CD151對結(jié)直腸癌β-catenin蛋白及血管新生影響的研究

劉學剛 劉艷彩 吳春平 李景光 趙嶺嶺 張浩 彭曉兵 張振亞

結(jié)直腸癌（colorectal cancer，CRC）每年引起約60萬人死亡，是目前世界范圍內(nèi)最常見的惡性腫瘤之一［1-2］。轉(zhuǎn)移性CRC患者生活質(zhì)量低，預后差，其5年生存率僅約為10%［3］。近年來，隨著對腫瘤發(fā)生發(fā)展及轉(zhuǎn)移機制研究的不斷深入，人們發(fā)現(xiàn)血管生成在CRC的生長及轉(zhuǎn)移過程中扮演著重要的角色［4］。

在CRC中，對血管增生起重要作用的細胞因子有多種，如：血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial cell growth factor，VEGF），整合素（integrin），β-連環(huán)蛋白（β-catenin）等［5］。β-catenin蛋白主要定位于細胞膜上，在細胞的增殖和凋亡等方面發(fā)揮重要作用，與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)［6］。近年來研究發(fā)現(xiàn)β-catenin可以調(diào)控VEGF的表達，在CRC新血管生成中具有關(guān)鍵作用［7］。此外，研究還發(fā)現(xiàn)多種基因可調(diào)控β-catenin的表達從而影響腫瘤血管增生，如：HIPK2，COX-2等［8-9］。

CD151是一種膜蛋白，屬于四跨膜蛋白超家族，在多種腫瘤中呈高表達，參與腫瘤的增殖、侵襲及遷移等過程，且與腫瘤不良預后相關(guān)，還可以介導血管生成［10］。已有相關(guān)研究報道，CD151可影響Wnt信號通路的起始蛋白LRG-1和LGR-5的表達［11］，然而在CRC中，關(guān)于CD151與Wnt/β-catenin信號通路中β-catenin蛋白以及血管生成之間卻鮮有報道。本研究選用HT-29和CD151--HT-29細胞，通過Real-Time PCR及Western blot技術(shù)，觀察細胞β-catenin的表達變化；通過裸鼠皮下成瘤實驗觀察移植瘤的生長以及血管生成情況。

材料與方法

一、主要試劑

DMEM培養(yǎng)基（杭州四季青生物工程材料有限公司），胰蛋白酶（上海源葉生物科技有限公司），BCA蛋白分析試劑盒（美國Thermo公司），β-actin抗體（美國Abcam公司），Trizol裂解液（美國Becton-dickinson公司）。

二、試驗方法

1.細胞培養(yǎng)：對CRC細胞系用10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)。放于37℃ 5% CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細胞長至80%匯合度時，將細胞用胰蛋白酶消化，離心，無菌PBS洗2遍，培養(yǎng)基重懸，重新鋪到新的細胞培養(yǎng)皿中，每1 d換液1次，取對數(shù)生長期的細胞用于實驗。

2.Western blot技術(shù)：待培養(yǎng)皿內(nèi)的細胞長滿約80%時，對細胞進行胰酶消化、離心。收集細胞后提取蛋白質(zhì)，使用BCA法測蛋白質(zhì)濃度，確定并統(tǒng)一SDS-PAGE凝膠電泳上樣量。取30 μg樣品蛋白加入等量的2×loading的緩沖溶液，混勻煮沸10 min，上樣，80 V恒壓電泳直至溴酚藍剛從膠中跑出。電泳結(jié)束后進行轉(zhuǎn)膜90 min，0.35 A。之后經(jīng)過封閉液封閉，一抗孵育過夜，二抗孵育后進行曝光。

3.實時定量PCR技術(shù)：分別收集處于對數(shù)生長期的HT-29、CD151--HT29細胞，加入Trizol裂解，提取RNA，將提取出來的總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。根據(jù)NCBI Gene Bank內(nèi)提供的基因序列，β-catenin上下游引物序列為：上游引物：5′gct act tgt gag tga ag3′，下游引物為：5′atg gaa cca gac aga aaa gc3′。按照Realtime PCR說明書，配置反應體系。反應條件為：95 ℃預變性30 s，95 ℃變性5 s，60 ℃退火31 s，72 ℃延伸30 s，共循環(huán)40次，72 ℃終延伸 2 min。

