尿酸激活Nrf2-ARE信號(hào)通路對(duì)帕金森病小鼠的保護(hù)作用

黃婷婷，郝冬琳，吳波娜，毛倫林，張金

作者單位：江蘇大學(xué)附屬武進(jìn)人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，江蘇 常州 213002

帕金森病(Parkinson’s disease,PD)是一種常見的神經(jīng)變性疾病，主要臨床表現(xiàn)是運(yùn)動(dòng)障礙，包括靜止性震顫、肌強(qiáng)直和運(yùn)動(dòng)遲緩。PD的病理特征是黑質(zhì)和紋狀體多巴胺能神經(jīng)元丟失。氧化應(yīng)激和神經(jīng)炎癥是PD主要的發(fā)病機(jī)制，可能參與了多巴胺能神經(jīng)元的損傷[1-2]。由于1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氫吡啶(MPTP)通過誘導(dǎo)活性氧和炎癥反應(yīng)，選擇性損傷多巴胺能神經(jīng)元，使得MPTP注射動(dòng)物制成的PD動(dòng)物模型成為廣泛應(yīng)用的PD動(dòng)物模型[3]。目前多巴胺替代治療只能緩解癥狀，但不能阻止神經(jīng)變性過程。長(zhǎng)期使用會(huì)產(chǎn)生運(yùn)動(dòng)障礙等并發(fā)癥[4]。因此，尋找有效的神經(jīng)保護(hù)劑并探索多巴胺能神經(jīng)元丟失的機(jī)制，仍然是PD治療的重要挑戰(zhàn)。

尿酸是飲食嘌呤或核酸降解的最終產(chǎn)品。高尿酸水平與多種疾病有關(guān)，包括高血壓、動(dòng)脈粥樣硬化、高脂血癥和胰島素抵抗[5]。尿酸是一種強(qiáng)抗氧化分子，對(duì)某些中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病具有保護(hù)作用。與健康對(duì)照相比，PD病人的血清和黑質(zhì)尿酸水平顯著降低[6-7]。因此，我們推測(cè)尿酸的抗氧化特性可能對(duì)PD的多巴胺能神經(jīng)元具有保護(hù)作用。

本研究自2015年5月至2017年5月應(yīng)用MPTP誘導(dǎo)PD小鼠，并觀察尿酸的神經(jīng)保護(hù)作用以及尿酸對(duì)氧化應(yīng)激和神經(jīng)炎癥的調(diào)控。

1 材料與方法

1.1 藥品和試劑尿酸和MPTP購(gòu)自美國(guó)Sigma-Aldrich公司，并在鹽水中溶解。給藥前，尿酸溶液通過2.2 mm無(wú)菌過濾器進(jìn)行純化。兔抗小鼠酪氨酸羥化酶(TH)抗體(目錄號(hào)t8700)購(gòu)自美國(guó)Milipore公司?？贵wNrf2(目錄號(hào)12721p)購(gòu)自美國(guó)細(xì)胞信號(hào)技術(shù)公司。

1.2 動(dòng)物雄性C57BL/6J小鼠(6～8周、20～25 g)30只，購(gòu)自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司。小鼠飼養(yǎng)于SPF條件、恒溫(21±1)℃及自動(dòng)12 h/12 h的光暗循環(huán)。所有的動(dòng)物研究均由江蘇大學(xué)附屬武進(jìn)醫(yī)院動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.3 分組采用隨機(jī)數(shù)字表法將30只小鼠分為三組：對(duì)照組(生理鹽水)、MPTP組、尿酸組(尿酸+MPTP)，每組各10只。MPTP組小鼠經(jīng)腹腔注射MPTP(20 mg/kg)每天1次，連續(xù)7 d。尿酸組于MPTP給藥之前2 h腹腔注射尿酸(250 mg/kg)，共13 d(MPTP注射前3 d，MPTP注射同時(shí)的7 d，MPTP結(jié)束后3 d)。對(duì)照組接受0.9%生理鹽水代替MPTP和尿酸。在第14天測(cè)量各組小鼠的行為和認(rèn)知功能，然后殺死小鼠獲取腦組織進(jìn)行進(jìn)一步的分析。

1.4 行為學(xué)測(cè)量(1)轉(zhuǎn)棒試驗(yàn)：將小鼠置于直徑7 cm的旋轉(zhuǎn)圓棒上，調(diào)整轉(zhuǎn)棒速度為30周/分。記錄小鼠被置于棒上至墜落的時(shí)間(跌落潛伏期)，每只動(dòng)物重復(fù)測(cè)3次，每次間隔5 min，取平均值。測(cè)試前每只動(dòng)物均進(jìn)行兩次適應(yīng)性訓(xùn)練。(2)爬桿試驗(yàn)：將小鼠頭端向下置于桿頂，記錄小鼠由60 cm高度爬至桿底平面的時(shí)間(爬下時(shí)間)，每只動(dòng)物測(cè)3次，每次間隔5 min。測(cè)試前引導(dǎo)小鼠自桿頂爬下至桿底兩次進(jìn)行適應(yīng)。

