大孔樹(shù)脂純化苜蓿葉蛋白肽的工藝優(yōu)化

許英一 - 吳紅艷 - 王 宇 王 彪

(1. 齊齊哈爾大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，黑龍江 齊齊哈爾 161006；2. 黑龍江省農(nóng)科院畜牧獸醫(yī)分院，黑龍江 齊齊哈爾 161005)

紫花苜蓿(medicagosativa)是一種多年生的優(yōu)良豆科牧草，有“牧草之王”的美稱(chēng)，是國(guó)內(nèi)外主要栽培的牧草之一[1-3]。苜蓿葉蛋白的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高，粗蛋白含量高達(dá)50%～60%，并且氨基酸組成配比合理[4]，據(jù)文獻(xiàn)[5]報(bào)道許多氨基酸及其衍生物具有抗氧化能力，如半胱氨酸、組氨酸、色氨酸、賴(lài)氨酸、精氨酸等，可作為優(yōu)良的蛋白原添加于飲料、焙烤等食品中。但由于苜蓿葉蛋白溶解性等功能性質(zhì)較差，限制了其在食品中的應(yīng)用。研究[6-8]表明，蛋白肽具有抗氧化、降血壓、調(diào)節(jié)血清中血脂水平、抗癌、提高免疫等功能。謝正軍等[9]通過(guò)提取、酶解和超濾從苜蓿葉蛋白中分離得到了相對(duì)分子質(zhì)量不同的可溶性苜蓿葉蛋白及其酶解粗肽和精制肽，比較了其抗氧化活性，發(fā)現(xiàn)苜蓿葉蛋白幾乎沒(méi)有抗氧化活性，而酶解后的粗肽以及超濾后的精制肽均表現(xiàn)出較強(qiáng)的抗氧化活性，而且精制肽的抗氧化活性強(qiáng)于粗肽。因此，將酶解后的粗肽純化后更適合應(yīng)用于食品工業(yè)。

近年來(lái)，大孔樹(shù)脂被廣泛應(yīng)用于多酚、生物堿、二氫槲皮素、皂苷等活性成分的分離純化[10-11]。馬寒冰等[12]進(jìn)行了不同型號(hào)的大孔吸附樹(shù)脂的靜態(tài)吸附和解吸試驗(yàn)，確定DA201-C型大孔吸附樹(shù)脂對(duì)大豆多肽的吸附性能及脫鹽效果最佳，多肽含量提高了70.35%、糖和鹽含量分別降低了70.80%和93.93%。李華等[13]采用超濾與大孔樹(shù)脂吸附、乙醇分級(jí)洗脫分離純化抗氧化黑豆肽，確定DA201-C型樹(shù)脂對(duì)抗氧化肽的分離效果優(yōu)于其他3 種樹(shù)脂，體積分?jǐn)?shù)為75% 乙醇洗脫組分具有相對(duì)最強(qiáng)的ORAC 值。綜上，前人對(duì)豆科肽類(lèi)的純化研究較多，純化效果也較好。但對(duì)苜蓿葉蛋白肽的制備及純化研究較少。謝正軍[14]研究了苜蓿葉蛋白酶解物超濾和脫鹽工藝，采用先超濾再經(jīng)大孔吸附樹(shù)脂脫鹽后，苜蓿葉蛋白酶解物的蛋白質(zhì)含量?jī)H提高了1.73%。為簡(jiǎn)化純化步驟，本研究擬采用不經(jīng)超濾僅用大孔吸附樹(shù)脂脫鹽工藝純化苜蓿葉蛋白肽，并對(duì)苜蓿葉蛋白肽的純化工藝進(jìn)行優(yōu)化，為植物葉蛋白肽類(lèi)化合物進(jìn)一步分離純化提供試驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

紫花苜蓿：黑龍江省農(nóng)科院畜牧獸醫(yī)分院；

大孔樹(shù)脂：DA201-C型，鄭州華溢科技新材料股份有限公司；

大孔樹(shù)脂：D101、HPD 500、HPD 600型，河北滄州寶恩化工有限公司；

大孔樹(shù)脂：AB-8、X-5型，南開(kāi)大學(xué)化工廠；

其他化學(xué)試劑：分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.1.2 主要儀器設(shè)備

