右旋美托咪啶對驚厥性癲癇持續(xù)狀態(tài)大鼠認(rèn)知功能和神經(jīng)炎癥的影響

韓耀國，張濤，葉明榮，陳剛，姚玉龍，許開亮，孫躍喜，雷鳴

作者單位：上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬第七人民醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科，上海 200137

癲癇持續(xù)狀態(tài)(status epilepticus,SE)是一種常見的神經(jīng)系統(tǒng)疾病，可分為驚厥性(convulsive status epilepticus,CSE)和非驚厥性(nonconvulsive status epilepticus,NSE)。CSE表現(xiàn)為有規(guī)則的胳膊和腿的交替收縮和伸展。CSE可導(dǎo)致海馬神經(jīng)元的喪失[1]。由于嚴(yán)重的腦損傷，一些CSE病人表現(xiàn)出認(rèn)知功能障礙、抑郁、焦慮和其他精神癥狀，嚴(yán)重降低了病人的生活質(zhì)量[2]。CSE也可以誘導(dǎo)神經(jīng)炎癥反應(yīng)并參與其發(fā)病機(jī)制[3]。因此，抗炎治療已經(jīng)顯示出預(yù)防和治療癲癇發(fā)作的希望[4]。

右旋美托咪啶(dexmedetomidine,DEX)是一種有效的α2-腎上腺素能(a2A)特異性激動劑，具有鎮(zhèn)靜和鎮(zhèn)痛作用，維持血流動力學(xué)穩(wěn)定，減少麻醉相關(guān)并發(fā)癥的發(fā)生[5]。DEX具有抗炎癥特性，從而促進(jìn)腦缺血后的神經(jīng)保護(hù)作用[6]。DEX的神經(jīng)炎癥抑制作用是通過激活α7-煙堿乙酰膽堿受體(α7-nAChR)誘導(dǎo)的[7]。DEX改善認(rèn)知功能的一個重要作用部位是海馬，一個對于學(xué)習(xí)和記憶功能至關(guān)重要的腦區(qū)[8]。然而，目前DEX對CSE 的抗驚厥作用的機(jī)制尚未完全闡明。

在本研究中，我們自2017年1—7月建立了CSE大鼠模型，并用DEX進(jìn)行預(yù)處理。觀察大鼠的認(rèn)知功能，癲癇發(fā)作嚴(yán)重程度和電生理指標(biāo)。測量海馬組織膽堿能抗炎通路的相關(guān)蛋白，以闡明DEX的機(jī)制，并尋找CSE病人的治療靶點。

1 材料和方法

1.1 動物選擇和分組研究對象為成年雄性Sprague-Dawley大鼠，年齡10周，體質(zhì)量(200±20)g，由SLRC實驗動物中心(中國上海)提供，飼養(yǎng)于20～24 ℃和40%～70%的濕度條件下。應(yīng)用隨機(jī)數(shù)字表法將動物分為對照組，CSE組和DEX組，每組30只。DEX組大鼠腹膜內(nèi)注射右旋美托咪啶(100 μg/kg，1次/天，恒瑞制藥有限公司，批號130621)。DEX給藥總時間為8 d，包括CSE誘導(dǎo)前3 d，CSE誘導(dǎo)后5 d。動物研究符合一般動物實驗倫理學(xué)原則。本研究中對于大鼠的處理符合動物倫理學(xué)相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)。

1.2 建立CSE模型每只大鼠腹膜內(nèi)注射氯化鋰(3 mEq/kg)，18～20 h后腹膜內(nèi)注射毛果蕓香堿(30 mg/kg)。如果沒有發(fā)生驚厥，則另外注射毛果蕓香堿(約為原始劑量的約1/4)。根據(jù)Simialowski方法評估大鼠的驚厥，并將其分為0～5級。具有IV和V驚厥水平的大鼠表示廣泛性抽搐，用以本研究的實驗。對照組大鼠用等體積的0.9%鹽水替代氯化鋰和毛果蕓香堿。

