鱗狀上皮細(xì)胞癌抗原聯(lián)合人乳頭瘤病毒DNA檢測(cè)對(duì)非典型鱗狀上皮細(xì)胞的診斷意義

楊飛翔，江俊青，羅克鍇，趙錚

作者單位：1湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬東風(fēng)醫(yī)院檢驗(yàn)科，湖北 十堰 442000；2湖北醫(yī)藥學(xué)院藥護(hù)學(xué)院，湖北 十堰 442000

宮頸癌(Cervical Cancer)是臨床最常見的婦科惡性腫瘤之一，嚴(yán)重威脅著女性的生命健康[1-2]。目前，宮頸細(xì)胞學(xué)檢查(TCT)可較好的診斷出高級(jí)別宮頸細(xì)胞瘤變，但對(duì)于宮頸細(xì)胞學(xué)檢查為無法明確診斷意義的非典型鱗狀上皮細(xì)胞(atypical squamous cell of undermined significance,ASCUS)的病人，由于其病理結(jié)果具有多樣性，包括宮頸上皮細(xì)胞良性病變和不同程度宮頸上皮細(xì)胞瘤變(cervical intraepithelial neoplasia,CIN)，因此，臨床上對(duì)ASCUS的處理一直是宮頸疾病診治中的難點(diǎn)及爭(zhēng)論的焦點(diǎn)[3-4]。衛(wèi)生部關(guān)于子宮頸癌診斷指南中指出宮頸癌中70%～80%癌癥組織學(xué)分類屬于鱗狀細(xì)胞癌，血清中SCC水平是檢測(cè)腺癌的一種重要腫瘤標(biāo)志物，在宮頸癌發(fā)生和發(fā)展進(jìn)程中，由宮頸癌細(xì)胞所分泌或產(chǎn)生并釋放至血液，能反映宮頸癌發(fā)生發(fā)展過程，其對(duì)于宮頸癌的輔助診斷和預(yù)后效果評(píng)價(jià)具有較高的特異性，但敏感性較差，而HPV DNA對(duì)于宮頸癌早期診斷具有較高敏感性，但特異性較差，因此，本研究旨在探討二者的聯(lián)合篩查，提高其對(duì)宮頸癌早期診斷的敏感性或特異性，減少漏診率或降低誤診率，研究HPV DNA、血清SCC單一或聯(lián)合在ASCUSS病人分流管理中的意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料收集湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬東風(fēng)醫(yī)院2014年1月至2017年1月宮頸液基細(xì)胞學(xué)顯示為ASCUSS，并同時(shí)檢測(cè)SCC、HPV DNA及宮頸組織病理學(xué)分析的病人175例，同時(shí)，選取同期體檢健康女性50例為對(duì)照組，HPV和SCC均陰性。所有入選人員均無子宮切除術(shù)和宮頸手術(shù)史，年齡范圍為21～70歲，目前未懷孕，無骨盆放射治療史，無宮頸癌診斷史的已婚婦女。本研究符合《世界醫(yī)學(xué)協(xié)會(huì)赫爾辛基宣言》相關(guān)要求，病人或近親屬對(duì)研究方案簽署知情同意書。

1.2 主要儀器與試劑美國雅培Abbott I2000全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光儀、液基細(xì)胞學(xué)制片分析系統(tǒng)、潮州凱普HPV基因分型檢測(cè)試劑盒、美國Applied Biosystems公司PCR儀、北京白洋臺(tái)式血清離心機(jī)等。

1.3 研究方法

1.3.1血清學(xué)檢測(cè) 采用促凝采血管，空腹采取肘靜脈血3～5 mL，4 000 r/min離心5 min分離血清。SCC含量測(cè)定采用電化學(xué)發(fā)光法，采用美國雅培Abbcott I2000全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光儀進(jìn)行檢測(cè)。SCC參考范圍：0～1.5 ng/mL，SCC>1.5 ng/mL即為陽性。

1.3.2液基細(xì)胞學(xué)檢測(cè) 病人均處于非月經(jīng)期，采集前1 d無性生活，且檢測(cè)前3 d無陰道用藥，標(biāo)本采集由專業(yè)婦科醫(yī)生進(jìn)行，采用專用取樣刷于宮頸管鱗柱交界可疑病變處，將宮頸移行帶區(qū)脫落細(xì)胞洗入試劑配套的專用保存液中及時(shí)常溫送檢。同時(shí)采集兩份，一份做細(xì)胞學(xué)檢測(cè)，一份做HPV DNA檢測(cè)。液基細(xì)胞學(xué)檢測(cè)采用2001版國際癌癥協(xié)會(huì)推薦的TBS系統(tǒng)分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行分級(jí)，由兩名病理醫(yī)師對(duì)結(jié)果進(jìn)行判讀。