高速藥物粉碎機(jī)：WK-600A型，青州市精誠(chéng)機(jī)械有限公司；

分光光度計(jì)：722N型，上海精密科學(xué)儀器有限公司；

高速冷凍離心機(jī)：日立CR21G型，天美(中國(guó))科學(xué)儀器有限公司；

電熱恒溫水浴鍋：HHS21-4型，上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠；

恒流泵：HL-2S型，上海青浦滬西儀器廠；

電腦全自動(dòng)部份收集器：DBS-100型，上海滬西分析儀器廠有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 苜蓿葉蛋白肽的酶法水解制備工藝

苜蓿葉蛋白粉→配制一定底物濃度(g/mL)的水溶液→預(yù)熱(50 ℃，30 min)→調(diào)節(jié)pH 8.5→加入一定量的堿性蛋白酶Alcalase 2.4 L→置于恒溫水浴振蕩器(120 r/min，50 ℃)酶解2 h→滅酶(沸水浴10 min)→離心(4 000 r/min，20 min)→上清液即為苜蓿葉蛋白肽

1.2.2 大孔吸附樹(shù)脂預(yù)處理 用2倍樹(shù)脂床體積(2 BV)5%的HCl，以2 BV/h的流速過(guò)柱浸泡2 h，用水洗至中性，再用2 BV 2%的NaOH溶液以同樣流速過(guò)柱浸泡2 h，再用水洗至中性抽濾，備用。不同大孔吸附樹(shù)脂的物理結(jié)構(gòu)參數(shù)見(jiàn)表1。

1.2.3 大孔吸附樹(shù)脂篩選 準(zhǔn)確稱(chēng)取已處理好的6種不同類(lèi)型大孔吸附樹(shù)脂各10.000 0 g，分別置于100 mL具塞錐形瓶中，各加入質(zhì)量濃度5 mg/mL的苜蓿葉蛋白肽溶液30 mL，將錐形瓶塞好塞子后置于恒溫水浴振蕩器中振蕩10 h(25 ℃，150 r/min)，待吸附完全后抽濾，測(cè)定被吸附后的苜蓿葉蛋白肽液質(zhì)量濃度。吸附完全的6種樹(shù)脂用100 mL蒸餾水沖洗至流出液呈中性，加入30 mL體積分?jǐn)?shù)為75%的乙醇，在25 ℃，150 r/min振蕩10 h進(jìn)行解吸，過(guò)濾，測(cè)定濾液中苜蓿肽的質(zhì)量濃度，按式(1)、(2)計(jì)算不同型號(hào)的大孔吸附樹(shù)脂對(duì)苜蓿葉蛋白肽溶液的吸附率及解吸率。

表1 不同大孔樹(shù)脂的物理結(jié)構(gòu)參數(shù)

(1)

(2)

式中：

C0——吸附前溶液中肽的濃度，mg/mL；

C1——吸附后溶液中肽的濃度，mg/mL；

W2——解吸率，%；

C2——解吸液中肽的濃度，mg/mL；

V1——解吸液的體積，mL；

V——吸附液的體積，mL。

1.2.4 大孔吸附樹(shù)脂(DA201-C)靜態(tài)吸附—解吸試驗(yàn)

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(1) 靜態(tài)吸附與解吸試驗(yàn)：于100 mL具塞錐形瓶中加入已處理好的大孔吸附樹(shù)脂10.000 0 g，再加入30 mL質(zhì)量濃度為5 mg/mL的苜蓿葉蛋白肽液，置于恒溫水浴振蕩器中振蕩10 h(25 ℃，150 r/min)，分別測(cè)定1，2，3，4，5，6，7，8，9，10 h被吸附后的酶解液濃度，按式(1)計(jì)算吸附率。繪制靜態(tài)吸附曲線。

將充分吸附苜蓿葉蛋白肽的大孔樹(shù)脂置于100 mL錐形瓶中，加入體積分?jǐn)?shù)為75%的乙醇30 mL，同樣在25 ℃，150 r/min振蕩10 h進(jìn)行解吸，分別測(cè)定1，2，3，4，5，6，7，8，9，10 h解吸液中的肽濃度。按式(2)計(jì)算解吸率。繪制靜態(tài)解吸曲線。