4.免疫組化技術(shù)：石蠟切片放于67 ℃烤箱中，烘烤2 h。待石蠟融掉后，將切片浸入二甲苯中浸泡30 min以除去石蠟。將切片放入無水乙醇中浸泡30 min，之后按乙醇濃度從90%至60%，每種浸泡5 min，使切片組織吸水，再用去離子水浸泡5 min。取出切片，用紙將組織周圍擦干，滴加過氧化氫，使其覆蓋組織，室溫30 min。用去離子水對切片洗2次，每次5 min。用微波爐將EDTA抗原修復液煮沸，將切片浸入煮沸的EDTA抗原修復液中，熱修復15 min，室溫冷卻，冷卻后用PBS洗2次，每次5 min。將切片拿出，用紙將組織周圍擦干，滴加羊血清使其覆蓋組織，室溫避光封閉30 min。用抗體稀釋液按1:500稀釋LRP抗體，4 ℃過夜。第二天將切片用PBS洗3次，每次5 min。取出切片，用紙將組織周圍擦干，滴加增敏劑使其覆蓋組織，避光孵育20 min。將切片用PBS洗3次，每次5 min。取出切片，用紙將組織周圍擦干，滴加酶標羊抗小鼠/兔IgG集合物使其覆蓋組織，室溫避光孵育20 min。將切片用PBS洗3次，每次5 min。配置DAB顯色液，將DAB液滴到切片上，將組織完全浸沒20 s，馬上放于自來水中終止顯色。顯色后，取出切片，用紙將組織周圍擦干，滴加蘇木素使其覆蓋組織，5 min后，放于自來水中浸泡，經(jīng)過鹽酸乙醇浸泡1 s，自來水浸泡，氨水返藍5 min，自來水浸泡，待顯微鏡觀察后，將切片按乙醇濃度從60%至90%，每個濃度5 min浸泡，使切片脫水，將切片拿出，晾干，放入二甲苯中，15 min后取出切片，晾干，中性樹膠封片，切片掃描。

5.裸鼠皮下成瘤實驗：制備細胞系單細胞懸液，以0.2%洗必泰碘消毒小鼠背部皮膚，在無菌條件下，將5×106的細胞注射入小鼠左側(cè)和右側(cè)腋背部皮下，接種細胞懸液數(shù)天后，于接種部位皮下可見小米粒大小硬結(jié)。之后每隔7 d觀察記錄裸鼠皮下成瘤情況。腫瘤體積計算公式：V=L×D2/2（L為長徑，D為短徑）。并觀察裸鼠的一般生活狀況（精神、活動、飲食、皮膚色澤、糞便性狀等）。

6.結(jié)果判定：微血管密度（microvessel density，MVD）測定：在經(jīng)驗豐富的病理醫(yī)師指導下觀察切片。陽性判斷標準：血管內(nèi)皮細胞經(jīng)抗CD34抗體標記后，以DAB染液染色，胞漿呈棕黃色，細胞核為藍色條狀。MVD計數(shù)：在100倍顯微鏡視野內(nèi)選取被CD34標記良好的區(qū)域，再在400倍鏡下對3個視野的MVD進行計數(shù)，并取平均數(shù)來表示MVD（個/高倍視野）。

三、統(tǒng)計學方法

采用SPSS 16.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學處理，計數(shù)資料采用卡方檢驗或Fisher精確概率法；計量資料以（）表示，組間比較采用非參數(shù)秩和檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結(jié) 果

一、兩種腫瘤細胞中CD151與β-catenin蛋白表達情況

應用Western blot技術(shù)分別檢測HT-29和CD151--HT29細胞中CD151和β-catenin蛋白表達情況。結(jié)果顯示：HT-29細胞CD151蛋白呈高表達，而CD151--HT29細胞中CD151蛋白表達缺失；在HT-29細胞中β-catenin蛋白的表達量高于CD151-HT29細胞。見圖1。

圖1 Western blot檢測 HT-29和 CD151--HT29細胞中β-catenin蛋白的表達情況

二、兩種腫瘤細胞中β-catenin的mRNA表達情況

應用Real-Time PCR技術(shù)分別檢測HT-29和CD151--HT29細胞中β-catenin的mRNA表達情況。結(jié)果顯示：HT-29細胞中β-catenin的mRNA表達水平為（1.00±0.05），CD151--HT29細胞中β-catenin的mRNA表達水平為（0.56±0.06），對照組中β-catenin的mRNA表達水平顯著高于CD151--HT29細胞（t=9.758，P＜0.05）。見圖2。

