“武當(dāng)二號(hào)金銀花”和“武當(dāng)三號(hào)金銀花”不同藥用部位中木犀草素的含量測(cè)定

李聰，李鵬，紀(jì)春草，鄭芳，朱雪松，李志浩，劉慧敏，熊琳，黃麟杰

作者單位：1湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬東風(fēng)醫(yī)院藥學(xué)部，武當(dāng)特色中藥研究所湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北 十堰 442000；2湖北醫(yī)藥學(xué)院藥學(xué)院，湖北 十堰 442000

湖北武當(dāng)生物醫(yī)藥科技有限公司將“亞特良種金銀花”與來(lái)源于武當(dāng)?shù)貐^(qū)金銀花結(jié)合進(jìn)行培育，培植出適合武當(dāng)?shù)貐^(qū)生長(zhǎng)的3個(gè)優(yōu)良獨(dú)特品種，分別“武當(dāng)一號(hào)金銀花”、“武當(dāng)二號(hào)金銀花”、“武當(dāng)三號(hào)金銀花”。鑒于本地區(qū)光照條件好、雨量充沛、四季分明，適合藥材生長(zhǎng)的優(yōu)越自然條件，已推廣種植，我市金銀花基地達(dá)到4萬(wàn)余畝，其中培植“武當(dāng)三號(hào)”已成為全省最大的紅色金銀花基地，總產(chǎn)量高達(dá)2 000余噸，市場(chǎng)前景廣闊。本課題組已從采收期、不同花期、不同干燥方法、提取工藝研究等方面，分別對(duì)武當(dāng)二號(hào)金銀花、武當(dāng)三號(hào)金銀花不同藥用部位，如花蕾、藤中的綠原酸、蘆丁和木犀草苷等不同有效成分進(jìn)行了分析研究[1-5]，研究初步表明其有效成分綠原酸、木犀草苷含量遠(yuǎn)高于《中國(guó)藥典》 (2015年版)中“金銀花”項(xiàng)下相應(yīng)規(guī)定[6]，且產(chǎn)量高出金銀花3～5倍以上。

“忍冬”之名遠(yuǎn)早于金銀花，最早出現(xiàn)于東晉葛洪著《肘后備急方》，記載“忍冬莖葉銼數(shù)壺煮”，故本草中最早用“忍冬”為藥名，宋代之前只用莖、葉；明代則以莖、葉、花共同入藥，其后主要以花入藥為主，莖葉則分列為另一種藥材，以“忍冬藤”為名。現(xiàn)代研究表明，忍冬藤、忍冬葉亦具有清熱解毒、抗菌消炎、疏風(fēng)通絡(luò)的功效[7-12]。因此，本課題組對(duì)優(yōu)質(zhì)量、高產(chǎn)量的3個(gè)獨(dú)特的“武當(dāng)金銀花” 品種進(jìn)行深加工和綜合利用，具有較高的社會(huì)效益和經(jīng)濟(jì)效益。本研究自2016年10月至2017年10月以木犀草素為質(zhì)控指標(biāo)，分別對(duì)武當(dāng)二號(hào)金銀花、武當(dāng)三號(hào)金銀花的花蕾、葉、藤不同藥用部位進(jìn)行分析比較研究，旨在為推進(jìn)本地區(qū)武當(dāng)金銀花的資源開發(fā)和綜合利用提供依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器高效液相色譜儀(DIONEX，型號(hào)：UltiMate 3000)；WTF20002電子天平(杭州萬(wàn)特衡器有限公司，d=0.01 g)；METTLER TOLEDO電子分析天平(d=0.01 mg)；高速萬(wàn)能粉碎機(jī)(天津市泰斯特儀器有限公司，型號(hào)：頻率(50±1)Hz，F(xiàn)W100型)；數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司，型號(hào)：額定頻率40 kHz，KQ-500DE型)；電熱恒溫干燥箱(蘭州宏瑞食品有限公司，型號(hào)：202型)。

