茶樹(shù)CsLHTs亞家族基因的克隆與表達(dá)分析

郭玲玲，張芬，張亞真，成浩，韋康，阮麗，吳立赟，王麗鴛

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茶樹(shù)亞家族基因的克隆與表達(dá)分析

郭玲玲，張芬，張亞真，成浩，韋康，阮麗，吳立赟，王麗鴛*

中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院茶葉研究所/國(guó)家茶樹(shù)改良中心，浙江 杭州 310008

氨基酸是茶葉的重要品質(zhì)成分和氮素貯存形式，因此開(kāi)展茶樹(shù)體內(nèi)氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的研究尤為重要。本研究從茶樹(shù)轉(zhuǎn)錄組中篩選得到5條茶樹(shù)（Lysine histidine transporters，賴(lài)氨酸/組氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白）家族基因序列，并從龍井43中成功克隆獲得4個(gè)茶樹(shù)基因，分別命名為、、和。對(duì)該亞家族編碼的氨基酸序列的理化性質(zhì)和功能結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)，結(jié)果顯示CsLHTs亞家族含有9~11個(gè)跨膜區(qū)；且含有與氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)的結(jié)構(gòu)域。為了明確在不同茶樹(shù)品種和氮素水平間基因的表達(dá)差異，本研究選用3個(gè)茶樹(shù)品種的扦插苗為試驗(yàn)材料，水培條件下氮饑餓兩周后，分別用0.2、2、10?mmol·L-1的NH4NO3進(jìn)行處理。利用qRT-PCR分析了在不同組織間的表達(dá)情況，結(jié)果表明4個(gè)基因在茶樹(shù)營(yíng)養(yǎng)組織中均有表達(dá)。經(jīng)氮素處理后，基因在3個(gè)氮素水平和3個(gè)品種中呈現(xiàn)出不同的變化規(guī)律。和在品種間的表達(dá)差異程度高于不同氮素水平間的基因表達(dá)差異。對(duì)氮素處理有明顯的響應(yīng)，尤其經(jīng)0.2?mmol·L-1和10?mmol·L-1的NH4NO3處理72?h后，在氮高效品種中茶302根中呈上調(diào)表達(dá)，表明可能參與氨基酸由根部向地上部的轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程。

茶樹(shù)；；氮素；基因克隆與表達(dá)

氨基酸是植物體內(nèi)重要的含氮小分子化合物，參與各個(gè)代謝過(guò)程中以保證植物完成生命周期活動(dòng)[1]，這也依賴(lài)于氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白在其中發(fā)揮的轉(zhuǎn)運(yùn)功能。氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白是位于生物膜上用以吸收轉(zhuǎn)運(yùn)氨基酸的蛋白[2]，其中LHTs是氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白ATF超家族（Amino acid transporter family）中重要的一個(gè)亞家族，它對(duì)中性和酸性氨基酸具有較高的親和性[3]，能夠轉(zhuǎn)運(yùn)多數(shù)氨基酸。目前，LHTs亞家族的基因定位和功能等方面的研究大多集中在模式植物擬南芥上，擬南芥中的主要表達(dá)部位為幼苗根的表面和花粉，對(duì)賴(lài)氨酸和組氨酸的轉(zhuǎn)運(yùn)效率最高[4]。Hirner等[5]發(fā)現(xiàn)AtLHT1能從根中轉(zhuǎn)運(yùn)氨基酸，并通過(guò)木質(zhì)部供應(yīng)到葉肉細(xì)胞中。尤其在缺氮條件下，的過(guò)度表達(dá)可以提高植物生長(zhǎng)的氮利用效率；AtLHT2對(duì)脯氨酸和天冬氨酸有較高的親和性，在花粉囊中的表達(dá)量較高，它能將中性和酸性氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)到花粉發(fā)育的小體中，影響花粉的發(fā)育[3]。、和在花藥和雄配子體中表達(dá)，定位在細(xì)胞質(zhì)膜上[6]。除擬南芥外，其他物種中的LHTs亞家族的序列也有被發(fā)現(xiàn)，但對(duì)其進(jìn)一步的研究相對(duì)較少，而茶樹(shù)中LHTs亞家族氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的相關(guān)研究更為缺乏。