1.3.3HPV DNA分析 采用潮州凱普公司的PCR+膜雜交法檢測(cè)HPV DNA，其中高危HPV16、18、31、33、35、39、45、51、52、53、56、58、59、66、68共15種，低危HPV6、11、42、43、44、81共6種，共21種。操作步驟按照試劑說明書進(jìn)行。PCR反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性10 min，95 ℃變性20 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，40個(gè)循環(huán)，最后72 ℃延伸5 min。雜交檢測(cè)結(jié)果陽性點(diǎn)為清晰可見的藍(lán)紫色原點(diǎn)，根據(jù)膜條HPV分布圖，判斷陽性點(diǎn)的HPV分型。

1.3.4宮頸病理組織活檢 在婦科醫(yī)生的指導(dǎo)下進(jìn)行陰道鏡檢查，對(duì)可疑部位進(jìn)行多點(diǎn)取材，如無異常則區(qū)3，6，9，12點(diǎn)處，組織標(biāo)本用甲醛固定后及時(shí)送病理科檢測(cè)。組織病理診斷由高年資病理醫(yī)師做出最后診斷，組織病理學(xué)結(jié)果：正?；蚵匝装Y、CIN Ⅰ～Ⅲ級(jí)，宮頸癌(浸潤(rùn)性鱗狀細(xì)胞癌、腺癌、其他宮頸細(xì)胞癌)。組織學(xué)陽性：高級(jí)別宮頸上皮細(xì)胞瘤變，即≥宮頸上皮內(nèi)瘤變CINⅡ者為陽性，組織學(xué)陰性：正常、慢性炎癥、尖銳濕疣、低級(jí)別宮頸上皮細(xì)胞瘤變(CINⅠ)。

2 結(jié)果

2.1 不同年齡段ASCUSS病人病理檢查結(jié)果分析以宮頸組織病理學(xué)為標(biāo)準(zhǔn)，175例ASCUSS病人中，共檢出炎癥或正常133例，CIN Ⅰ 28例，CINⅡ/Ⅲ 12例，宮頸鱗狀細(xì)胞癌2例，21～30歲占總例數(shù)的20.57%(36/175)，其中13.89%檢出CINⅡ及以上病變；>30～40歲占22.29%(39/175)，其中12.82%檢出CINⅡ及以上病變；>40～50歲占34.85(61/175)，其中6.56%檢出CINⅡ及以上病變。CINⅡ及以上病理結(jié)果檢出主要集中在21～50歲之間，年齡>50歲，未檢出CINⅡ及以上病變；21～50歲之間，不同年齡段之間CINⅡ及以上檢出率均差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

2.2 ASCUS病人HPV、SCC與病理結(jié)果分析宮頸癌組病人血清SCC水平明顯其他各組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)；CINⅡ/Ⅲ組病人血清SCC水平明顯高于健康組、正?；蜓装Y組、CINⅠ組(均P<0.05)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見表2。

表2 ASCUSS不同病理結(jié)果中血清SCC含量分析

注：a為與健康組、正?；蜓装Y組比較，P<0.05；b為與CINⅠ比較，P<0.05；c為與CINⅡ/Ⅲ組比較，P<0.05

2.3 ASCUS病人HPV檢測(cè)、SCC含量與組織病理活檢結(jié)果175例ASCUS病人中，HPV陽性75例，占42.86%(75/175)，HPV陽性組與HPV陰性組對(duì)于CINⅡ及以上的檢出率分別為16.0%(12/75)和2.0%(2/100)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=9.590，P=0.002)。HPV在正常或炎癥組、CINⅠ組、CINⅡ/Ⅲ組、宮頸癌組中組織學(xué)陽性檢出率分別為33.83%(45/133)、64.29%(18/28)、83.33%(10/12)、100.0%，隨著宮頸細(xì)胞瘤變程度的加重，HPV陽性率逐漸增加。而ASCUS病人中，血清SCC水平大于1.5 ng/mL有16例，占9.14%，SCC>1.5 ng/mL在ASCUS病人中對(duì)于CINⅡ及以上的檢出率為37.5%(6/16)，顯著高于SCC≤1.5 ng/mL病理檢出率5.03%(8/159)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=16.644，P=0.000)；SCC陽性在正?；蜓装Y組、CINⅠ組、CINⅡ/Ⅲ組、宮頸癌組中檢出率分別為4.51%(6/133)、14.29%(4/28)、33.330%(4/12)、100.00%，隨著宮頸細(xì)胞瘤變程度增加，SCC陽性率逐漸增加。

