基于柱前衍生化GC-MS的炒青綠茶加工過程中初級(jí)代謝物變化規(guī)律研究

陳美，戴偉東，李朋亮，朱蔭，陳勤操，楊艷芹，譚俊峰*，林智*

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基于柱前衍生化GC-MS的炒青綠茶加工過程中初級(jí)代謝物變化規(guī)律研究

陳美1,2，戴偉東1，李朋亮1,2，朱蔭1，陳勤操1,2，楊艷芹1，譚俊峰1*，林智1*

1. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院茶葉研究所，農(nóng)業(yè)部茶樹生物學(xué)與資源利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江 杭州 310008；2. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院研究生院，北京 100081

茶葉中的一些初級(jí)代謝產(chǎn)物前人研究較少，為了探明在炒青綠茶加工過程中這些初級(jí)代謝產(chǎn)物的變化規(guī)律，本研究以龍井43品種為原料制作了炒青綠茶，并采用了基于柱前衍生化的氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法（GC-MS）對(duì)其進(jìn)行測定。結(jié)果共鑒定出60種化合物，其中相對(duì)含量較高的為有機(jī)酸類、糖類、糖類衍生物。偏最小二乘法判別分析模型可成功區(qū)分炒青綠茶各個(gè)加工工序，并篩選出了關(guān)鍵差異化合物26種，聚類分析結(jié)果表明，這26種化合物在加工過程中的含量變化規(guī)律可分為以下3類：高→低：2-酮戊二酸、阿拉伯糖、沒食子酸、吡喃葡萄糖醛酸、甘油葡萄糖苷、核糖、半乳糖、果糖、葡萄糖、磷酸、4-酮葡萄糖、核糖酸-1,4-內(nèi)酯、甘露醇；高→低→高：尿黑酸、蔗糖、肌醇半乳糖苷、蘇糖酸、松二糖、核糖酸、肌醇和檸檬酸；低→高→低：赤蘚糖-1,4-內(nèi)酯、磷酸氧丙基酯、焦谷氨酸、奎尼酸、己二酸。有機(jī)酸主要呈現(xiàn)先上升后下降趨勢(shì)，糖類除蔗糖外主要呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。

炒青綠茶；衍生化；氣質(zhì)聯(lián)用（GC-MS）；初級(jí)代謝產(chǎn)物

根據(jù)干燥方式的不同，可以將綠茶分為炒青綠茶、烘青綠茶、曬青綠茶等。炒青綠茶是以翻炒的方式將綠茶炒至足干，從而達(dá)到干燥的目的，經(jīng)炒干而成的綠茶通常香氣鮮銳，滋味濃厚而又耐沖泡，深受消費(fèi)者喜愛。內(nèi)含成分是影響茶葉品質(zhì)的重要因子。對(duì)于炒青綠茶來說，其在加工過程中內(nèi)含物質(zhì)的變化直接關(guān)系到茶葉的品質(zhì)和風(fēng)味[1]。多年來，對(duì)于茶葉內(nèi)含成分的研究主要集中于次級(jí)代謝產(chǎn)物[2-3]，如茶多酚（兒茶素、酚酸、黃酮糖苷等）[4-5]、咖啡堿[6-7]、茶色素[8-9]等，這些內(nèi)含成分對(duì)茶葉品質(zhì)具有重要貢獻(xiàn)。其實(shí)，除了這些前人研究較多的次級(jí)代謝產(chǎn)物外，茶葉中還存在一些極性較強(qiáng)的初級(jí)代謝產(chǎn)物，如糖類、氨基酸、有機(jī)酸等，對(duì)茶葉的品質(zhì)風(fēng)味亦有重要貢獻(xiàn)[10-11]，但除氨基酸之外，初級(jí)代謝產(chǎn)物的研究一直較少，其中部分原因是對(duì)于茶葉中的這部分初級(jí)代謝產(chǎn)物缺乏完善的分析方法[11]。目前，茶葉中內(nèi)含成分的常見分析手段有離子色譜法（IC）[12-13]、毛細(xì)管電泳法（CE）[14-15]、液質(zhì)聯(lián)用法（LC-MS）[16-17]、氣質(zhì)聯(lián)用法（GC-MS）[18-19]等。但這些方法并不適用于茶葉中極性較強(qiáng)的初級(jí)代謝產(chǎn)物（如糖類、有機(jī)酸、氨基酸等）的測定[20]。

