超高效液相色譜法測定原料乳中的水楊酸

邵瑞婷,丁學(xué)妍,張麗華,姜 潔

(北京市食品安全監(jiān)控和風(fēng)險(xiǎn)評估中心，北京 100041)

水楊酸(Salicylic acid)又稱2-羥基苯甲酸，為白色針狀結(jié)晶或單斜棱晶，有辛辣味，微溶于水，溶于丙酮、松節(jié)油、乙醇、乙醚、苯和氯仿，具有防腐、消炎作用[1-2]，存在于自然界的柳樹皮、白珠樹葉、甜樺樹中，是一種天然的“消炎藥”.水楊酸主要作為醫(yī)藥工業(yè)的原料使用，也經(jīng)常作為防腐劑被用于化妝品中，此外還被用于染料、橡膠、香精配制等.正是由于水楊酸具有防腐殺菌作用，被一些不法商販利用[3]，他們?yōu)榱搜娱L原料乳的保存期限，在原料乳中加入水楊酸鈉，這樣的原料會影響最終的產(chǎn)品質(zhì)量，對人體產(chǎn)生危害[4-7].

目前，包括我國和歐盟在內(nèi)的多個國家，對于水楊酸在食品中的使用都有限制規(guī)定[8-9].我國將其列為“允許使用的食品用合成香料”[9]，但未標(biāo)明其可作為防腐劑在食品中使用.此外，即使作為香料，也明確標(biāo)注出不得在巴氏殺菌乳、殺菌乳、發(fā)酵乳等以原料乳生產(chǎn)的產(chǎn)品中添加.國內(nèi)外對于水楊酸的檢測方法，主要集中在化妝品[10-12]、醫(yī)藥[13-15]及植物生長調(diào)節(jié)劑[16-23]方面，而對于原料乳中的水楊酸檢測，沒有明確的有針對性的定量檢測方法[24-26].本方法具有操作簡單、重現(xiàn)性好、靈敏度高、雜質(zhì)干擾小等特點(diǎn)，可以用于原料乳中水楊酸的檢測.

1 試驗(yàn)部分

1.1 儀器

Agilent 1260超高效液相色譜儀(美國安捷倫科技有限公司)；超聲波萃取儀(北京五洲東方)；多管渦旋振蕩器(北京華威中儀)；冷凍離心機(jī)(美國Thermo Fisher公司).

1.2 試劑與標(biāo)準(zhǔn)品

乙腈(色譜純，美國Thermo Fisher公司)；甲醇(色譜純，美國Thermo Fisher公司)；磷酸(優(yōu)級純，默克，質(zhì)量分?jǐn)?shù)85%)；氨水(優(yōu)級純，國藥，質(zhì)量分?jǐn)?shù)25.0%～28.0%).原料乳樣品：采集于北京市大型乳企生產(chǎn)用原料乳.

水楊酸標(biāo)準(zhǔn)品購自中國食品藥品檢定研究院.

精確稱取水楊酸標(biāo)準(zhǔn)品10 mg置于10 mL棕色容量瓶中，用乙腈溶解并定容，配制成1 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液，避光、-18 ℃下保存.

用70%乙腈水(體積分?jǐn)?shù))逐級稀釋混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，配制成0.5、1.0、2.0、5.0、10.0、20.0 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液系列.

磷酸溶液：稱取11.5 g磷酸，精確至0.01 g，加入950 mL水，用氨水調(diào)節(jié)pH至2.5，加入水至1 000 mL.

流動相A液(磷酸水)：量取磷酸溶液200.0 mL，并用水稀釋至1 000 mL[8].

流動相B液(磷酸甲醇)：量取磷酸溶液250.0 mL，并用甲醇稀釋至1 000 mL[8].

1.3 樣品前處理

稱取2 g混勻試樣(精確到0.01 g)置于10 mL刻度離心管中，加入80%乙腈水(體積分?jǐn)?shù))溶液至5 mL刻度線，渦旋30 s，超聲提取25 min，以10 000 r/min在0 ℃下離心5 min，吸取上層提取液1 mL，過0.22 μm微孔濾膜，供檢測.

1.4 色譜條件

色譜柱：Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18(4.6×100 mm,3.5 μm)；柱溫 25 ℃；二極管陣列檢測器(DAD)300 nm；進(jìn)樣體積 10 μL；流速 0.8 mL/min；流動相：A為磷酸水、B為磷酸甲醇，梯度洗脫程序：0～3 min，A由80%線性降到10%;3～8 min，A相保持100%;8～8.1 min，A由10%線性升到80%;8.1～10 min，A相保持80%.

2 結(jié)果與討論

2.1 提取溶劑選擇

分別用甲醇、乙腈、丙酮、氯仿4種有機(jī)溶劑對原料乳樣品進(jìn)行提取條件試驗(yàn)(原料乳中水楊酸添加量為5 mg/kg)，結(jié)果如圖1所示.試驗(yàn)結(jié)果表明：乙腈作為提取溶劑，蛋白沉淀效果最佳，其回收率為93%～105%；丙酮及氯仿雖有一定的提取效果，但回收率較低，均不足40%；甲醇作為提取試劑，蛋白沉淀效果不佳，個別出現(xiàn)乳化現(xiàn)象，無法達(dá)到良好提取兼凈化效果.故選擇乙腈作為提取試劑.