1.5 認(rèn)知功能測(cè)量應(yīng)用Morris水迷宮試驗(yàn)測(cè)定小鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力，包括定位導(dǎo)航試驗(yàn)和空間探索試驗(yàn)。定位導(dǎo)航試驗(yàn)：一個(gè)透明平臺(tái)放置在4個(gè)象限中的1/2個(gè)半徑內(nèi)，水面高于平臺(tái)頂部1 cm。小鼠被放置在遠(yuǎn)離平臺(tái)的相對(duì)象限，允許它找到并爬上平臺(tái)。每只小鼠發(fā)現(xiàn)并爬上平臺(tái)的時(shí)間被記錄為逃避潛伏期，并從4個(gè)象限的試驗(yàn)結(jié)果得到平均值。如果小鼠沒有找到平臺(tái)，逃避潛伏期記為60 s，空間探索試驗(yàn)：從水池中移去上面的平臺(tái)，小鼠被置于前一個(gè)測(cè)試的對(duì)面象限的水中。觀察每只小鼠的游泳路徑60 s，記錄小鼠越過原平臺(tái)位置的次數(shù)。

1.6 免疫熒光染色行為學(xué)測(cè)試后，小鼠以4%水合氯醛，0.9%生理鹽水灌注15 min麻醉，采用多聚甲醛(4%)在0.1 mol/L PBS(pH 7.4)中固定20 min，收集大腦組織，多聚甲醛4℃固定過夜后，30%蔗糖在4℃保存72 h。用冷凍切片機(jī)把大腦切成20 μm連續(xù)冠狀切片。然后將切片保存在0.1 mol/L的PBS中，用3%BSA和0.3%的Triton室溫孵育2 h封閉抗原。PBS洗滌后，切片用兔抗小鼠TH抗體(1∶400)4℃孵育24 h，用Alexa Fluor 488處理標(biāo)記的羊抗兔IgG(1∶400)室溫暗處孵育2 h。洗滌后，用激光共聚焦熒光顯微鏡對(duì)切片進(jìn)行成像，計(jì)數(shù)TH陽(yáng)性神經(jīng)元數(shù)。

1.7 紋狀體多巴胺水平分離小鼠兩側(cè)紋狀體，在超聲波破碎均質(zhì)化，4 ℃離心10 000g×10 min。分離上清液(10 μL)并注入裝有電化學(xué)檢測(cè)器的高效液相色譜系統(tǒng)(Milford、MA，美國(guó))，以0.8 mL/min流速測(cè)量多巴胺含量。

1.8 實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)(qRT-PCR)小鼠于第7天和第14天處死，取黑質(zhì)組織并置于無(wú)RNase離心管，存儲(chǔ)在-80 ℃。采用Trizol試劑提取總RNA 并用Superscript III酶逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。靶基因的mRNA的表達(dá)用SYBR Green PCR試劑盒 (TaKaRa,日本)和Real-time PCR 系統(tǒng) (Applied Biosystems,美國(guó))。PCR反應(yīng)條件如下：95 ℃ 5 min，60 ℃ 20 s，40個(gè)擴(kuò)增循環(huán)。管家基因β-actin作為內(nèi)對(duì)照。PCR引物序列：Nrf2，正向：5’-TCTTGGAGTAAGTCGAGAAGTGT-3’；反向：5’-GTTGAAACTGAGCGAAAAAGGC-3’。γ-GCLC，正向：5’-GGGGTGACGAGGTGGAGTA-3”；反向：5’-GTTGGGGTTTGTCCTCTCCC-3’。HO-1，正向：5’-AAGCCGAGAATGCTGAGTTCA-3’；反向：5’-GCCGTGTAGATATGGTACAAGGA-3’。NQO1，正向：5’-ATGGGAGGTGGTCGAATCTGA-3’；反向：5’-GCCTTCCTTATACGCCAGAGATG-3’。