1.3 癲癇嚴(yán)重度測量CSE誘導(dǎo)后立即監(jiān)測大鼠的癲癇發(fā)作活動120 min，用修訂版Racine評分(MRS)評估癲癇發(fā)作嚴(yán)重程度：1～2級：面部陣攣和頭部點頭；3級：單側(cè)前肢陣攣；4級：豎起和雙側(cè)前肢陣攣；5級：豎起和倒下；6級：抽搐發(fā)作；7級：后肢伸展。

1.4 Morris水迷宮試驗應(yīng)用Morris水迷宮試驗測量大鼠CSE誘導(dǎo)后1、3和5 d時的空間記憶能力。一個透明平臺放置在水迷宮池四個象限中的1/2個半徑內(nèi)，水面高于平臺頂部1 cm。將大鼠放在水迷宮池中遠(yuǎn)離平臺的象限，并引導(dǎo)其找到并爬上平臺，并將該持續(xù)時間記錄為逃避潛伏期(最大60 s)。然后將平臺從池中取出，將大鼠置于前一測試對面象限的水中。觀察游泳路徑60 s，并將大鼠越過原來平臺位置的次數(shù)記錄為穿越平臺次數(shù)。

1.5 LTP的電生理記錄CSE誘導(dǎo)后第5天，用1.2%異氟烷麻醉大鼠，提取大腦，置于含氧切片液(0～4 ℃)中1～2 min。制備海馬切片，并在35 ℃下在記錄溶液中放置30～45 min，連續(xù)灌注氧合記錄溶液(1.5 mL/min，35 ℃)。將單極記錄電極插入CA1錐體細(xì)胞的海馬區(qū)，應(yīng)用高頻刺激(high frequency stimulation,HFS;10列，400 Hz)誘導(dǎo)，在HFS之后每5 min記錄一次細(xì)胞外群體峰電位振幅(population spike amplitude,PSA)，持續(xù)120 min，作為場興奮性突觸后電位(field excitatory postsynaptic potential,fEPSP)。

1.6 免疫組織化學(xué)檢測海馬α7-nAChR表達(dá)CSE誘導(dǎo)后第5天，用1.2%異氟烷麻醉大鼠，取海馬組織用4%多聚甲醛固定、脫水、石蠟包埋，以制備連續(xù)切片(5 μm厚)。切片與兔抗小鼠α7-nAChR(1∶100)孵育4 ℃過夜，PBS洗2次后與生物素化 HRP-IgG(1∶100，第二抗體)在室溫下孵育2 h。切片用二氨基聯(lián)苯胺(DAB)著色，并用蘇木精復(fù)染。在Olympus BX51顯微鏡(日本奧林巴斯公司)下觀察并計數(shù)α7-nAChR陽性神經(jīng)元(褐色細(xì)胞)，然后將5個視野的總計數(shù)轉(zhuǎn)化為細(xì)胞密度(細(xì)胞/HP)。

1.7 海馬細(xì)胞因子分析CSE誘導(dǎo)后1、3、5 d大鼠麻醉，取海馬組織制備勻漿。通過4 ℃離心10 000g×10 min分離上清液，使用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)試劑盒測定IL-1β、TNF-α、S-100β和BDNF水平。通過酶標(biāo)儀(Ricso RK201，深圳瑞科索科技有限公司)測量450 nm處的光密度(OD)獲得數(shù)據(jù)。

2 結(jié)果

2.1 DEX對CSE大鼠認(rèn)知、癲癇嚴(yán)重程度和LTP的影響Morris水迷宮試驗顯示：與CSE組相比，DEX組在3 d和5 d的逃避潛伏期顯著縮短(P<0.05)(圖1A)，穿越平臺次數(shù)顯著增加(P<0.05)(圖1B)。表明DEX能顯示改善CSE大鼠的空間記憶能力。