三、兩種細胞裸鼠皮下移植瘤的對比情況

1.皮下移植瘤成瘤情況：將兩種細胞接種于裸鼠皮下后，HT-29細胞接種組于第5 d出現(xiàn)肉眼可見的瘤體，CD151--HT29細胞接種組第7 d出現(xiàn)肉眼可見的瘤體。經(jīng)過數(shù)天的觀察后，發(fā)現(xiàn)所有裸鼠接種細胞部位均可見肉眼可見的瘤體，成瘤率為100%。每隔7 d測量一次裸鼠皮下瘤的體積并記錄，細胞接種25 d后，脫臼處死裸鼠，剝?nèi)∑は铝鲶w，測量皮下瘤體的重量。

圖2 熒光定量PCR檢測HT-29細胞和CD151--HT29細胞中β-catenin mRNA的表達情況（P＜0.05）

2.兩種細胞皮下移植瘤體積和重量對比：如圖3所示，相對于HT-29細胞接種組，CD151--HT29細胞接種組的裸鼠皮下移植瘤增長明顯減慢（P＜0.05）；裸鼠經(jīng)過脫臼處死后，測量皮下瘤體重量，CD151--HT29細胞接種組的裸鼠皮下移植瘤重量為（1.059±0.065）g，明顯低于對照組（1.175±0.083）g（t=2.911，P＜ 0.05）。

圖3 HT-29細胞和CD151--HT29細胞皮下移植瘤生長情況

3.兩種細胞皮下移植瘤MVD差異情況：HT-29細胞組（42.20±5.36）個，CD151--HT29細胞組（32.80±5.89）個，CD151--HT29細胞接種組的裸鼠皮下移植瘤MVD計數(shù)明顯低于對照組（t=3.123，P＜0.05），見圖4。

討 論

遠處轉(zhuǎn)移是CRC患者死亡的主要原因之一［12-13］，研究發(fā)現(xiàn)血管生成在腫瘤生長及轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用，它不僅可以為腫瘤細胞的生長發(fā)育提供充足的營養(yǎng)，還能為腫瘤細胞轉(zhuǎn)移提供通道［14］。所以明確腫瘤血管增生機制從而進行人為干預是治療CRC的關(guān)鍵。

CD151基因定位于染色體11p15.5，其編碼的CD151蛋白最初被發(fā)現(xiàn)具有導致血小板聚集的功能，被命名為gp27。隨著研究深入，人們發(fā)現(xiàn)CD151屬于四跨膜蛋白超家族一員，并命名為血小板內(nèi)皮細胞四跨膜蛋白抗原3（platelet-endothelial cell tetraspanin anigen 3, PETA3）。一系列研究表明，CD151在乳腺癌、前列腺癌及胃癌等多種腫瘤組織中呈高表達，與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及預后具有相關(guān)性［15］。并且CD151還可影響腫瘤血管生成，但是具體作用機制尚不明確。我們推測CD151是否可以作為一個轉(zhuǎn)錄因子，調(diào)控某些血管生成相關(guān)信號通路，從而來影響腫瘤血管生成。

據(jù)報道CD151可以調(diào)節(jié)Wnt信號通路起始蛋白LRG-1和LGR-5的表達，進而激活Wnt信號通路。此外，Wnt/β-catenin信號通路在CRC的發(fā)生，發(fā)展及轉(zhuǎn)移中起著巨大作用，可調(diào)控血管內(nèi)皮生長因子VEGF的表達［16-17］。然而在CRC中關(guān)于CD151與β-catenin之間報道較少。本研究通過在HT-29和CD151--HT29兩種細胞中檢測β-catenin的表達情況，證實CD151可以調(diào)控β-catenin的表達。并通過兩種細胞的裸鼠皮下移植瘤實驗，驗證CD151--HT29細胞接種組裸鼠皮下瘤MVD明顯低于HT29細胞接種組。這提示CD151可以通過影響Wnt/β-catenin信號通路從而來影響腫瘤血管生成。

近十幾年來，隨著人們發(fā)現(xiàn)血管對腫瘤的生長及轉(zhuǎn)移的重要作用，針對血管生成的機制研究成為一個熱點，為腫瘤的治療開辟了新的思路。對于靶向血管生成的藥物，如貝伐單抗等，早已投入CRC的治療當中，并取得了巨大成功［18］。因此CD151未來也許可以作為一個潛在的治療靶點，從而研究出相對應的CD151特異性抑制劑，使更多患者獲益。