柱前衍生化GC-MS技術(shù)是在樣品進(jìn)行GC-MS分析前利用化學(xué)變換將目標(biāo)物質(zhì)修飾成類似化合物，從而使目標(biāo)化合物極性和沸點(diǎn)降低，物質(zhì)的揮發(fā)性和熱穩(wěn)定性增強(qiáng)，更方便于定性定量分析的一種分析技術(shù)[21]。衍生化方法很多，在食品研究領(lǐng)域，主要應(yīng)用的衍生化方法就有烷基化法、硅烷化法、酰基化法和酯化法，原理是將烷基、硅烷基、?；然鶊F(tuán)引入待測物中（以取代活潑氫的方式），從而將目標(biāo)化合物修飾成可被儀器準(zhǔn)確檢測的物質(zhì)。例如GC-MS衍生化分析中最常用的硅烷化法，即衍生化反應(yīng)時(shí)硅烷基取代待測物分子上的活潑氫，從而能夠增強(qiáng)化合物揮發(fā)性和熱穩(wěn)定性，便于GC-MS分析。常用的硅烷化試劑有二甲基硅烷（DMS）、三甲基硅烷（TMS）、二氯二甲基硅烷（DMCS）、三甲基氯硅烷（TMCS）及六甲基二硅氨烷（HMDS）、,－雙三甲基硅基三氟乙酰胺（BSTFA）、-甲基--三甲基硅烷三氟乙酸鹽（MSTFA）、,－雙三甲基硅基乙酰胺（BTA）等[22]。

目前柱前衍生化GC-MS技術(shù)已經(jīng)在煙草、蔬菜、水果、糧食等領(lǐng)域的研究中得到了較為廣泛的應(yīng)用，如Galbava等[23]以六甲基二硅胺烷（HMDS）和雙（三甲基硅烷基）三氟乙酰胺（BSTFA）為衍生化試劑，利用GC-MS研究比較了3種品牌香煙的灰分，鑒定出了每種品牌香煙的特征性成分；Hurtadofernández等[24]采用衍生化GC-MS技術(shù)分析了鱷梨成熟時(shí)的成分變化，鑒定出了脫落酸、亞油酸、天冬氨酸和甘露庚酮糖等與鱷梨成熟密切相關(guān)的化合物；許輝等[25]以三甲基氯硅烷、六甲基二硅胺烷、,－二甲基甲酰胺為衍生化試劑，聯(lián)合GC-MS測定了內(nèi)蒙古不同品種莜麥中可溶性和不可溶性非淀粉多糖的含量；在茶葉中該技術(shù)也有了初步的應(yīng)用，如張磊等[26]采用衍生化GC-MS技術(shù)，同時(shí)結(jié)合LC-MS，對(duì)綠茶、紅茶、烏龍茶的化學(xué)成分進(jìn)行了分析。但該技術(shù)一直未被應(yīng)用于茶葉加工過程的研究中。本研究擬將柱前衍生化GC-MS法應(yīng)用于茶葉加工過程的研究，闡明炒青綠茶加工過程中初級(jí)代謝產(chǎn)物的變化規(guī)律，為炒青綠茶品質(zhì)形成機(jī)理研究提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

炒青綠茶樣品：茶樣品種為龍井43，鮮葉于2016年5月13日采自浙江省杭州市西湖區(qū)龍塢鎮(zhèn)，采摘標(biāo)準(zhǔn)為一芽二葉，并于當(dāng)日經(jīng)攤放→殺青→揉捻→干燥（炒干）等工序制成干茶；加工過程中將鮮葉、攤放、殺青、揉捻、干燥等5道工序分別取樣，樣品經(jīng)液氮冷凍后進(jìn)行真空冷凍干燥，然后于-20℃保存。