我們通過評估CSE誘導(dǎo)后120 min的癲癇指數(shù)，探索DEX是否影響CSE大鼠的癲癇發(fā)作嚴(yán)重程度。與CSE大鼠相比，DEX大鼠在誘導(dǎo)后40、60、80、100和120 min時癲癇發(fā)作明顯降低(P<0.05)(圖1C)。這表明DEX在CSE大鼠中顯示了抗驚厥作用。

為了研究DEX對突觸傳遞的影響，于CSE誘導(dǎo)后第5天制備海馬切片，應(yīng)用高頻刺激(HFS)測量LTP。HFS誘導(dǎo)5 min后LTP急劇增加至基線的2.8倍左右，然后緩慢下降。與對照組比較，CSE大鼠fEPSP斜率較低。DEX能增加CSE大鼠大多數(shù)時間點的fEPSP斜率(圖1D)。這表明DEX能增強(qiáng)CSE大鼠HFS后的LTP。和CSE組相比，DEX顯著升高HFS誘導(dǎo)后30、60和90 min的fEPSPS 振幅(P<0.05)(圖1E)。

注：fEPSP幅度歸一化為相對于基線fEPSP的比值。與對照組相比，aP<0.05；與CSE組相比，bP<0.05圖1 DEX對CSE大鼠認(rèn)知功能障礙、發(fā)作嚴(yán)重程度和LTP的影響：與CSE大鼠相比，DEX預(yù)處理(100 μg/kg，1次/天)顯著降低逃避潛伏期時間(A)，增加平臺交叉數(shù)在癲癇發(fā)作后比較CSE組和DEX組大鼠的癲癇發(fā)作評分，每20分鐘記錄一次評分大鼠HFS前后LTP誘導(dǎo)的時程和程度。(E)HFS誘導(dǎo)后30、60和90 min的平均fEPSP幅度

注：與CSE組相比，bP<0.05圖2 DEX增加CSE大鼠海馬中α7-nAChR陽性神經(jīng)元表達(dá)：免疫組織化學(xué)顯示CSE誘導(dǎo)后第5天對照組(A)、CSE組(B)和DEX組大鼠海馬的α7-nAChR陽性神經(jīng)元(C)(×200)。定量數(shù)據(jù)顯示，DEX顯著增加α7-nAChR陽性神經(jīng)元的細(xì)胞密度

注：相對于CSE組，aP<0.05圖3 DEX對CSE大鼠海馬組織細(xì)胞因子水平的影響：在CSE誘導(dǎo)后第1、3和5天，ELISA測量大鼠海馬組織勻漿IL-1β、TNF-α、S-100β和BDNF蛋白水平。DEX降低海馬IL-1β(A)，TNF-α(B)，S-100β(C)水平，增加BDNF(D)水平

2.2 DEX對CSE大鼠海馬中α7-nAChR陽性神經(jīng)元的影響免疫組化顯示數(shù)量與對照組相比，CSE大鼠海馬組織α7-nAChR陽性神經(jīng)元數(shù)目明顯低于對照組(P<0.05)。與CSE大鼠相比，DEX組的α7-nAChR陽性神經(jīng)元數(shù)量顯著增多(P<0.05)(圖2)。這表明DEX可以增加CSE大鼠海馬中的α7-nAChR表達(dá)。

2.3 DEX對CSE大鼠海馬細(xì)胞因子水平的影響

和CSE組相比，DEX顯著降低CSE大鼠海馬IL-1β、TNF-α和S-100β水平(P<0.05)(圖3A，3B，3C)，顯著升高CSE大鼠海馬BDNF水平(P<0.05)(圖3D)。這表明DEX可以抑制海馬組織生成促炎癥細(xì)胞因子，減少腦損傷，并改善神經(jīng)再生的微環(huán)境。