圖1 不同溶劑提取原料乳中水楊酸的回收率(n =6)Fig.1 Recoveries of salicylic acid in raw milk by different extration solvent (n =6)

對于不同濃度的乙腈作為提取試劑對提取效率的影響也做了相應(yīng)的研究.選取乙腈質(zhì)量分?jǐn)?shù)(乙腈∶水，V∶V)分別為10%、50%、60%、70%、80%、90%、100%的提取試劑，樣品中添加水楊酸的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5 mg/kg,進(jìn)行測試，結(jié)果表明乙腈的質(zhì)量分?jǐn)?shù)大于60%時(shí)，提取效率無明顯差異.由于原料乳中本身含有一定量的水分，為保證提取效率，本著節(jié)約原則，最終選擇質(zhì)量分?jǐn)?shù)為80%的乙腈(乙腈∶水，V∶V)作為提取試劑.

2.2 樣品凈化方法的選擇

原料乳中含有大量的蛋白質(zhì)和脂肪，凈化的主要目的就是除去脂肪和沉淀蛋白.由于乙腈具備良好的沉淀蛋白的效果，對目標(biāo)物進(jìn)行提取的同時(shí)，可將原料乳中的蛋白質(zhì)較為充分的沉淀.冷凍、高速離心又能有效的避免脂肪的干擾，故為降低檢測成本，節(jié)約檢測時(shí)間，沒有再額外引入其余凈化環(huán)節(jié).

2.3 提取時(shí)間的選擇

試驗(yàn)比較了超聲提取時(shí)間對原料乳中水楊酸提取效率的影響.樣品中添加水楊酸的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5 mg/kg，測試結(jié)果如圖2所示.由圖2可見，隨超聲時(shí)間的增長，目標(biāo)物的提取效率顯著提高，在25 min后達(dá)到動態(tài)平衡，故最終選擇超聲提取時(shí)間為25 min.

2.4 檢出限、定量限與線性范圍

分別配制質(zhì)量濃度為0.5、1.0、2.0、5.0、10.0、20.0 μg/mL的水楊酸標(biāo)準(zhǔn)溶液，自動進(jìn)樣10 μL，進(jìn)行UPLC分析.將標(biāo)準(zhǔn)系列工作溶液分別注入液相色譜儀中，測定相應(yīng)的峰面積.以標(biāo)準(zhǔn)系列工作溶液的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，以峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線.將試樣溶液注入液相色譜儀中，得到峰面積，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線得到待測液中水楊酸的質(zhì)量濃度.方法檢出限以加標(biāo)樣品檢測色譜峰信噪比S/N≥3確定，方法定量限以加標(biāo)樣品檢測色譜峰信噪比S/N≥10確定，具體結(jié)果如表1所列.由表1可見，水楊酸在0.5～20.0 μg/mL的線性范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，線性系數(shù)R2大于0.995，能滿足定量分析的要求.方法對于水楊酸的檢出限均為0.5 mg/kg，定量限均為1.25 mg/kg.

圖2 水楊酸不同超聲提取時(shí)間的提取效率Fig.2 Extraction efficiencies of salicylic acid with different ultrasonic extraction times

表1 水楊酸的線性范圍、回歸方程及線性相關(guān)系數(shù)Table 1 Linear ranges,linear equations and correlation coefficients of salicylic acid

2.5 樣品的加標(biāo)回收率

分別在2.00 g原料乳樣品中加入含有水楊酸的標(biāo)準(zhǔn)溶液，添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.25、2.5、25 mg/kg.使用優(yōu)化好的方法進(jìn)行提取凈化，每個添加水平分別測定6份樣品，得到水楊酸的回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差,結(jié)果如表2所列.

表2 水楊酸在不同加標(biāo)水平下的加標(biāo)回收率及相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(n=6)Table 2 Spiked recoveries and RSDs of salicylic acid spiked in three levels(n=6)

由表2可見，回收率范圍為88.0%～118.9%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于10%.結(jié)果表明，水楊酸在不同的添加水平均得到了滿意的回收率和較好的方法重復(fù)性.

3 結(jié)論

建立了原料乳中水楊酸的超高效液相色譜檢測方法.通過乙腈提取，可實(shí)現(xiàn)對原料乳樣品中水楊酸的檢測，具有較高的回收率.該方法靈敏度高、重現(xiàn)性好，已在日常風(fēng)險(xiǎn)監(jiān)測試驗(yàn)中得到良好的應(yīng)用.檢測160余個采集于北京市及其周邊大型乳品企業(yè)的原料乳樣品，未檢測出陽性樣本.由于我國的原料乳有很多零散養(yǎng)殖戶參與供應(yīng)，其安全性依然是監(jiān)管的難點(diǎn)和重點(diǎn).水楊酸等防腐劑的添加作為重要的風(fēng)險(xiǎn)隱患，一直被監(jiān)控部門關(guān)注.因此，將快速靈敏的原料乳中水楊酸的檢測方法應(yīng)用于日常監(jiān)管，具有必要性.