氨基酸不僅是氮素的重要貯存形式[7]，而且是茶葉鮮爽味的重要貢獻(xiàn)者[8]，因此開(kāi)展茶樹(shù)體內(nèi)氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的研究尤為重要。本研究通過(guò)對(duì)課題組前期的茶樹(shù)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果進(jìn)行篩選，獲得5條茶樹(shù)家族基因序列。以龍井43（LJ43）的葉片、莖及根為材料，最終克隆得到4個(gè)茶樹(shù)基因，分別命名為、、和。同時(shí)對(duì)所得到的基因序列進(jìn)行生物信息學(xué)分析，包括編碼氨基酸的理化性質(zhì)、保守結(jié)構(gòu)域及蛋白質(zhì)的二、三級(jí)結(jié)構(gòu)等；并對(duì)該家族基因的組織表達(dá)特性以及在不同氮素處理下的基因表達(dá)模式進(jìn)行了分析，以期為進(jìn)一步研究茶樹(shù)LHTs功能提供依據(jù)，為氮高效型茶樹(shù)品種的選育研究提供新思路。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料及處理

采摘龍井43（LJ43）的嫩葉（一芽一葉），成熟葉，根和莖迅速轉(zhuǎn)入液氮中冷凍處理，并于–80℃冰箱保存，以用于后續(xù)的克隆試驗(yàn)。水培材料LJ43、中茶108（ZC108）和中茶302（ZC302）一年生無(wú)性系茶樹(shù)幼苗種植于中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院茶葉研究所日光溫室中，水培所用營(yíng)養(yǎng)液配方參照參考文獻(xiàn)[9]的方法。在茶苗生長(zhǎng)穩(wěn)定且長(zhǎng)勢(shì)良好時(shí)，對(duì)3個(gè)品種的嫩葉、成熟葉、根和莖分別進(jìn)行取樣，于蒸餾水中清洗，擦干后迅速轉(zhuǎn)入液氮中，–80℃保存?zhèn)溆茫糜诤罄m(xù)的組織特性分析。與此同時(shí)對(duì)以上水培材料進(jìn)行氮饑餓處理兩周，隨后轉(zhuǎn)入氮素濃度分別為0.2?mmol·L-1（低氮水平），2?mmol·L-1（正常氮素水平）和10?mmol·L-1（高氮水平）的營(yíng)養(yǎng)液中培養(yǎng)，氮源為NH4NO3。每個(gè)處理設(shè)3次重復(fù)，分別于0、3、72?h后對(duì)3個(gè)品種的嫩葉、成熟葉、根和莖取樣，第1次取樣時(shí)間為上午9點(diǎn)，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)取3株，分組織清洗后轉(zhuǎn)入液氮，于–80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 CsLHTs亞家族基因克隆及測(cè)序

按照TIANGEN的多糖多酚植物總RNA提取試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行茶樹(shù)總RNA的提取，使用TAKARA的RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒完成cDNA第一鏈合成。根據(jù)茶樹(shù)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，篩選得到茶樹(shù)亞家族基因序列5條，并將其與茶樹(shù)基因組序列[10]進(jìn)行比對(duì)。利用軟件Primer premier 5在序列ORF兩端設(shè)計(jì)擴(kuò)增引物（表1），進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定后，將PCR純化產(chǎn)物連接到PMD-18T載體（TAKARA）并轉(zhuǎn)化大腸桿菌，挑取陽(yáng)性單克隆送上海生工進(jìn)行測(cè)序。