吡啶、甲氧胺鹽酸鹽和-甲基--（三甲基硅基）三氟乙酰胺（MSTFA）購自Sigma-Aldrich公司，均為色譜純。

1.2 儀器與設(shè)備

6CST-40型滾筒殺青機(jī)購自浙江上洋機(jī)械有限公司；6CWC-100型炒青機(jī)購自福建省安溪佳友機(jī)械有限公司；6CR-Z45型茶葉揉捻機(jī)購自浙江春江茶葉機(jī)械有限公司；粉碎研磨機(jī)購自德國IKA公司；SQP電子天平購自賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司；5810R高速冷凍離心機(jī)購自Eppendorf公司；FD5-10真空冷凍干燥機(jī)購自美國Gold SIM公司；DK-S11型電熱恒溫水浴鍋購自上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；GC-MS儀器（7890B-7000C）購自美國安捷倫公司。

1.3 方法

1.3.1樣品前處理

茶湯浸提：將茶樣于-20℃冰箱取出置于干燥箱中恢復(fù)至常溫，然后磨成均勻的粉末，稱取40?mg于3?mL離心管內(nèi)，加入2?mL沸水，搖勻，浸提5?min，取上清液于5?000?r·min-1條件下離心10?min，之后取0.5?mL上清液于–20℃冰箱預(yù)凍后，轉(zhuǎn)移至真空冷凍干燥機(jī)中凍干備用。每個(gè)樣品3個(gè)重復(fù)。此外，本試驗(yàn)制備了空白樣品和質(zhì)量控制樣（QC樣）。空白樣品為0.5?mL去離子水冷凍干燥獲得。QC樣品為每個(gè)茶湯移取0.3?mL混合后于5?000?r·min-1條件下離心10?min，取0.5?mL上清液于-20℃冰箱預(yù)凍后冷凍干燥獲得。

衍生化處理：參考了文獻(xiàn)[26]的處理方法并有所調(diào)整。將凍干樣品取出，加入60?μL甲氧胺吡啶溶液（20?mg·mL-1），然后渦旋1?min，39℃條件下衍生1.5?h，之后再加入60?μL MSTFA于39℃條件下衍生0.5?h，最后將樣本于9?000?r·min-1條件下離心10?min，取上清液進(jìn)行GC-MS分析?？瞻讟悠泛蚎C樣品同樣進(jìn)行衍生化后進(jìn)行GC-MS分析。

1.3.2 GC-MS條件

參考了文獻(xiàn)[27]的GC-MS條件并進(jìn)行了微調(diào)。

GC條件：GC柱采用HP-5MS（30?m×0.25?mm，0.25?μm）；進(jìn)樣量：1?μL；程序升溫：起始溫度60℃保持3?min，然后以7℃·min-1的速度升溫至290℃，保持5?min；進(jìn)樣口溫度：280℃；進(jìn)樣模式：分流模式，分流比為10︰1；載氣：高純氦氣；恒流模式，流量為1?mL·min-1。

MS條件：傳輸線溫度：220℃；離子源：EI源，能量：70?eV；離子源溫度：220℃；質(zhì)量掃描范圍：33~600?amu；溶劑延遲時(shí)間：6.3?min。

1.3.3 定性分析

GC-MS分析所得到的質(zhì)譜數(shù)據(jù)經(jīng)過計(jì)算機(jī)檢索和NIST數(shù)據(jù)庫提供的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)譜圖進(jìn)行比對(duì)[28]，選擇正反匹配度均大于600（化合物質(zhì)譜圖與NIST數(shù)據(jù)庫正反匹配度均大于600則表明該化合物基于NIST數(shù)據(jù)庫的鑒定結(jié)果可靠性尚好[29]）的予以進(jìn)一步分析，并購買標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行驗(yàn)證。在空白樣品中出現(xiàn)的峰，認(rèn)為由衍生化試劑或者氣相色譜柱高溫條件下柱流失引起，在化合物峰表中進(jìn)行剔除。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

數(shù)據(jù)前處理：采用Unknows Analysis II軟件和Qualitative Analysis（安捷倫公司，美國）進(jìn)行未知物分析檢索，采用Quant Analysis軟件（安捷倫公司，美國）進(jìn)行化合物的積分，采用Excel軟件進(jìn)行聚類分析數(shù)據(jù)的前處理。

統(tǒng)計(jì)分析：經(jīng)過前處理的數(shù)據(jù)采用Simca-P 11.5進(jìn)行偏最小二乘判別分析、SPSS 18進(jìn)行非參數(shù)檢驗(yàn)以及采用MeV 4.9軟件進(jìn)行聚類分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 基于柱前衍生化GC-MS的炒青綠茶內(nèi)含成分分析