(2) 酶解液濃度對(duì)吸附效果的影響：準(zhǔn)確稱(chēng)取預(yù)處理過(guò)的大孔吸附樹(shù)脂10.000 0 g于100 mL錐形瓶中，分別加入2.5，5.0，7.5，10.0 mg/mL的苜蓿葉蛋白肽液30 mL，在25 ℃，150 r/min的恒溫水浴振蕩器中振蕩10 h，待充分吸附后過(guò)濾，測(cè)定濾液中肽液的質(zhì)量濃度。計(jì)算吸附率。

(3) 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)解吸效果的影響：對(duì)充分吸附了苜蓿葉蛋白肽溶液的大孔吸附樹(shù)脂抽濾，分別用體積分?jǐn)?shù)為25%，50%，75%，100%的乙醇解吸，收集10 h后的解吸液，過(guò)濾，測(cè)定濾液中肽液的質(zhì)量濃度。計(jì)算解吸率。

1.2.5 大孔吸附樹(shù)脂(DA201-C)動(dòng)態(tài)吸附—解吸試驗(yàn)

(1) 上樣流速對(duì)DA201-C型大孔吸附樹(shù)脂吸附性能的影響：配制質(zhì)量濃度為10 mg/mL的苜蓿葉蛋白肽溶液，分別以0.5，1.0，2.5 mL/min的流速流經(jīng)層析柱，每10 mL 收集1管，測(cè)每次流出液中苜蓿葉蛋白肽的濃度，計(jì)算樹(shù)脂的吸附率。

(2) 上樣濃度對(duì)DA201-C型大孔吸附樹(shù)脂吸附性能的影響：分別配制質(zhì)量濃度為5，10，15 mg/mL的苜蓿葉蛋白肽溶液，以0.5 mL/min的流速流經(jīng)層析柱，每10 mL 收集1管，測(cè)每次流出液中苜蓿葉蛋白肽的濃度，計(jì)算樹(shù)脂的吸附率。

(3) 洗脫流速對(duì)DA201-C型大孔吸附樹(shù)脂解吸性能的影響：將濃度為10 mg/mL的苜蓿葉蛋白肽溶液，以0.5 mL/min 的流速進(jìn)行動(dòng)態(tài)吸附。結(jié)束后抽濾，然后用體積分?jǐn)?shù)為75%的乙醇溶液分別以0.5，1.0，2.5 mL/min的流速過(guò)柱解吸，每10 mL收集1管解吸液，測(cè)每次流出液中苜蓿葉蛋白肽的濃度，計(jì)算樹(shù)脂的解吸率。

(4) 洗脫體積對(duì)DA201-C型大孔吸附樹(shù)脂解吸性能的影響：將濃度10 mg/mL的苜蓿肽，以0.5 mL/min的流速進(jìn)行動(dòng)態(tài)吸附。結(jié)束后抽濾，用體積分?jǐn)?shù)為75%的乙醇溶液以0.5 mL/min的洗脫流速過(guò)柱解吸，每10 mL收集1管解吸液，測(cè)每次流出液中苜蓿葉蛋白肽的濃度，計(jì)算樹(shù)脂的解吸率。

1.2.6 DA201-C型大孔吸附樹(shù)脂對(duì)苜蓿葉蛋白肽的純化效果 測(cè)定經(jīng)DA201-C型大孔吸附樹(shù)脂純化前后的苜蓿葉蛋白肽的含量、糖含量、鹽含量。

1.2.7 總糖含量測(cè)定 蒽酮比色法[15]。

1.2.8 蛋白含量測(cè)定 Folin酚法[16]。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，所有試驗(yàn)均重復(fù)3次，各試驗(yàn)數(shù)據(jù)均以平均值和標(biāo)準(zhǔn)誤差表示，采用Duncan 法比較因素水平間的差異性(P<0.05)。

2 結(jié)果與分析

2.1 大孔吸附樹(shù)脂篩選

由圖1可知，非極性樹(shù)脂對(duì)苜蓿肽的吸附和解吸能力較強(qiáng)，與陳飛平[17]40研究的結(jié)果相符，也說(shuō)明苜蓿肽的疏水性較高。6種大孔樹(shù)脂的吸附率和解吸率有顯著性差異(P<0.05)，DA201-C型的吸附率達(dá)到87.00%。采用體積分?jǐn)?shù)75%乙醇溶液對(duì)吸附后的DA201-C型大孔樹(shù)脂進(jìn)行洗脫，解吸率亦最高為89.37%，DA201-C型大孔吸附樹(shù)脂的吸附率和解吸率明顯高于其他類(lèi)型，因此本試驗(yàn)篩選DA201-C型大孔吸附樹(shù)脂為純化苜蓿葉蛋白肽的最適大孔樹(shù)脂。在6種大孔樹(shù)脂中，由于DA201-C型大孔樹(shù)脂為非極性樹(shù)脂，比表面積最大，且平均孔徑相對(duì)較小，因此對(duì)疏水性多肽有較強(qiáng)的吸附性，而對(duì)分子量較大的蛋白吸附力差，可以達(dá)到分離純化小分子苜蓿葉蛋白肽的目的[17]40。