以宮頸病理組織活檢為標(biāo)準(zhǔn)，高級(jí)別宮頸上皮細(xì)胞瘤變即≥宮頸上皮內(nèi)瘤變CINⅡ者為陽性，HPV DNA和血清SCC水平測(cè)定對(duì)于預(yù)測(cè)CINⅡ及以上病理結(jié)果的靈敏度、特異度、陰性預(yù)測(cè)值及陽性預(yù)測(cè)值分別為85.71%和42.86%、60.87%和93.79%、98.00%和94.97%、16.00%和37.50%。為提高其靈敏性，降低漏診率，采取并聯(lián)試驗(yàn)，即SCC和HPV中任一為陽性即判定為陽性，二者聯(lián)合檢測(cè)應(yīng)用于預(yù)測(cè)高級(jí)別宮頸癌病變的靈敏性、特異度、陰性預(yù)測(cè)值及陽性預(yù)測(cè)值分別為92.86%、57.76%、98.94%、16.05%。見表3。

表3 175例ASCUS病人HPV檢測(cè)、血清SCC含量與組織病理活檢結(jié)果分析比較/例

2.4 ASCUS病人主要HPV感染亞型及病理檢查結(jié)果分析HPV感染陽性組中，主要HPV感染亞型有16、18、52、58、33，其分別對(duì)應(yīng)CINⅡ及以上患病率為24.14%(7/29)、10.00%(1/10)、10.00%(1/10)、10.00%(1/10)、28.57%(2/7)。正?；蜓装Y組、CINⅠ組、CINⅡ組中分別有3例、1例、1例多重HPV亞型感染，CINⅡ中一例混合感染HPV33和53型。CINⅡ及以上病人14例，HPV陽性檢出率為85.71%(12/14)，其中，HPV16、18、33、52、58在高級(jí)別宮頸組織瘤變病人中分別占50.00%(7/14)、7.14%(1/14)、14.29%(2/14)、7.14%(1/14)、7.14%(1/14)。在正常或低級(jí)別瘤變組中，有低危型HPV感染，而在高級(jí)別宮頸細(xì)胞瘤變中未見低危HPV亞型感染的發(fā)生。見表4。

表4 ASCUS病人主要HPV感染分型及病理檢查結(jié)果比較/例

3 討論

宮頸癌是威脅發(fā)展中國家女性健康的主要衛(wèi)生問題之一，我國每年約有15萬宮頸癌新發(fā)病例[5]。宮頸癌的發(fā)生起源于宮頸組織細(xì)胞異常增生，而早期宮頸癌無明顯臨床指征，因此容易造成漏診或誤診。臨床常用的宮頸細(xì)胞學(xué)檢查在宮頸癌早期篩查中可有效篩查出大部分高級(jí)別CIN，但是其對(duì)于低級(jí)別CIN靈敏性較差，特別是宮頸細(xì)胞學(xué)ASCUS狀態(tài)，因?yàn)樵摖顟B(tài)可能是潛在惡性改變或是增生活躍的良性改變，因此，對(duì)于ASCUS分流管理對(duì)于宮頸癌的漏診誤診具有很重要的意義。本調(diào)查資料顯示，175例ASCUSS病人中，共檢出高級(jí)別宮頸上皮細(xì)胞瘤變病例14例，其中檢出宮頸癌病人2例，因此，如果對(duì)ASCUS病人簡(jiǎn)單地進(jìn)行隨診處理，無疑會(huì)漏診一部分癌前病變甚至是宮頸癌病人。

女性生殖道HPV持續(xù)感染是高級(jí)別 CIN及宮頸癌發(fā)生的必然條件[6-7]，CIN病人中80%～90%伴有 HPV 感染，通常認(rèn)為年輕婦女(<30歲)的HPV感染是一過性的，大部分HPV 感染會(huì)自然消退，僅5%～10%發(fā)展為持續(xù)感染[8]。HPV的檢出率隨著宮頸病變的嚴(yán)重程度增加而增加，在本研究中175例ASCUSS病人中，HPV檢出率為42.86%，HPV DNA陽性對(duì)于CINⅡ及以上的檢出率顯著高于HPV DNA陰性病例檢出率，且隨著CIN級(jí)別的增加，HPV陽性率越高，因此，對(duì)于ASCUS病人，行HPV DNA篩查可有效的分流ASCUS病人。但在高級(jí)別宮頸上皮細(xì)胞瘤變病例中，也有HPV陰性者，這可能與我院檢測(cè)試劑盒檢測(cè)范圍的局限性，也可能與病人取材有關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)，HPV感染率與感染亞型分布存在一定地域差異，魏英等研究湖北十堰地區(qū)[9]，徐萬洲等[10]研究湖北省地區(qū)女性宮頸人乳頭狀瘤病毒感染與亞型分布，發(fā)現(xiàn)湖北地區(qū)HPV感染亞型主要為16、18、52、58型，而本研究中HPV 感染主要亞型是16、18、52、58、33，說明我省HPV感染亞型主要是16、18、52、58型。