樣品經(jīng)過提取、凍干、衍生后即進(jìn)行GC-MS分析。炒青綠茶GC-MS分析的典型總離子流色譜圖如圖1所示，可發(fā)現(xiàn)衍生化后的色譜峰分離良好。

對(duì)總離子流圖進(jìn)行分析，經(jīng)過NIST數(shù)據(jù)庫檢索匹配以及進(jìn)一步標(biāo)準(zhǔn)品驗(yàn)證，最終可鑒定60種化合物（表1）特征離子，該60種化合物特征離子中，有43種化合物只出一個(gè)峰，有17種化合物因?yàn)檠苌^程中衍生位點(diǎn)的不同，而產(chǎn)生2個(gè)或2個(gè)以上的峰，具體結(jié)果如表1所示。由表1可以看出，這60種化合物可分為以下幾類：有機(jī)酸類（乳酸、乙酰亞氨酸、草酸、丙二酸、琥珀酸、甘油酸、蘋果酸、焦谷氨酸、蘇糖酸、己二酸、酒石酸、檸檬酸、2-酮戊二酸、莽草酸、粘酸、奎尼酸、沒食子酸、尿黑酸）、糖類（木糖、阿拉伯糖、核糖、蔗糖、半乳糖、乳糖、麥芽糖、阿洛糖、來蘇糖、葡萄糖、甘露糖、果糖、鼠李糖、山梨糖、纖維二糖、甘露二糖、松二糖等）、糖類衍生物（甲基半乳糖苷、肌醇半乳糖苷、甘油葡萄糖苷、葡萄糖酸、核糖酸、阿拉伯糖酸、半乳糖醛酸、吡喃葡萄糖醛酸、4-酮葡萄糖、核糖醇、木糖醇、阿拉伯糖醇、甘露醇、半乳糖醇等）、內(nèi)酯類（核糖酸-1,4-內(nèi)酯、葡萄糖醛酸-內(nèi)酯、赤蘚糖-1,4-內(nèi)酯等）、氨基酸類（蛋氨酸、天冬酰胺等）。這60種化合物大部分為茶葉中的初級(jí)代謝產(chǎn)物。有機(jī)酸類、糖類、糖類衍生物相對(duì)而言含量較高，分別占總峰面積的19.87%、14.66%、18.23%（此處百分比代表進(jìn)行了峰面積歸一化處理，即占GC-MS總出峰面積的相對(duì)比例，而非占茶葉含量的百分比重）。而在本次炒青綠茶樣品所測得的化合物中，占總峰面積相對(duì)比例最高的為：肌醇半乳糖苷、奎尼酸、蔗糖、磷酸、葡萄糖、肌醇、草酸。

2.2 基于柱前衍生化GC-MS的炒青綠茶加工過程中內(nèi)含成分變化規(guī)律分析

炒青綠茶品質(zhì)的最終形成與內(nèi)含成分的變化息息相關(guān)，前人對(duì)于炒青綠茶中茶多酚、茶色素等次級(jí)代謝產(chǎn)物在加工過程中的變化規(guī)律的研究已有所報(bào)道[2,8,11]，但對(duì)茶葉中初級(jí)代謝產(chǎn)物在炒青綠茶加工過程中變化規(guī)律的研究卻甚少，

圖1 基于衍生化GC-MS的炒青綠茶總離子流色譜圖（以QC樣為例）

表1 基于柱前衍生化GC-MS的炒青綠茶內(nèi)含成分鑒定結(jié)果

注：*，這些化合物由于衍生后生成兩個(gè)或兩個(gè)以上的峰；a，該化合物已經(jīng)過標(biāo)樣驗(yàn)證

Note:*,These compounds produce two or more peaks after derivatization. a, the compound has been verified by standard