字母不同表示差異顯著(P<0.05)

2.2 大孔吸附樹(shù)脂(DA201-C)靜態(tài)吸附—解吸試驗(yàn)

2.2.1 靜態(tài)吸附—解吸動(dòng)力學(xué)曲線 由圖2可知，苜蓿葉蛋白肽吸附率和解吸率分別在前1 h和前3 h迅速增加，之后增加緩慢，基本達(dá)到平衡，屬于快速平衡型。因此，DA201-C型大孔樹(shù)脂對(duì)苜蓿葉蛋白肽具有良好的吸附和解吸性能。

圖2 DA201-C 型大孔樹(shù)脂靜態(tài)吸附—解吸動(dòng)力學(xué)曲線

Figure 2 The kinetic curve of static adsorption and desorption of DA201-C macroporous resins

2.2.2 酶解液質(zhì)量濃度對(duì)樹(shù)脂靜態(tài)吸附效果的影響 由圖3可知，隨苜蓿肽溶液濃度的增加，大孔樹(shù)脂的吸附率先上升后下降，在苜蓿肽溶液濃度為7.5 mg/mL時(shí)最大，為88.95%。這與鄧慧玲[18]的研究結(jié)果相符，可能是酶解液濃度達(dá)到一定時(shí)，肽分子數(shù)量增多，在擴(kuò)散過(guò)程中相互碰撞，反而阻礙了向大孔樹(shù)脂擴(kuò)散的速度，導(dǎo)致吸附率下降。因此，酶解液的質(zhì)量濃度控制在7.5 mg/mL。

2.2.3 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)樹(shù)脂靜態(tài)解吸效果的影響 由圖4 可知，隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增加，大孔樹(shù)脂的解吸率先上升后下降。解吸效果在乙醇體積分?jǐn)?shù)75%最好?？赡苁歉邼舛纫掖紩?huì)使蛋白質(zhì)和一些肽類(lèi)物質(zhì)沉淀而解吸困難。

圖3 酶解液質(zhì)量濃度對(duì)吸附性能的影響

Figure 3 Influence of mass concentration of enzymatic hydrolysate on the adsorption efficiency

圖4 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)解吸效果的影響

2.3 大孔吸附樹(shù)脂(DA201-C)動(dòng)態(tài)吸附—解吸試驗(yàn)

2.3.1 上樣流速對(duì)DA201-C型大孔吸附樹(shù)脂吸附性能的影響 由圖5可知，隨著上樣流速的增大，吸附率降低；上樣流速為0.5 mL/min時(shí)，吸附率最大?？赡苁谴罂讟?shù)脂的吸附需要一個(gè)接觸和擴(kuò)散的過(guò)程，如果流速過(guò)快，酶解液來(lái)不及擴(kuò)散到樹(shù)脂的內(nèi)表面就提早泄露而造成樣品流失[17]44，吸附率就會(huì)下降。

圖5 上樣流速對(duì)吸附性能的影響

2.3.2 上樣濃度對(duì)DA201-C型大孔吸附樹(shù)脂吸附性能的影響 由圖6所示，在動(dòng)態(tài)時(shí)各酶解液濃度均隨著流出液體積的增加使吸附率降低，但相比較濃度為10 mg/mL吸附率降低的慢。由于某一型號(hào)的大孔吸附樹(shù)脂吸附量一定，若酶解液濃度過(guò)高超出了吸附量，會(huì)造成水解物的損失，而較低的樣品濃度會(huì)造成吸附率下降。因此確定10 mg/mL 為最佳上樣濃度。