2.4 α7-nAChR參與DEX對CSE大鼠的抗癲癇作用為了探討α7-nAChR在DEX對CSE大鼠抗驚厥中的作用，我們用DEX，尼古丁(0.5 mg/kg，)皮下注射或DEX +α-BGT(1.0 μg/kg)靜脈注射預(yù)處理CSE大鼠。與CSE大鼠相比，DEX和尼古丁預(yù)處理組均顯著降低CSE誘導(dǎo)后120 min的癲癇發(fā)作評分，DEX降低癲癇發(fā)作評分的作用能被α-BGT減弱(P<0.05)。此外，DEX增加LTP的作用可以被α-BGT預(yù)處理逆轉(zhuǎn)(P<0.05)(圖4)。

注：相對于CSE組，aP<0.05;相對于DEX組，bP<0.05圖4 DEX對CSE大鼠的作用依賴于α7-nAChR:CSE大鼠用DEX、尼古丁、DEX+α-BGT(1.0 μg/kg)靜脈注射預(yù)處理。(A)與CSE大鼠相比，DEX和尼古丁顯著降低了癲癇發(fā)作。α-BGT預(yù)處理減弱DEX的抗癲癇作用。(B)DEX和尼古丁顯著增加CSE大鼠的LTP。DEX對LTP的作用可以通過α-BGT預(yù)處理逆轉(zhuǎn)

3 討論

在本研究中，我們應(yīng)用腹膜內(nèi)注射氯化鋰和毛果蕓香堿建立CES大鼠模型，并探索了右旋美托咪啶(DEX)的抗癲癇作用和機(jī)制。研究結(jié)果表明，DEX改善了CSE大鼠的認(rèn)知功能，減輕CSE大鼠癲癇發(fā)作，增強(qiáng)LTP，延長其持續(xù)時間，表明DEX具有抗驚厥作用。DEX顯著增加CSE大鼠海馬中α7-nAChR陽性神經(jīng)元數(shù)量，降低海馬組織IL-1β、TNF-α、S-100β蛋白水平，升高BDNF水平。此外，DEX對癲癇嚴(yán)重程度和LTP的作用依賴于α7-nAChR途徑，因為尼古丁(α7-nAChR激活劑)預(yù)處理具有和DEX類似的作用，α-BGT(α7-nAChR抑制劑)可以逆轉(zhuǎn)DEX的作用。

認(rèn)知缺陷是CSE的常見癥狀，也加重了癲癇活動[2]。這表明能改善認(rèn)知功能的藥物也可能減輕癲癇發(fā)作嚴(yán)重程度。DEX降低了手術(shù)或ICU期間病人認(rèn)知功能障礙的風(fēng)險[9]。我們的結(jié)果顯示了DEX在癲癇發(fā)作動物模型中的認(rèn)知改善功能。DEX預(yù)處理也顯示了抗驚厥作用，表現(xiàn)為CSE大鼠癲癇發(fā)作評分下降。DEX能提高麻醉劑利多卡因的中毒劑量閾值，從而延遲了利多卡因誘發(fā)的驚厥的發(fā)生[10]。在我們的CSE模型中，DEX也可能增強(qiáng)了毛果蕓香堿的中毒劑量閾值。DEX可能是CSE的潛在治療劑。

長時程增強(qiáng)增強(qiáng)(LTP)是基于近期活動的突觸持續(xù)強(qiáng)化，從而在兩個神經(jīng)元之間產(chǎn)生長期增強(qiáng)的信號傳輸，其主要表現(xiàn)為fEPSP的增強(qiáng)。海馬中LTP的抑制可能會損害學(xué)習(xí)和記憶能力[11]。在本研究中也觀察到，由氯化鋰和毛果蕓香堿誘導(dǎo)的癲癇大鼠海馬切片中的LTP誘導(dǎo)減少[12]，這種降低的LTP可能與認(rèn)知功能障礙和發(fā)作嚴(yán)重程度相關(guān)。DEX能逆轉(zhuǎn)CSE誘導(dǎo)的海馬LTP下降，這表明其具有神經(jīng)保護(hù)和抗癲癇效應(yīng)，如其他報道所示[13]。我們的結(jié)果與其他報道相反，DEX抑制了麻醉嚙齒動物的海馬LTP，從而誘導(dǎo)鎮(zhèn)靜作用[14-15]。這種差異可能在于海馬組織的種類。在正常海馬切片中，低濃度DEX灌注(1和10 μmol/L)下LTP無變化，但在較高濃度DEX灌注(100 μmol/L)下LTP顯著降低。然而，在經(jīng)受氧-葡萄糖剝奪(OGD)的海馬切片中的LTP降低，而DEX能促進(jìn)LTP的恢復(fù)[16]。這表明DEX可以抑制正常的海馬LTP(麻醉的嚙齒動物)，并增強(qiáng)患病動物的海馬LTP，如OGD和CSE大鼠所見。這種差異可能在于DEX在正常和患病海馬中所激活的不同信號傳導(dǎo)途徑。