續(xù)表1

本研究采用偏最小二乘法判別分析（PLS-DA）結(jié)合聚類分析揭示炒青綠茶中一些關(guān)鍵性初級(jí)代謝化合物的變化規(guī)律。如圖2-a所示，QC樣品聚集于PLS-DA得分圖的中央，表明樣品提取、衍生化和GC-MS分析的重復(fù)性良好，結(jié)果可靠。PLS-DA模型可成功區(qū)分炒青綠茶的各個(gè)加工過程，且各加工過程呈逐步變化趨勢(shì)，說明炒青綠茶加工過程中一些化合物的含量逐步發(fā)生變化。將載荷圖（圖2-c）與得分圖（圖2-a）對(duì)比也可以看出，本研究采用的基于柱前衍生化GC-MS方法所測得的成分中，大部分物質(zhì)在加工過程中含量變化差異不明顯（集中于載荷圖中央），這與綠茶殺青滅酶阻止內(nèi)含成分變化有關(guān)。大部分化合物在加工過程前期含量較高，在加工過程中含量降低（分散于載荷圖左側(cè)），部分化合物在加工過程后期含量較高，在加工過程中含量升高（分散于載荷圖右側(cè)）。

另外，如圖2-b所示，該P(yáng)LS-DA模型經(jīng)60次交叉驗(yàn)證后，2=–0.408，2=0.040，表明該模型未過擬合，較為可靠。

變量重要性因子（Variable important for the projection，VIP）可以將PLS-DA模型中每一變量對(duì)判別分析的貢獻(xiàn)值量化[30]，VIP值越大，說明該化合物在加工過程中含量的變化越大，對(duì)PLS-DA模型的分類貢獻(xiàn)越大。本研究結(jié)合VIP值與Kruskal-Wallis（KW）檢驗(yàn)，從已經(jīng)鑒定出的60種化合物特征離子中，篩選出VIP值>1且KW檢驗(yàn)<0.05的化合物共26種，為了清楚直觀地展示這26種化合物在炒青綠茶加工過程中的變化規(guī)律，采用MeV 4.9軟件對(duì)這26種化合物進(jìn)行了聚類分析[31]。如圖3所示，顏色越紅，代表該化合物在這一加工過程相對(duì)含量越高，顏色越綠，代表該化合物在這一加工過程中相對(duì)含量越低。

圖2 炒青綠茶內(nèi)含成分PLS-DA得分圖（a）、模型驗(yàn)證（b）及其載荷圖（c）

圖3 炒青綠茶加工過程中關(guān)鍵內(nèi)含成分含量變化熱圖

從圖3中可以看出，加工過程中內(nèi)含成分相對(duì)含量的變化趨勢(shì)可分為3類：高→低：2-酮戊二酸、阿拉伯糖、沒食子酸、吡喃葡萄糖醛酸、甘油葡萄糖苷、核糖、半乳糖、果糖、葡萄糖、磷酸、4-酮葡萄糖、核糖酸-1,4-內(nèi)酯、甘露醇這13種成分在鮮葉期和攤放期含量較高，從殺青期開始含量顯著下降，然后一直維持低含量水平；高→低→高：蘇糖酸、松二糖、核糖酸、肌醇、檸檬酸這5種成分在加工前期含量一直處于下降階段，在揉捻過程中含量略微上升，干燥過程中含量顯著升高，而尿黑酸、蔗糖、肌醇半乳糖苷這3種成分從鮮葉到攤放過程含量下降，從殺青開始，含量顯著上升直至加工過程結(jié)束，相對(duì)于鮮葉中的初始量，總體表現(xiàn)為綠茶炒青加工后升高；低→高→低：赤蘚糖-1,4-內(nèi)酯、磷酸氧丙基酯、焦谷氨酸、奎尼酸、己二酸這5種成分在鮮葉和攤放過程含量較低，中間殺青和揉捻過程中含量顯著上升，但在干燥之后的成品茶中含量又下降。劉冉霞等[32]的研究表明，球形綠茶在鮮葉→攤放→殺青→包揉→干燥該5道加工工序中，攤晾階段可溶性糖含量呈增加趨勢(shì)，包揉干燥時(shí)期含量有所下降；喬小燕等[33]對(duì)客家傳統(tǒng)長炒青綠茶的研究表明，在鮮葉→萎凋→殺青→揉捻→動(dòng)態(tài)失水→第一次長炒青→第二次長炒青等7道連續(xù)化生產(chǎn)線加工工序中，殺青揉捻階段可溶性糖含量顯著下降，這與本研究中果糖、半乳糖、核糖、阿拉伯糖、葡萄糖等可溶性糖在炒青綠茶加工過程中的變化趨勢(shì)一致。