圖6 上樣濃度對(duì)吸附性能的影響

2.3.3 洗脫流速對(duì)DA201-C型大孔吸附樹(shù)脂解吸性能的影響 由圖7可知，隨著洗脫體積增大，3種洗脫流速的大孔樹(shù)脂解吸率均先迅速增加到最高點(diǎn)而后降低直至平穩(wěn)，且均在洗脫體積10 mL達(dá)最高點(diǎn)。而當(dāng)洗脫流速為0.5 mL/min時(shí)，解吸率最高，且解吸率從最高點(diǎn)下降至平穩(wěn)趨勢(shì)看，當(dāng)洗脫流速為0.5 mL/min時(shí)，下降速度快，即最先達(dá)到洗脫平衡。因此本試驗(yàn)選擇0.5 mL/min時(shí)作為最佳的苜蓿葉蛋白肽的洗脫流速。

2.3.4 洗脫體積對(duì)DA201-C型大孔吸附樹(shù)脂解吸性能的影響 由圖8可知，隨著洗脫體積增加，解吸率先升到最高點(diǎn)后降低，當(dāng)洗脫體積>50 mL后，解吸率較低，表明大部分苜蓿葉蛋白肽已被洗脫下來(lái)了。而在200 mL時(shí)，解吸率趨于平緩，解吸率達(dá)到6.4%，表明流出液中水解物含量已經(jīng)很少，因此將75%乙醇洗脫劑體積定為200 mL。

圖7 洗脫流速對(duì)解吸性能的影響

圖8 洗脫體積對(duì)解吸性能的影響

2.3.5 DA201-C型大孔吸附樹(shù)脂對(duì)苜蓿葉蛋白肽的純化效果 根據(jù)優(yōu)化過(guò)程的結(jié)果分析，采用動(dòng)態(tài)吸附。確定在上樣濃度為10 mg/mL，上樣流速為0.5 mL/min，采用DA201-C型大孔吸附樹(shù)脂對(duì)苜蓿葉蛋白水解物進(jìn)行動(dòng)態(tài)吸附，再以200 mL的75%乙醇溶液作為洗脫劑，0.5 mL/min的洗脫流速對(duì)吸附后的大孔樹(shù)脂進(jìn)行解吸，收集洗脫液經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)和冷凍干燥，得到純化后的苜蓿葉蛋白肽，測(cè)定吸附前后的酶解物成分含量，其成分分析見(jiàn)表2。

表2苜蓿葉蛋白酶解液純化前后成分分析?

Table2Compositionanalysisofalfalfaleafproteasehydrolysatebeforeandafterpurification%

? 同列字母不同表示差異顯著(P<0.05)。

由表2可看出，純化后的苜蓿葉蛋白酶解液中苜蓿葉蛋白肽含量由60.45%提高到了88.83%，純度較之前提高了46.95%。而糖含量由2.87%降低至0.52%，純度降低了81.88%。無(wú)機(jī)鹽等雜質(zhì)的含量由36.68%降低至10.65%，純度降低了70.97%，苜蓿葉蛋白酶解液營(yíng)養(yǎng)成分在純化前后有顯著性差異(P<0.05)，說(shuō)明DA201-C型大孔吸附樹(shù)脂能去除苜蓿葉蛋白酶解液中大部分無(wú)機(jī)鹽及糖類(lèi)。

3 結(jié)論

本試驗(yàn)首先對(duì)6種大孔吸附樹(shù)脂進(jìn)行篩選，確定DA201-C型大孔吸附樹(shù)脂為苜蓿葉蛋白肽純化的最適材料。通過(guò)靜態(tài)吸附—解吸和動(dòng)態(tài)吸附—解吸試驗(yàn)得到該工藝的最佳純化條件為上樣流速0.5 mL/min，上樣濃度10 mg/mL，采用75%乙醇溶液解吸，洗脫流速0.5 mL/min，洗脫體積200 mL，在該條件下苜蓿葉蛋白肽含量較純化前明顯提高，說(shuō)明優(yōu)化的工藝參數(shù)可行。本試驗(yàn)探討了采用大孔吸附樹(shù)脂純化苜蓿葉蛋白肽的優(yōu)化工藝，若將其應(yīng)用于食品或者保健品，還需要進(jìn)一步動(dòng)物試驗(yàn)和臨床試驗(yàn)，研究苜蓿葉蛋白肽體內(nèi)、體外抗氧化活性及抗氧化作用機(jī)理，為工業(yè)化生產(chǎn)高活性成分的苜蓿葉蛋白肽提供新方法。