒光染料NMM濃度的影響，選擇NMM的反應(yīng)濃度為4.30×10-6mol/L。

2.5 共存干擾物的影響

圖5 氡累積濃度與熒光強(qiáng)度的關(guān)系Fig.5 Correlation curve of fluorescence intensity and radon concentration

2.6 標(biāo)準(zhǔn)曲線與檢出限

按實(shí)驗(yàn)方法操作，測(cè)定Pb2+離子標(biāo)準(zhǔn)系列溶液的熒光值IF和未加Pb2+離子的試劑空白溶液的熒光值IF0,計(jì)算ΔIF值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。 Pb2+濃度在5.13×10-9～1.25×10-7mol/L范圍內(nèi)與體系的ΔIF值呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，回歸方程為ΔIF=77.30+5.05cPb(10-9mol/L)，相關(guān)系數(shù)r=0.995 0。對(duì)空白溶液平行測(cè)定11次，計(jì)算空白溶液的標(biāo)準(zhǔn)偏差為sb=2.59，按照CL=3sb/k計(jì)算得到鉛離子的檢出限為1.54×10-9mol/L。

2.7 氡累積濃度的測(cè)定與模型建立

按照采樣方法，在南華大學(xué)核六所氡實(shí)驗(yàn)室采集累積濃度分別為0.96、1.95、5.86、11.66、17.42、20.31、23.19(×104Bq·h/m3)的氡輻射樣品溶液，如表1所示，隨著氡累積濃度的增加，鉛含量和樣品的熒光差值ΔIF值(圖5)也逐漸增加。進(jìn)一步分析圖5發(fā)現(xiàn)，在0.96～23.19×104Bq·h/m3的氡濃度范圍內(nèi)，熒光差值ΔIF與氡累積濃度之間呈對(duì)數(shù)增長(zhǎng)的關(guān)系，符合放射性物質(zhì)指數(shù)衰變的特性;但在3.58×104～16.92×104Bq·h/m3氡濃度范圍內(nèi)，兩者之間存在良好的線性關(guān)系：ΔIF=3.60cRn+140.27，r=0.994 9。本方法氡的檢測(cè)范圍為3.58×104～16.92×104Bq·h/m3，檢出限為1.07×104Bq·h/m3。對(duì)樣品溶液平行測(cè)定6次，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為1.7%～3.3%，加標(biāo)回收率為96.0%～104%，表明方法測(cè)定干擾小，結(jié)果準(zhǔn)確可靠，適用于鉛離子和氡積累濃度的檢測(cè)。

表1 樣品中Pb2+離子的檢測(cè)結(jié)果(n=6)Table 1 Determination results of Pb2+ in the samples(n=6)

‘Found’ and ‘Added’ refer to the final concentration

3 結(jié) 論

本文以氡輻射的子體鉛為目標(biāo)檢測(cè)物，應(yīng)用核酸適體構(gòu)建了一種免標(biāo)記高靈敏的熒光DNA傳感器，并實(shí)現(xiàn)了鉛濃度和氡輻射劑量的生物分析化學(xué)測(cè)定。方法儀器設(shè)備簡(jiǎn)單，操作簡(jiǎn)單快速，樣品幾乎無(wú)干擾，具有較高的靈敏度，對(duì)鉛的檢出限為1.54×10-9mol/L，對(duì)氡的檢出限1.07×104Bq·h/m3。本法避免了現(xiàn)場(chǎng)進(jìn)行氡輻射劑量測(cè)量的放射性危害，開拓了核酸適配體對(duì)無(wú)機(jī)物、氣體和放射性物質(zhì)的生物分析新領(lǐng)域。