1.2 試藥木犀草素對(duì)照品(中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào)111720-200604)；“武當(dāng)二號(hào)金銀花”和“武當(dāng)三號(hào)金銀花”的花蕾、葉、藤分別于2015年5月23日、2016年5月18日、2017年5月20日采自湖北武當(dāng)生物醫(yī)藥科技有限公司賽武當(dāng)金銀花種植基地，并經(jīng)湖北醫(yī)藥學(xué)院陳吉炎教授鑒定為忍冬科植物忍冬(LoniceraJaponicaThunb.)的花蕾、莖枝和葉；高效液相所用甲醇和乙腈為色譜純，其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 藥材的預(yù)處理新采的三批(20150523，20160518，20170520)“武當(dāng)二號(hào)金銀花”和“武當(dāng)三號(hào)金銀花”的花蕾、葉和藤，用清水洗凈，將藤剪成約2 cm莖枝段，蒸汽殺青(花蕾、葉和藤分別約蒸3、6、10 min)后，置45 ℃電熱恒溫干燥箱干燥、粉碎后過(guò)篩(花蕾和葉的干燥粉末過(guò)四號(hào)篩，藤的干燥粉末過(guò)三號(hào)篩)，干燥粉末經(jīng)過(guò)篩后置密閉的棕色瓶，并置干燥器中，于冰箱中保存(2～4 ℃)，備用。

2.2 溶液的制備

2.2.1對(duì)照品溶液的制備 精密稱取木犀草素對(duì)照品3.84 mg，置50 mL棕色量瓶中，用甲醇稀釋，得到濃度為76.8 μg/mL的對(duì)照品儲(chǔ)備液；精密量取適量上述儲(chǔ)備液，用85%乙醇稀釋10倍，得濃度為7.68 μg/mL的對(duì)照品溶液。上述溶液均用封口膜封上，置2～4 ℃冰箱中備用。

2.2.2供試品溶液的制備 精密稱取“2.1”項(xiàng)下預(yù)處理的“武當(dāng)二號(hào)金銀花”干燥的花蕾、葉和藤(簡(jiǎn)稱二蕾、二葉和二藤)粉末和“武當(dāng)三號(hào)金銀花”干燥的花蕾、葉和藤(簡(jiǎn)稱三蕾、三葉和三藤)粉末各一份(其中二蕾、二藤和三蕾約1 g；二葉、三葉和三藤約0.5 g)，置具塞錐形瓶中，加85%乙醇各20 mL，稱量，超聲處理(超聲功率：500 W，頻率：40 kHz，超聲溫度：40 ℃)45 min，放冷，再稱量，用85%乙醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，用有機(jī)相過(guò)濾頭(0.22 μm)過(guò)濾，棄去初濾液，取續(xù)濾液，即得。

2.3 色譜條件與系統(tǒng)適應(yīng)性色譜柱：Fortis-C18柱(250 mm×4.6 mm,5 μm)；流動(dòng)相：甲醇-乙腈-0.4%磷酸溶液(50∶5∶45)；流速為0.6 mL/min；柱溫為30 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)為350 nm；進(jìn)樣量為20 μL。在此色譜條件下，分別進(jìn)樣“2.2.2”項(xiàng)下木犀草素對(duì)照品溶液和供試品溶液，記錄色譜圖(圖1)。結(jié)果：木犀草素色譜峰保留時(shí)間約為17 min，理論塔板數(shù)以木犀草素色譜峰計(jì)不低于6 600，其DAD匹配值均不低于999.4，分離度均不低于2.0。