1.9 免疫印跡(Western blot)小鼠于第7天和第14天處死，取黑質(zhì)組織用RIPA裂解液和蛋白酶抑制劑處理30 min。蛋白質(zhì)樣品(50 μg)由8%的SDS-PAGE分離并轉(zhuǎn)移到PVDF膜，并用5%脫脂牛奶封閉抗原。膜與兔抗小鼠Nrf2抗體(1∶200)4℃孵育過夜。0.1%TBST洗滌3次后，該膜與辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的羊抗兔第二抗體(1∶10 000)在室溫下孵育1 h?？乖贵w復(fù)合物用增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法(ECL Amersham生命科學(xué)、英國(guó))檢測(cè)。

1.10 氧化應(yīng)激活性評(píng)估取小鼠中腦組織并制備勻漿，通過4 ℃離心10 000g×10 min分離上清液。用分光光度法測(cè)定試劑盒(南京建成生物工程研究所，南京，中國(guó))測(cè)量氧化應(yīng)激蛋白含量。用酶標(biāo)儀(ricso rk201，深圳瑞科索科技有限公司，深圳，中國(guó))測(cè)定超氧化物歧化酶，(SOD，560 nm吸光度)，過氧化氫酶(CAT，405 nm)，還原型谷胱甘肽(GSH，420 nm)和丙二醛(MDA，532 nm)。

1.11 免疫組織化學(xué)染色小鼠以4%水合氯醛麻醉，取海馬組織4%多聚甲醛固定過夜。脫水后，海馬組織用石蠟包埋制作連續(xù)切片(5 μm厚)。切片進(jìn)行脫蠟脫水，用3%過氧化氫孵育滅活內(nèi)源過氧化物酶。切片3% BSA處理1 h，然后用兔抗小鼠IL-1β(1∶100)4℃孵育過夜。PBS洗兩次后，切片用山羊抗兔IgG抗體(生物素化酶-1∶100)在室溫下孵育2 h，用二氨基聯(lián)苯胺(DAB)著色，并用蘇木精復(fù)染。Olympus BX51顯微鏡(奧林巴斯公司，日本)觀察并計(jì)數(shù)IL-1β陽(yáng)性神經(jīng)元，選擇隨機(jī)5個(gè)視野計(jì)數(shù)計(jì)算細(xì)胞密度(細(xì)胞數(shù)/HP)。

1.12 血清細(xì)胞因子分析術(shù)后14 d取小鼠海馬和血清標(biāo)本。通過4 ℃離心10 000g×10 min分離制備海馬勻漿上清液和血清，樣本存儲(chǔ)在-80 ℃。用ELISA法檢測(cè)IL-1β、IL-6和TNF-α水平(R&D Systems公司，美國(guó))，用酶標(biāo)儀測(cè)量450 nm處的光密度(OD)值。至少重復(fù)試驗(yàn)3次。

2 結(jié)果

2.1 尿酸改善MPTP誘導(dǎo)的行為和認(rèn)知功能障礙我們首先研究尿酸對(duì)PD小鼠運(yùn)動(dòng)功能的影響。尿酸處理(250 mg/kg)延長(zhǎng)MPTP小鼠的跌落潛伏期，縮短爬下時(shí)間(圖1A，1B)。這些結(jié)果表明尿酸對(duì)MPTP誘導(dǎo)的運(yùn)動(dòng)平衡缺陷有改善作用。

我們還進(jìn)行了Morris水迷宮試驗(yàn)評(píng)價(jià)PD小鼠的認(rèn)知功能。尿酸縮短了小鼠逃避潛伏期，增加穿越平臺(tái)次數(shù)(P<0.05)(圖1C，1D)。這表明MPTP對(duì)小鼠的空間學(xué)習(xí)和記憶有明顯的損害，但尿酸處理可減輕這種損傷。

2.2 尿酸MPTP誘導(dǎo)的PD小鼠具有神經(jīng)保護(hù)作用我們應(yīng)用免疫熒光染色來觀察MPTP小鼠多巴胺能神經(jīng)元。熒光圖顯示了對(duì)照組、MPTP組和尿酸組黑質(zhì)區(qū)TH陽(yáng)性神經(jīng)元(圖2A、B、C)。定量數(shù)據(jù)表明，與對(duì)照組相比，MPTP小鼠TH陽(yáng)性神經(jīng)元減少，這種減少能被尿酸處理部分緩解(圖2D)。我們還測(cè)量了紋狀體多巴胺含量。與對(duì)照組相比，MPTP小鼠紋狀體多巴胺含量顯著下降。尿酸增加MPTP處理小鼠的多巴胺含量(圖2E)。這些數(shù)據(jù)表明尿酸對(duì)PD小鼠多巴胺能神經(jīng)元具有有效的神經(jīng)保護(hù)作用。