2.3 初級(jí)代謝產(chǎn)物與綠茶品質(zhì)關(guān)系探討

有機(jī)酸、糖類等初級(jí)代謝產(chǎn)物存在于很多天然植物、蔬果中，并與品質(zhì)有著密切的關(guān)系。例如在蘋果中就發(fā)現(xiàn)，總糖含量和山梨糖醇含量與蘋果甜度呈顯著正相關(guān)，而有機(jī)酸則與蘋果甜度呈負(fù)相關(guān)[34]；葡萄柚中主要含有蔗糖、葡萄糖、果糖這3種糖，含量比為2∶1∶1，所含有機(jī)酸中檸檬酸含量最高，而有機(jī)酸與糖類的個(gè)體比例差異則很大程度的影響了葡萄柚的甜度與酸度[35]；中國楊梅汁經(jīng)檢測發(fā)現(xiàn)有機(jī)酸主要為酒石酸、奎寧酸、蘋果酸、抗壞血酸、乳酸、乙酸、馬來酸、檸檬酸和琥珀酸，糖類主要為蔗糖、果糖、葡萄糖，經(jīng)過理化分析與感官審評(píng)，發(fā)現(xiàn)奎寧酸、馬來酸、果糖、檸檬酸、乳酸、琥珀酸和蔗糖對(duì)楊梅汁的味道特征有顯著貢獻(xiàn)[36]。

同樣，在茶葉中，也發(fā)現(xiàn)茶湯中如檸檬酸、草酸、蘋果酸等有機(jī)酸呈酸味，果糖、葡萄糖等部分糖呈甜味[10]；劉爽等[37]在綠茶茶湯化學(xué)組分與滋味分屬性相關(guān)性研究中發(fā)現(xiàn)，綠茶中有機(jī)酸總量與茶湯的鮮味呈正相關(guān)，而且有機(jī)酸總量在感官審評(píng)總評(píng)分較高的綠茶中含量也較高，而隨著綠茶滋味品質(zhì)的降低，其含量也逐漸減少。在本研究中，如圖4所示，有機(jī)酸的變化趨勢(shì)并不完全一致，檸檬酸和一些糖酸（核糖酸、蘇糖酸等）在加工過程中呈現(xiàn)先下降后上升的趨勢(shì)，而奎寧酸、焦谷氨酸、己二酸、尿黑酸等在加工過程中間階段含量升高，之后又略微下降。在綠茶審評(píng)過程，酸味并不是綠茶的主要滋味特征，而鮮味普遍認(rèn)為與氨基酸成分密切相關(guān)，因此有機(jī)酸與氨基酸的滋味互作關(guān)系及其對(duì)綠茶品質(zhì)的貢獻(xiàn)還需下一步深入研究?？扇苄蕴呛繐?jù)文獻(xiàn)報(bào)道在綠茶加工過程中呈現(xiàn)先大幅度下降，再上升的情況[38]。本研究中（圖4），可溶性單糖（阿拉伯糖、核糖、果糖、半乳糖、葡萄糖）在加工過程中總體都呈下降趨勢(shì)，尤其是殺青和干燥過程可顯著降低其含量；但可溶性二糖蔗糖在鮮葉萎調(diào)過程中下降后，在殺青和干燥的過程中均顯著上升，整體相較于鮮葉中的初始含量，其含量顯著升高，提示綠茶加工過程中的加熱步驟（殺青與干燥）可促進(jìn)單糖向二糖轉(zhuǎn)化。蔗糖是這6種可溶性糖中含量最高的，是可溶性糖單糖（阿拉伯糖、核糖、果糖、半乳糖、葡萄糖）含量的幾倍至幾十倍不等，因此，就可溶性糖總體含量而言，是符合先下降再上升的趨勢(shì)的，這在一定程度上會(huì)減輕茶葉的苦澀味，增加其鮮甜感[39]。

3 結(jié)論

本研究以龍井43鮮葉為原料，依次經(jīng)過攤放、殺青、揉捻、干燥（炒干）等加工工序制作成炒青綠茶，并以此為試驗(yàn)對(duì)象，采用MSTFA為衍生化試劑，進(jìn)行了基于柱前衍生化GC-MS的內(nèi)含成分分析及變化規(guī)律研究。研究表明，該方法可較為全面、準(zhǔn)確地檢測前人研究較少的茶葉中的初級(jí)代謝產(chǎn)物，并最終鑒定出了60種化合物特征離子，主要可分為5類，分別是：有機(jī)酸類18種、糖類17種、糖類衍生物14種、內(nèi)酯類3種、氨基酸類2種，其中相對(duì)而言含量較高的類別為：有機(jī)酸類、糖類、糖類衍生物。