表1 基因克隆引物

1.3 CsLHTs亞家族基因的生物信息學(xué)分析

利用Editseq軟件對(duì)序列進(jìn)行ORF查詢(xún)并推導(dǎo)編碼的氨基酸序列；通過(guò)在線工具ProtParam（http://web.expasy.org/protparam）在線軟件計(jì)算推導(dǎo)蛋白質(zhì)的相對(duì)分子質(zhì)量、理論等電點(diǎn)等基本理化性質(zhì)；利用Protscale（http://web.expasy.org/protscale）進(jìn)行蛋白的親水性/疏水性分析；SignalP 4.1（http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP）進(jìn)行蛋白信號(hào)肽預(yù)測(cè)；ProtCompVersion 9.0（http://linuxl.Softberry.com/berry.phtml）進(jìn)行蛋白的亞細(xì)胞定位分析；TMHMM（http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM）進(jìn)行蛋白跨膜結(jié)構(gòu)分析。NCBI的CDD（Conserved Domain Database）在線數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行氨基酸序列的保守結(jié)構(gòu)域分析。Sopma（https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html）和Swiss-Model數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)推導(dǎo)編碼蛋白分別進(jìn)行二級(jí)結(jié)構(gòu)和三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)。使用DNAMAN軟件對(duì)CsLHTs亞家族基因蛋白進(jìn)行同源比對(duì)分析。利用MEGA7.0對(duì)CsLHTs氨基酸序列和擬南芥（）和煙草（）的LHTs蛋白序列進(jìn)行序列同源性分析，并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

1.4 CsLHTs亞家族基因的表達(dá)分析

按照TIANGEN的多糖多酚植物總RNA提取試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行總RNA的提取，cDNA的合成采用TIANGEN的快速反轉(zhuǎn)錄試劑盒FastKing RT Kit with gDNase進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，cDNA模板最終濃度至100?ng·μL-1。

2 結(jié)果與分析

2.1 CsLHTs亞家族基因克隆及測(cè)序

從已有的茶樹(shù)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)中，我們篩選到5條基因，根據(jù)轉(zhuǎn)錄組中功能注釋等信息（表3）以及NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)之后，將基因分別命名為、、、和。將以上5個(gè)基因與茶樹(shù)基因組序列進(jìn)行比對(duì)，序列相似性均達(dá)到99%及以上。以LJ43嫩葉、成熟葉、莖和根的混合cDNA模板，通過(guò)RT-PCR方法，最終成功克隆得4條包含完整的ORF的亞家族基因，經(jīng)克隆未得到條帶。經(jīng)測(cè)序，發(fā)現(xiàn)克隆得到的序列與轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)中的ORF序列大小一致，序列相似度達(dá)99%以上。

表2 熒光定量PCR引物

表3 茶樹(shù)CsLHTs亞家族信息及與茶樹(shù)基因組比對(duì)結(jié)果

2.2 茶樹(shù)CsLHTs亞家族生物信息學(xué)分析

2.2.1 編碼氨基酸的理化性質(zhì)

利用Editseq軟件對(duì)序列進(jìn)行ORF查詢(xún)并推導(dǎo)編碼的氨基酸序列，然后通過(guò)ProtParam在線計(jì)算推導(dǎo)蛋白質(zhì)基本理化性質(zhì)。結(jié)果（表4）顯示，茶樹(shù)亞家族基因編碼氨基酸數(shù)在438~523之間；相對(duì)分子量最小的為CsLHT6，為48.90?kD，最大的為CsLHT8.2，為57.68?kD；理論等電點(diǎn)均在8.5以上，為堿性蛋白；不穩(wěn)定系數(shù)在40以下為穩(wěn)定蛋白，該亞家族的不穩(wěn)定系數(shù)在32.60~41.41，除CsLHT6為不穩(wěn)定蛋白外，其余均為穩(wěn)定蛋白；親水性平均系數(shù)在0.432~0.504，為正值，表明該亞家族均為疏水蛋白，與Protscale中預(yù)測(cè)的結(jié)果一致；利用SignalP 4.1進(jìn)行蛋白信號(hào)肽預(yù)測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)該亞家族基因的蛋白質(zhì)均不含信號(hào)肽，屬于非分泌型蛋白；ProtCompVersion 9.0亞細(xì)胞定位結(jié)果表明，5個(gè)蛋白位于質(zhì)膜上；TMHMM進(jìn)行蛋白跨膜結(jié)構(gòu)分析結(jié)果顯示該亞家族基因含有9~11個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域。通過(guò)NCBI的CDD在線數(shù)據(jù)庫(kù)分析，每個(gè)序列都?xì)w屬于SLC5-6-like_sbd亞家族，此外，CsLHT1和CsLHT2含有Aa_trans（Transmembrane amino acid transporter protein登錄號(hào)：PF01490）結(jié)構(gòu)域。