2.3 尿酸激活Nrf2-ARE通路并抑制氧化應(yīng)激我們進(jìn)行熒光定量PCR檢測(cè)抗氧化分子Nrf2的mRNA表達(dá)。與對(duì)照組相比，MPTP小鼠黑質(zhì)Nrf2 mRNA水平明顯下降，而尿酸顯著增加Nrf2的轉(zhuǎn)錄表達(dá)(圖3A)。此外，相比尿酸處理第7 天，第14天小鼠的Nrf2的mRNA水平明顯更高。然后我們分析了Nrf2的靶基因mRNA的表達(dá)。和MPTP組相比，尿酸處理7 d和14 d均顯著上調(diào)γ-GCLC、HO-1和NQO1的mRNA表達(dá)(圖3B、C、D)。

為了進(jìn)一步研究尿酸對(duì)氧化應(yīng)激的影響，我們測(cè)定了PD小鼠中腦組織的氧化應(yīng)激蛋白含量。MPTP小鼠SOD、CAT和GSH含量顯著降低，提示MPTP可能破壞中腦抗氧化防御系統(tǒng)。然而尿酸處理顯著升高SOD、CAT和GSH含量(圖4A、B、C)。MPTP升高小鼠中腦MDA含量，而尿酸降低MDA含量(圖4D)。綜上所述，尿酸對(duì)MPTP誘導(dǎo)的PD小鼠的中腦組織具有抗氧化作用。

2.4 尿酸抑制神經(jīng)炎癥反應(yīng)并降低炎性細(xì)胞因子表達(dá)為了探討尿酸對(duì)PD小鼠炎癥反應(yīng)的影響，我們測(cè)量了小鼠海馬IL-1β蛋白的表達(dá)。免疫組化顯示了對(duì)照組、MPTP組和尿酸組海馬區(qū)IL-1β陽(yáng)性神經(jīng)元(圖5A、B、C)。定量分析表明，與對(duì)照組小鼠相比，MPTP小鼠IL-1β陽(yáng)性神經(jīng)元數(shù)量明顯升高，尿酸顯著降低IL-1β陽(yáng)性神經(jīng)元數(shù)目(P<0.05)(圖5D)。這些結(jié)果表明，尿酸能有效抑制MPTP誘導(dǎo)的神經(jīng)炎癥反應(yīng)。

為了探討尿酸對(duì)PD小鼠系統(tǒng)性炎癥反應(yīng)的影響，我們測(cè)定了尿酸處理MPTP小鼠海馬和血清中炎性細(xì)胞因子的水平。MPTP誘導(dǎo)海馬和血清IL-1β、IL-6和TNF-α水平顯著升高，但被尿酸處理所顯著抑制(P<0.05)(圖5E、F、G)。這表明，尿酸可能抑制PD小鼠產(chǎn)生產(chǎn)促炎癥細(xì)胞因子，并可能與減輕腦損傷有關(guān)。

3 討論

本研究表明，尿酸能顯著減輕MPTP誘導(dǎo)的PD小鼠的行為和認(rèn)知功能障礙，降低黑質(zhì)區(qū)TH陽(yáng)性神經(jīng)元數(shù)目和紋狀體多巴胺含量。尿酸激活Nrf2-ARE通路，增強(qiáng)PD小鼠黑質(zhì)Nrf2 mRNA和下游靶基因γ-GCLC、HO-1和NQO1的轉(zhuǎn)錄。尿酸對(duì)氧化應(yīng)激有抑制作用，增加中腦SOD、CAT和GSH含量，降低MDA含量。尿酸降低海馬區(qū)IL-1β陽(yáng)性神經(jīng)元數(shù)，降低海馬和血清IL-1β、IL-6和TNF-α水平。這些數(shù)據(jù)提供了明確的證據(jù)表明尿酸對(duì)PD小鼠多巴胺能神經(jīng)元具有有效的神經(jīng)保護(hù)作用。此外，這種保護(hù)作用可能與Nrf2-ARE通路激活，抑制氧化應(yīng)激及炎癥反應(yīng)有關(guān)。

注：與對(duì)照組相比aP<0.05；與MPTP組相比，bP<0.05圖1 尿酸改善PD小鼠運(yùn)動(dòng)和認(rèn)知功能：尿酸明顯延長(zhǎng)跌落潛伏期(A)，縮短爬下時(shí)間(B)。Morris水迷宮測(cè)試顯示與MPTP組相比，尿酸處理顯著降低逃避潛伏期(C)，增加穿越平臺(tái)數(shù)(D)

注：與對(duì)照組相比，aP<0.05；與MPTP組相比，bP<0.05圖3 尿酸激活Nrf2-ARE信號(hào)通路。尿酸顯著增加MPTP小鼠Nrf2 mRNA的表達(dá)水平(d7,d14)(A)，以及增加Nrf2應(yīng)答基因γ-GCLC(B)，HO-1(C)和NQO1(D)的mRNA表達(dá)水平