在宮頸癌早期篩查中，HPV DNA檢測(cè)具有較高的靈敏度，但也存在一定局限性，如特異性較差[11]，假陽性、假陰性等問題，在本研究中，若以宮頸病理組織活檢為標(biāo)準(zhǔn)，高級(jí)別宮頸上皮細(xì)胞瘤變，即≥宮頸上皮內(nèi)瘤變CINⅡ者為陽性，HPV DNA單一檢測(cè)對(duì)于預(yù)測(cè)CINⅡ及以上病理結(jié)果的靈敏度達(dá)到85.7%，但特異性僅60.9%。血清腫瘤標(biāo)志物SCC水平可反映腺癌發(fā)生發(fā)展的狀態(tài)，在惡性腫瘤的輔助診斷中起著重要作用，特別是反映晚期宮頸癌狀態(tài)及宮頸癌預(yù)后效果評(píng)價(jià)[12]，其無創(chuàng)、簡(jiǎn)單、易于病人接受。然而，單一標(biāo)志檢查雖有較高特異性但其也有局限性，因此，臨床上很少使用血清SCC水平來診斷早期宮頸癌。在本研究中，血清SCC水平測(cè)定對(duì)于預(yù)測(cè)CINⅡ及以上病理結(jié)果的靈敏度僅有42.86%，特異度超過90%，而二者聯(lián)合檢測(cè)應(yīng)用于預(yù)測(cè)高級(jí)別宮頸癌病變的靈敏性、特異度、陰性預(yù)測(cè)值及陽性預(yù)測(cè)值分別為92.86%、57.76%、98.94%、16.05%。二者聯(lián)合檢測(cè)，可以有效提高對(duì)于高級(jí)別宮頸細(xì)胞瘤變檢出的靈敏性和陰性預(yù)測(cè)值，提高ASCUSS病人對(duì)于高級(jí)別CIN篩查的靈敏性和準(zhǔn)確性，減少ASCUS病人中高級(jí)別瘤變的漏診，也可以減少不必要的陰道鏡檢查或?qū)m頸活檢等有創(chuàng)操作。

在本研究中雖然發(fā)現(xiàn)HPV DNA檢測(cè)聯(lián)合SCC測(cè)定，可以有效提高對(duì)于高級(jí)別宮頸細(xì)胞瘤變檢出的靈敏性和陰性預(yù)測(cè)值，提高ASCUSS病人對(duì)于高級(jí)別CIN篩查的靈敏性和準(zhǔn)確性，但聯(lián)合檢測(cè)相對(duì)于HPV DNA在靈敏性方面僅提高7%，提高幅度較小，同時(shí)在研究ASCUS不同病理狀態(tài)SCC水平含量時(shí)，CIN Ⅰ組數(shù)據(jù)不成正態(tài)分布，造成這些問題的原因可能是我院為職工醫(yī)院，收集標(biāo)本多年齡主要集中在21～50歲之間，可能造成數(shù)據(jù)的偏態(tài)分布，同時(shí)對(duì)于ASCUS狀態(tài)的診治臨床學(xué)界尚處于爭(zhēng)議階段，病人對(duì)于宮頸細(xì)胞學(xué)檢出ASCUS狀態(tài)，大多采取保守治療，如定期復(fù)查宮頸細(xì)胞學(xué)檢查或HPV DNA檢測(cè)，而取同時(shí)行HPV DNA、血清SCC含量檢測(cè)、宮頸組織活檢的病人少之又少，因此，造成收集病例數(shù)量偏少，而沒有充分發(fā)揮二者聯(lián)合檢測(cè)提高靈敏性的效果。雖然二者聯(lián)合檢測(cè)可提高靈敏度，但特異度仍較低，因此，研究靈敏性、特異性更高的宮頸細(xì)胞分子標(biāo)志物如HPV E6/E7 mRNA，HPV蛋白，p16，Ki67，TOP2A/MCM2等細(xì)胞因子以及DNA甲基化對(duì)于宮頸癌早起診治具有重要的意義。

總之，單獨(dú)HPV DNA或血清SCC檢測(cè)對(duì)于宮頸癌早期病變?cè)\斷和分流具有重要作用，但各自都有其局限性，兩者聯(lián)合檢測(cè)可有效提高宮頸癌高級(jí)別病變的靈敏性，減少宮頸癌高級(jí)別病變的漏診和不必要的活檢，能在早期有效分流管理ASCUS人群。