DEX增加CSE大鼠海馬中α7-nAChR蛋白的表達(dá)，這表明DEX可激活膽堿能抗炎通路，如脛骨骨折大鼠[7]和敗血癥小鼠[17]所支持的。在毛果蕓香堿誘導(dǎo)的癲癇持續(xù)狀態(tài)小鼠中，海馬組織的乙酰膽堿酯酶(AChE)表達(dá)上調(diào)，促進(jìn)癲癇發(fā)生過程[18]。上調(diào)的AChE能導(dǎo)致乙酰膽堿(ACh)水平降低和膽堿能通路減弱。相反，α7-nAChR激動劑改善了學(xué)習(xí)和記憶能力，減輕了小鼠和大鼠的癲癇發(fā)作[19]。α7-nAChR的活化也抑制炎癥細(xì)胞因子的表達(dá)和釋放，這支持我們的結(jié)果，如DEX降低 CSE大鼠的海馬組織IL-1β和TNF-α水平。IL-1β和TNF-α常見的促炎癥細(xì)胞因子，癲癇發(fā)作后L-1β和TNF-α在海馬組織的表達(dá)持續(xù)上調(diào)，提示癲癇發(fā)作可能誘發(fā)炎癥反應(yīng)[20]。膽堿能途徑也可能對LTP產(chǎn)生積極影響。α7-nAChRs基因敲除(KO)小鼠在海馬CA3-CA1突觸中表現(xiàn)出受損的LTP，而IL-1β降低了海馬CA3-CA1的突觸可塑性和LTP[22]。這解釋了為什么在我們的結(jié)果中DEX也能增強(qiáng)CSE大鼠的LTP。此外，在我們的研究中，DEX在CSE誘導(dǎo)前3天施用，而其它文獻(xiàn)中DEX給藥時間在麻醉嚙齒動物進(jìn)行LTP測量之前20 min[14-15]。這可能給予足夠的時間上調(diào)海馬α7-nAChRs表達(dá)，從而增加對LTP誘導(dǎo)的敏感性。在我們的研究中，DEX還降低了CSE大鼠海馬S-100β水平，升高了BDNF水平。S-100β是腦中酸性Ca2+結(jié)合蛋白，腦損傷后可釋放到體液中。與健康受試者相比，癲癇病人血清和腦脊液S-100β蛋白水平較高，表明癲癇腦損傷[23]。BDNF是涉及神經(jīng)元存活和突觸可塑性的生長因子，在學(xué)習(xí)和記憶功能中起關(guān)鍵作用。大鼠癲癇發(fā)作腦損傷能降低血清BDNF水平[24]。因此，我們的研究結(jié)果表明，DEX可以減輕神經(jīng)元損傷，促進(jìn)CSE大鼠神經(jīng)再生。

總之，DEX可以顯著改善CSE大鼠的認(rèn)知功能障礙，發(fā)作嚴(yán)重程度和LTP。DEX激活膽堿能抗炎癥通路，抑制炎性細(xì)胞因子釋放并顯示出神經(jīng)保護(hù)作用。DEX抑制癲癇發(fā)作嚴(yán)重程度和增強(qiáng)LTP依賴于α7-nAChR。我們的研究結(jié)果表明DEX是一種CSE和其他癲癇發(fā)作的潛在治療藥物。