注：與對(duì)照組相比，aP<0.05；與MPTP組相比，bP<0.05圖4 尿酸抑制MPTP小鼠氧化應(yīng)激：與對(duì)照組相比，MPTP小鼠的中腦SOD(A)、CAT(B)和谷胱甘肽(C)水平降低，MDA含量升高。尿酸處理可顯著提高M(jìn)PTP小鼠SOD、CAT和GSH含量，降低MDA含量

尿酸是核酸降解產(chǎn)物，與健康對(duì)照組相比，PD病人血清和黑質(zhì)中尿酸含量明顯降低[6-7]。低尿酸血癥與PD病人的認(rèn)知功能障礙有關(guān)[8]。因此，提高血清尿酸水平可能對(duì)PD動(dòng)物和病人有神經(jīng)保護(hù)作用。我們以往的研究表明，尿酸鹽抑制6-OHDA誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞氧化損傷[9]。本研究則提供了尿酸對(duì)PD神經(jīng)保護(hù)的體內(nèi)證據(jù)。尿酸不僅改善行為和認(rèn)知障礙，還能保護(hù)多巴胺能神經(jīng)元，表現(xiàn)為黑質(zhì)TH陽(yáng)性神經(jīng)元數(shù)增多和紋狀體多巴胺含量增加。本研究中尿酸處理采用腹腔注射(250 mg/kg)的方法。而我們以前的研究表明，腹腔注射尿酸鹽能提高PD大鼠血漿(55%)和紋狀體(36.8%)尿酸鹽含量[10]。這表明尿酸可以穿過血腦屏障，是PD的一種很有前途的治療策略。

本研究表明，尿酸能在MPTP小鼠黑質(zhì)激活Nrf2信號(hào)通路。Nrf2是一種轉(zhuǎn)錄因子，氧化應(yīng)激時(shí)能結(jié)合抗氧化反應(yīng)元件(ARE)并啟動(dòng)幾百種氧化應(yīng)激相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄。Nrf2-ARE抗氧化通路異常參與了PD的發(fā)病[11]。我們的結(jié)果顯示尿酸增強(qiáng)轉(zhuǎn)錄的Nrf2靶基因包括γ-GCLC、HO-1和NQO-1，這些基因都具有抗氧化功能。我們以前的研究在體外培養(yǎng)的細(xì)胞系證明了尿酸的抗氧化功能：體外尿酸鹽預(yù)處理能在6-OHDA誘導(dǎo)的多巴胺能細(xì)胞激活Nrf2-ARE信號(hào)通路[12]。綜上所述，尿酸抑制MPTP小鼠氧化應(yīng)激反應(yīng)，可能是通過激活Nrf2-ARE抗氧化通路實(shí)現(xiàn)的。

本研究還表明，尿酸能有效抑制MPTP小鼠的神經(jīng)炎癥反應(yīng)，如海馬區(qū)IL-1β陽(yáng)性神經(jīng)元數(shù)量顯著減少。海馬位于顳葉，與學(xué)習(xí)記憶功能相關(guān)。MPTP誘導(dǎo)的PD小鼠顯示海馬細(xì)胞凋亡和短時(shí)記憶減弱[13]，這與PD病人的認(rèn)知功能降低是一致的[14]。此外，海馬區(qū)高表達(dá)IL-1β能損害小鼠的空間記憶能力[15]，這證實(shí)了本實(shí)驗(yàn)中尿酸降低PD小鼠海馬區(qū)IL-1β表達(dá)，同時(shí)改善了空間記憶能力。神經(jīng)炎癥反應(yīng)不僅參與了PD的發(fā)病機(jī)制，還能促進(jìn)各種炎性細(xì)胞因子釋放入循環(huán)，如IL-1β，IL-6和TNF-α[16]，這是與我們的結(jié)果一致。因此，尿酸可能通過血腦屏障直接靶向腦組織，尤其是黑質(zhì)和海馬，從而對(duì)PD小鼠發(fā)揮抗炎作用。

總之，本研究證實(shí)尿酸對(duì)帕金森小鼠多巴胺能神經(jīng)元具有顯著的神經(jīng)保護(hù)作用。尿酸對(duì)運(yùn)動(dòng)和認(rèn)知功能的改善，可能與激活Nrf2-ARE通路，抑制氧化損傷和炎癥反應(yīng)有關(guān)。尿酸可能是PD的一種很有前途的治療劑。

(本文圖2,5見插圖7-2)