圖1 HPLC色譜圖(λ=350 nm)：A為對(duì)照品圖；B為三號(hào)葉供試品圖；C為三號(hào)藤供試品圖；D為三號(hào)花供試品圖

2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制精密吸取“2.2.1”項(xiàng)下木犀草素的對(duì)照品儲(chǔ)備液適量，共6份，用甲醇稀釋成濃度分別為1.536、3.072、6.144、9.216、12.288、15.36 μg/mL的對(duì)照品溶液，分別進(jìn)樣20 μL，記錄木犀草素色譜峰面積。以進(jìn)樣濃度(X，μg/mL)為橫坐標(biāo)，峰面積(Y)為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得木犀草素回歸方程為Y=3.4039X+0.1967(r=0.999 5)。結(jié)果表明木犀草素在1.536～15.36 μg/mL濃度范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系。

2.5 精密度試驗(yàn)精密吸取“2.2.1”項(xiàng)下濃度為7.68 μg/mL的對(duì)照品溶液20 μL注入液相色譜儀，連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄峰面積，測(cè)得木犀草素峰面積的RSD為0.93% (n=6)，表明儀器精密度良好。

2.6 重復(fù)性試驗(yàn)取批號(hào)為20170520的“武當(dāng)三號(hào)金銀花”葉干燥粉末，按“2.2.2”項(xiàng)下的方法制備供試品溶液，平行操作制備6份，按“2.3”項(xiàng)下色譜條件各進(jìn)樣20 μL，記錄峰面積，結(jié)果木犀草素峰面積的RSD為1.62%(n=6)，表明該方法重復(fù)性良好。

2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn)取批號(hào)為20170520的“武當(dāng)三號(hào)金銀花”葉干燥粉末，按“2.2.2”項(xiàng)下的方法制備供試品溶液1份，分別于0、4、8、12、16、20、24 h按“2.3”項(xiàng)下的色譜條件進(jìn)樣20 μL，記錄峰面積，結(jié)果木犀草素峰面積的RSD(n=7)分別為1.37% (n=7)，表明在24 h內(nèi)供試品溶液穩(wěn)定。

2.8 加樣回收率試驗(yàn)取批號(hào)為20170520的“武當(dāng)三號(hào)金銀花”葉的干燥粉末0.25 g(每1 g葉中含木犀草素為0.233 mg)，共9份，分三組，精密稱定，分別精密加入“2.2.1”項(xiàng)下的濃度為7.68 μg/mL的木犀草素對(duì)照品溶液6.0、7.5、9.0 mL(低、中、高各三份)于上述三組樣品中，按“2.2.2”項(xiàng)下三葉供試品制備的方法制備溶液，依據(jù)“2.3”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣20 μL,測(cè)定木犀草素的峰面積，并按標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算的含量。結(jié)果見表1。

表1 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果(n=6)

2.9 樣品含量測(cè)定分別取3批(20150523，20160518，20170520)按“1.3”項(xiàng)下方法預(yù)處理及儲(chǔ)存的“武當(dāng)二號(hào)金銀花”和“武當(dāng)三號(hào)金銀花”干燥的花蕾、葉和藤適量，分別按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.3”項(xiàng)下色譜條件各進(jìn)樣20 μL,測(cè)定木犀草素的峰面積，并按標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算含量。結(jié)果見表2。結(jié)果表明，“武當(dāng)二號(hào)金銀花”和“武當(dāng)三號(hào)金銀花” 三個(gè)部位的干燥品在遮光、密閉、低溫條件下貯藏，比較適宜，含量方面武當(dāng)三號(hào)金銀花三個(gè)部位木犀草素含量含量較二號(hào)高，且含量次序均為葉>藤>花蕾，其中葉中含木犀草素的含量幾乎為花蕾的3倍。

表2 3批藥材中木犀草素含量測(cè)定結(jié)果/(mg/g)