2.2.2 CsLHTs蛋白高級(jí)結(jié)構(gòu)的生物信息學(xué)分析

通過(guò)對(duì)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的分析可以得到更多的關(guān)于其功能機(jī)制的信息，因此我們利用在線工具Sopma對(duì)5個(gè)茶樹(shù)編碼的氨基酸序列進(jìn)行二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)。結(jié)果（表5）顯示，該亞家族基因編碼氨基酸序列均包含螺旋、轉(zhuǎn)角、無(wú)規(guī)則卷曲和延伸鏈。CsLHT1、CsLHT2和CsLHT6中螺旋為主要的二級(jí)結(jié)構(gòu)組成部分，CsLHT8.1和CsLHT8.2中占比最多的是無(wú)規(guī)則卷曲。Swiss-Model同源建模預(yù)測(cè)結(jié)果（圖1）顯示，5個(gè)CsLHTs均與鈉偶聯(lián)中性氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)體9（Sodium-coupled neutral amino acid transporter 9）同源，且從空間構(gòu)象上看，與二級(jí)結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè)結(jié)果一致。

表4 茶樹(shù)CsLHTs亞家族蛋白理化性質(zhì)分析

表5 茶樹(shù)CsLHTs亞家族蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

注：從左到右依次為CsLHT1、CsLHT2、CsLHT6、CsLHT8.1、CsLHT8.2

2.2.3 氨基酸序列比對(duì)及系統(tǒng)進(jìn)化分析

利用DNAMAN軟件將5個(gè)基因編碼的氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)，結(jié)果表明，CsLHT1與CsLHT2、CsLHT6、CsLHT8.1、CsLHT8.2的序列相似度分別為73.6%、62.6%、33.9%、37.8%。其中CsLHT8.1和CsLHT8.2的序列相似度達(dá)53.9%。通過(guò)MEGA7.0對(duì)茶樹(shù)編碼氨基酸序列與Uniprot中擬南芥（）和煙草（）的LHTs家族的蛋白質(zhì)序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。結(jié)果顯示（圖2），CsLHT8.1和CsLHT8.2聚在了同一分支，表明兩者親緣關(guān)系較近；CsLHT1、CsLHT2和CsLHT6序列相似性較高，聚在一個(gè)分支上。不同物種中的同源基因的相似度較高，說(shuō)明植物中LHTs亞家族的基因較為保守。

2.3 茶樹(shù)CsLHTs亞家族基因組織表達(dá)特性分析

為了探究在茶樹(shù)中組織表達(dá)情況，我們選取了LJ43的嫩葉、成熟葉、根和莖作為試驗(yàn)材料進(jìn)行定量分析。其中在4個(gè)組織部位中均沒(méi)有得到特異性擴(kuò)增片段。其余4個(gè)基因在龍井43扦插苗中的表達(dá)情況如下。圖3顯示，4個(gè)在嫩葉中的表達(dá)差異不大。和在成熟葉和根中的表達(dá)量較高；主要表達(dá)在根和莖中；在莖中的表達(dá)量明顯高于其余3個(gè)組織部位。有研究表明LHT1和LHT6以及ProT2（Proline Transporter 2，脯氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白2）在根部吸收中有較重要的作用[12-14]，茶樹(shù)成熟葉和根中的表達(dá)量較高，可能參與根部氨基酸合成后的轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程；主要表達(dá)在根和莖中，可能介導(dǎo)氨基酸在根部到莖的木質(zhì)部的運(yùn)輸。和與擬南芥同源，序列相似度較高，但在不同組織中的表達(dá)有很大差異，主要在成熟葉和根中表達(dá)；在成熟葉和根中表達(dá)量極低，而在莖中的表達(dá)量較高。這可能預(yù)示著和在不同的組織中執(zhí)行同樣的功能。