基于化合物的相對(duì)含量，建立了PLS-DA模型，結(jié)果表明內(nèi)含成分在炒青綠茶加工過程中有所變化，并篩選出了VIP>1且KW檢驗(yàn)<0.05的化合物共26種。對(duì)這26種化合物進(jìn)行聚類分析，結(jié)果顯示，這些化合物在加工過程中的變化規(guī)律可分為3類：相對(duì)含量“高→低”變化的有13種化合物，相對(duì)含量“高→低→高”變化的有8種，而剩下的5種化合物則是呈現(xiàn)由“低→高→低”的變化趨勢(shì)；從化合物類別來看，在這26種化合物中，有機(jī)酸類和糖類占了21種，絕大部分為茶葉中的初級(jí)代謝成分，其中有機(jī)酸的總體變化較為復(fù)雜，既有先降后升趨勢(shì)（檸檬酸、核糖酸、蘇糖酸等），也有先升后降趨勢(shì)（焦谷氨酸、己二酸、奎尼酸、尿黑酸等）；可溶性單糖，葡萄糖、果糖、半乳糖、阿拉伯糖、核糖等在炒青綠茶加工過程中逐漸降低，尤其在殺青和干燥過程中顯著降低，而蔗糖（可溶性二糖）的變化趨勢(shì)是先降后升，尤其是在殺青和干燥過程中顯著升高。

注：FL：鮮葉；W：攤放；F：殺青；R：揉捻；D：干燥

Note: FL: Fresh leaves, W: Withering, F: Fixation, R: Rolling, D: Drying

圖4 有機(jī)酸和糖類在茶葉加工過程中相對(duì)含量變化情況

Fig.4 Relative content changes of organic acids and carbohydrates during tea processing

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Study on the Changes of Primary Metabolites During theManufacturing Process of Roasted Green Tea by Pre-column Derivatization Combining with GC-MS

CHEN Mei1,2, DAI Weidong1, LI Pengliang1,2, ZHU Yin1, CHEN Qincao1,2,YANG Yanqin1, TAN Junfeng1*, LIN Zhi1*

1. Key Laboratory of Tea Biology and Resources Utilization, Ministry of Agriculture, Tea Research Institute, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Hangzhou 310008, China; 2. Graduate School of Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100081, China

Few if any previous studies were carried out in the field of primary metabolite changes during the manufacturing process of roasted green tea. Longjing 43 was used to make roasted green tea and gas chromatography-mass spectrometry (GC-MS) with derivatization was used to determine the components. A total of 60 compounds were identified, which included high levels of organic acids, carbohydrates and carbohydrate derivatives. Each steps of the processing could be successfully distinguished by partial least-squares discriminant analysis based on 26 key compounds. The results of cluster analysis indicated that the content changes of the 26 compounds could be classified into three categories: high-low: 2-ketoglutaric acid, arabinose, gallic acid,glucopyranosiduronic acid, glyceryl-glucoside, ribose, galactose, fructose, glucose, phosphoric acid, 4-ketoglucose, ribono-1,4-lactone, and mannitol. High-low-high: homogentisic acid, sucrose, galactinol, threonic acid, turanose, ribonic acid, inositol and citric acid. Low-high-low: erythrose-1,4-lactone, oxypropyl phosphate, pyroglutamic acid, quinic acid and hexanedioic acid. Organic acids mainly showed a rising and then downward trend. Carbohydrates except sucrose showed a downward trend.

roasted green tea, derivatization, gas chromatography-mass spectrometry (GC-MS), primary metabolites

S571.1；TS272.5+1

A

1000-369X(2019)03-297-12

2018-11-13

2019-01-13

中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院科技創(chuàng)新工程（CAAS-ASTIP-2014-TRICAAS）

陳美，女，碩士研究生，主要從事茶葉加工品質(zhì)化學(xué)方面的研究，chenxiaomei88520@163.com。*通信作者