3 討論

3.1 供試品提取條件的優(yōu)化本實(shí)驗(yàn)在前期課題組的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，分別比較了加熱回流、索氏及超聲幾種提取方式，最后確定超聲提取作為本實(shí)驗(yàn)供試品處理的最佳提取方式[1-5]。在500 W超聲功率、40 kHz超聲頻率、(40±2)℃的超聲溫度條件下，分別對(duì)超聲提取時(shí)間(30、45、60、75、90 min)、提取溶劑(55%乙醇、65%乙醇、75%乙醇、85%乙醇、95%乙醇)及不同的物料比(1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50、1∶60)等方面做了系列考察，結(jié)果在提取溶劑為85%乙醇、超聲時(shí)間為45 min時(shí)，兩種藥材三個(gè)部位中的木犀草素基本提取完全，武當(dāng)二號(hào)的花蕾、藤與武當(dāng)三號(hào)花蕾適宜物料比為1∶20，武當(dāng)二號(hào)葉、武當(dāng)三號(hào)葉和武當(dāng)三號(hào)藤適宜物料比為1∶40。

3.2 色譜分析條件的選擇在波長(zhǎng)范圍為190～400 nm內(nèi)，采用二極管陣列檢測(cè)器對(duì)木犀草素對(duì)照品溶液進(jìn)行全波長(zhǎng)光譜掃描，結(jié)果在350 nm附近有最大吸收，故選擇該波長(zhǎng)為該試驗(yàn)?zāi)鞠菟氐臋z測(cè)波長(zhǎng)。本實(shí)驗(yàn)在甲醇和磷酸水溶液做為流動(dòng)相組分的基礎(chǔ)上，雖然只加入了少量乙腈，但對(duì)木犀草素的出峰時(shí)間、峰形、峰純度及柱效的改善，起了一定作用。當(dāng)甲醇-乙腈-0.4%磷酸為50∶5∶45時(shí)，出峰時(shí)間適宜(小于20 min)，峰形好，柱效和峰純度均較高[1]。

3.3 儲(chǔ)存條件及不同藥用部位對(duì)有效成分差異的影響本課題組曾對(duì)“武當(dāng)二號(hào)金銀花”和“武當(dāng)三號(hào)金銀花”的花蕾期、銀花期及金花期木犀草苷的分別進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果花蕾期較銀花期、金花期含量高，故本文選擇花蕾為研究對(duì)象。本實(shí)驗(yàn)考察了兩種藥材三個(gè)部位在遮光、密閉、2～4 ℃貯藏條件下，隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)，木犀草素的含量下降3%～5%，表明 “武當(dāng)二號(hào)金銀花”和“武當(dāng)三號(hào)金銀花” 三個(gè)部位的干燥樣品在遮光、密閉、低溫條件下貯藏適宜；含量方面，三個(gè)部位木犀草素含量的高低次序均為葉>藤>花蕾，三個(gè)部位含量差異較大，其中葉中含木犀草素的含量幾乎為花蕾的3倍。結(jié)合本課題組前期研究成果[1-3,5]，“武當(dāng)三號(hào)金銀花”中木犀草苷在花蕾、葉、藤中的平均含量分別為0.169、5.86、1.045 mg/g，蘆丁的平均含量分別為0.152、3.46、0.548 mg/g，初步表明其含量高低次序葉>藤>花蕾，驗(yàn)證了本草考證中“宋代之前只用莖、葉”的有效性。目前金銀花葉、藤作為副產(chǎn)物，一年四季均可采摘，同時(shí)產(chǎn)量約為花及花蕾的10倍之多，但目前金銀花葉被開發(fā)利用較少。由此，筆者認(rèn)為可進(jìn)一步擴(kuò)大金銀花的藥用部位，以最大限度利用金銀花資源。

本實(shí)驗(yàn)采用HPLC-DAD法測(cè)定“武當(dāng)二號(hào)金銀花”和“武當(dāng)三號(hào)金銀花”花蕾、葉和藤中木犀草素的含量，該方法簡(jiǎn)單快速，靈敏準(zhǔn)確，重復(fù)性好，不同采收期對(duì)葉、藤等有效成分種類及含量差異的影響有待進(jìn)一步研究，旨對(duì)武當(dāng)金銀花的循環(huán)綜合利用研究奠定基礎(chǔ)。