圖2 茶樹(shù)LHTs與其他植物的LHTs進(jìn)化關(guān)系

2.4 茶樹(shù)CsLHTs亞家族基因氮素響應(yīng)的分析

根據(jù)該家族基因在不同組織的表達(dá)情況，我們分別選取了不同的組織部位對(duì)這些基因進(jìn)行氮素響應(yīng)的分析。結(jié)果如圖4，整體來(lái)看，該家族基因的表達(dá)受品種的影響較大。尤其在LJ43成熟葉中，的表達(dá)量明顯高于ZC108和ZC302。在不同品種中的表達(dá)差異不大，但在ZC108和ZC302根中的表達(dá)隨氮素濃度的變化呈現(xiàn)一定的規(guī)律：氮素處理3?h后，在正常氮素下其表達(dá)量最高；而氮素處理72?h后，氮素濃度升高其表達(dá)量增加。在成熟葉和根中的表達(dá)量較高，經(jīng)氮素處理后，其在根中的表達(dá)遠(yuǎn)高于成熟葉。氮素處理3?h，在LJ43成熟葉中的表達(dá)量低于ZC108和ZC302，且隨氮素處理濃度的升高，表達(dá)量下降；LJ43根中的表達(dá)量為ZC108和ZC302的3倍以上。經(jīng)低氮和高氮處理72?h，在ZC302根中的表達(dá)量為正常氮素處理的8倍及以上。在莖中的表達(dá)在不同氮素濃度下無(wú)明顯差異，但在ZC108和ZC302中的表達(dá)量高于LJ43。

注：1B1L 為嫩葉（一芽一葉）；ML 為成熟葉；R 為根；S 為莖

注：1B1L 為嫩葉（一芽一葉），ML 為成熟葉，R 為根，S為莖

Note: 1B1L is young leaf (one bud and one leaf). ML is mature leaf. R is root. S is stem

圖4亞家族基因在不同氮素水平處理下3個(gè)茶樹(shù)品種中的基因表達(dá)情況

Fig. 4 Transcripts ofsubfamily genes in three tea cultivars treated with different nitrogen levels

3 討論

氨基酸是植物體內(nèi)重要的含氮化合物，茶樹(shù)中氨基酸的含量不僅影響茶樹(shù)的生長(zhǎng)發(fā)育，還會(huì)影響茶葉的品質(zhì)和風(fēng)味。氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白參與植物體內(nèi)氨基酸的轉(zhuǎn)運(yùn)，對(duì)植物正常生長(zhǎng)發(fā)育起著重要的作用。茶樹(shù)CsCATs亞家族已被發(fā)現(xiàn)并克隆得到了6條基因序列，同時(shí)對(duì)這些基因在干旱，鹽脅迫等條件下的基因表達(dá)情況也進(jìn)行了研究[15]。

本文基于茶樹(shù)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果，從中篩選5個(gè)茶樹(shù)基因，分別為、、、和，并成功克隆得到、、和。經(jīng)與茶樹(shù)基因組[10]比對(duì)，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄組中5個(gè)基因的序列與基因組中序列基本一致。茶樹(shù)亞家族編碼氨基酸數(shù)在438~523，相對(duì)分子量在48.90~57.68?kD之間；均為堿性蛋白、疏水蛋白，均不含信號(hào)肽；除CsLHT6為不穩(wěn)定蛋白外，其余均為穩(wěn)定蛋白；該家族基因均定位在質(zhì)膜上，含有9~11個(gè)跨膜區(qū)。保守結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)結(jié)果顯示每個(gè)序列都含有SLC5-6-like_sbd結(jié)構(gòu)域，同時(shí)CsLHT1和CsLHT2還含有Aa_trans結(jié)構(gòu)域。螺旋為CsLHT1、CsLHT2和CsLHT6中主要的二級(jí)結(jié)構(gòu)組成部分，CsLHT8.1和CsLHT8.2中占比最多的是無(wú)規(guī)則卷曲。Swiss-Model同源建模模板為鈉偶聯(lián)中性氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)體9。系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)結(jié)果分析表明茶樹(shù)CsLHTs在進(jìn)化上是相對(duì)保守的。

組織表達(dá)特性分析結(jié)果顯示，除外，其他4個(gè)基因在茶樹(shù)各個(gè)組織中均有表達(dá)，但在不同組織中的表達(dá)水平存在差異。和在成熟葉和根中的表達(dá)量較高，因此推測(cè)這兩個(gè)基因可能參與根部合成氨基酸的轉(zhuǎn)運(yùn)；主要表達(dá)在根和莖中，其很有可能介導(dǎo)氨基酸在根部到莖的木質(zhì)部的運(yùn)輸。在莖中的表達(dá)量為其他組織部位的4倍以上，可能在莖中氨基酸的轉(zhuǎn)運(yùn)發(fā)揮著重要作用。文獻(xiàn)報(bào)道擬南芥中的在花粉囊中表達(dá)較高[3]，在本研究中，經(jīng)克隆和熒光定量均沒(méi)有得到的相關(guān)片段，原因可能是在所選的組織材料中的表達(dá)較低。

qRT-PCR的結(jié)果顯示，茶樹(shù)亞家族基因在不同氮素水平和品種中，各基因的表達(dá)量有差異。尤其對(duì)氮素的響應(yīng)最為明顯。在進(jìn)行組織表達(dá)特性分析時(shí)，在成熟葉中的表達(dá)量高于根中，但經(jīng)過(guò)氮素處理后，在根中的表達(dá)量為成熟葉中的3倍及以上。盡管有研究表明[5]在擬南芥中LHT1可將從外部吸收的氨基酸通過(guò)木質(zhì)部轉(zhuǎn)運(yùn)到地上部，但在茶樹(shù)中對(duì)氮素的響應(yīng)程度不明顯，因此在這個(gè)過(guò)程中可能承擔(dān)著較重要的作用。文獻(xiàn)研究報(bào)道LJ43為高氮高效的品種[16]，ZC302為低氮高效品種[17]，該家族基因?qū)Φ氐捻憫?yīng)模式在品種間也存在一定的差異。本研究中發(fā)現(xiàn)在LJ43成熟葉中的表達(dá)量低于ZC108和ZC302；在莖中，在ZC108和ZC302中的表達(dá)量高于LJ43；在根中，3?h氮素處理，在LJ43中的表達(dá)量高于ZC108和ZC302；72?h低氮和高氮處理后，ZC302中表達(dá)量為正常氮素處理下的8倍以上，其原因可能是，在ZC302中，較長(zhǎng)時(shí)間的氮素處理能誘導(dǎo)基因的上調(diào)表達(dá)，以參與茶樹(shù)體內(nèi)的氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)，保證各組織部位的氮素需求。

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Molecular Cloning and Expression Analysis ofGene Subfamily in Tea Plants ()

GUO Lingling, ZHANG Fen, ZHANG Yazhen, CHENG Hao, WEI Kang, RUAN Li, WU Liyun, WANG Liyuan*

Tea Research Institute，the Chinese Academy of Agricultural Sciences, National Center for Tea Improvement, Hangzhou 310008, China

Amino acids are important quality components and forms of nitrogen storage in tea plants (). Therefore, it is of great significance to study the function of amino acid transporters. In present study, five(Lysine histidine transporters,) were found from transcriptomes of tea plants. Among them, fourwere successfully cloned from the cultivar ‘Longjing 43’ by RT-PCR, and named,,and, respectively. The prediction results from amino acid sequences showed that each of CsLHT contained 9-11 transmembrane domains and one domain of amino acid transporter. To investigate the expression patterns of thesegenes under different nitrogen levels, cutting seedlings of three tea cultivars were fed with NH4NO3of three levels (0.2?mmol·L-1, 2?mmol·L-1and 10?mmol·L-1) after two weeks of nitrogen starvation. The qRT-PCR results showed that fourwere expressed in all vegetative tissues, and exhibited diverse expression patterns. For the genes of,and, the gene expression were affected more highly by tea cultivars rather than by nitrogen levels. However, the gene expression ofchanged greatly by nitrogen treatments. Especially, after 72?h treatments of 0.2?mmol·L-1and 10?mmol·L-1NH4NO3, theexpressions were significantly up-regulated in the root of ‘Zhongcha 302’, which was identified as a high nitrogen efficient cultivar. These results implied thatmight participate in the transport of amino acids from root to aerial parts in tea plants.

, Lysine histidine transporters (), nitrogen, gene cloning and expression

S571.1；Q52

A

1000-369X(2019)03-280-09

2019-01-24

2019-03-15

國(guó)家自然科學(xué)基金（31570695）、中央級(jí)科研院所基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)專(zhuān)項(xiàng)（1610212018004）、國(guó)家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專(zhuān)項(xiàng)資金項(xiàng)目（CARS-19）、浙江省農(nóng)業(yè)新品種選育重大專(zhuān)項(xiàng)（2016C02053）

郭玲玲，女，碩士研究生，主要從事茶樹(shù)遺傳育種方面的研究。*通信作者：wangly@tricaas.com