H2S通過(guò)誘導(dǎo)Klotho基因啟動(dòng)子去甲基化改善單側(cè)輸尿管梗阻(UUO)小鼠腎臟纖維化

顧玉露 陳 靜 張 函 沈子妍 徐靈菡 呂詩(shī)琦 章曉燕△

(1復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院腎內(nèi)科 上海 200032; 2上海市腎病與透析研究所 上海 200032;3上海市腎臟疾病與血液凈化重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 上海 200032)

腎臟纖維化是腎組織在慢性持續(xù)性損傷過(guò)程中出現(xiàn)的以腎小球硬化、腎小管萎縮和腎間質(zhì)纖維化為特點(diǎn)的病理性修復(fù)現(xiàn)象[1],是各種慢性腎臟病進(jìn)展為終末期腎臟病的共同途徑[2],而目前仍缺乏有效的治療手段[3]。硫化氫(hydrogen sulfide,H2S)是繼NO和CO之后被發(fā)現(xiàn)的第3種內(nèi)源性氣體信號(hào)分子,具有抗纖維化、抗衰老、抗炎、抗氧化應(yīng)激、調(diào)節(jié)血管活性等多種生物學(xué)功能[4]。研究表明腎臟富含合成H2S的關(guān)鍵酶:胱硫醚-β-合酶(cystathionine β-synthase,CBS)和胱硫醚-γ-裂合酶(cystathionine γ-lyase,CSE)[5]。在多種急慢性腎臟損傷后,腎組織內(nèi)源性H2S生成減少,外源性給予H2S可有效減輕腎臟損傷[4]。且H2S對(duì)于腎臟纖維化的減輕作用已得到證實(shí)[6],但具體機(jī)制仍不清楚。Klotho基因與人類衰老密切相關(guān),已在多種腎臟纖維化動(dòng)物模型中證實(shí),腎臟Klotho低表達(dá)參與腎臟纖維化的發(fā)生發(fā)展[7]。本研究擬通過(guò)建立單側(cè)輸尿管梗阻(unilateral ureteral obstruction,UUO)小鼠模型,觀察外源性給予H2S是否能通過(guò)調(diào)控腎組織Klotho表達(dá)而減輕腎臟纖維化,并探索相關(guān)機(jī)制。

材 料 和 方 法

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及主要試劑 健康6～8周齡C57BL/6雄性小鼠,體質(zhì)量18～23 g,購(gòu)自上海靈暢生物科技有限公司,自由進(jìn)食飲水。NaHS(美國(guó)Sigma公司);抗Klotho抗體、抗DNA甲基轉(zhuǎn)移酶1 (DNA methyltransferase 1,DNMT1)抗體、抗α平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)抗體、抗GAPDH抗體、抗5-羥甲基胞嘧啶 (5-hydroxymethylcytosine,5hmC)抗體(Abcam);抗胱硫醚β合酶(cystathionine-β-synthase,CBS)抗體和抗胱硫醚γ裂合酶(cystathionine-γ-lyase,CSE)抗體(美國(guó)Santa Cruz公司);抗纖連蛋白(fibronectin,FN)抗體(美國(guó)Cell Signaling公司);基因組DNA提取試劑盒(北京天根生化科技有限公司);甲基化DNA檢測(cè)試劑盒(北京百奧萊博科技有限公司);Qiagen Pyro Mark PCR試劑盒和PyroGold試劑盒(QIAGEN);小鼠硫化氫ELISA試劑盒(上海仁捷生物科技有限公司);核蛋白-胞質(zhì)蛋白提取試劑盒(Thermo Scientific);5mC-羥化酶TET活性/抑制分析試劑盒(Epigentek)。

血清H2S濃度測(cè)定 全血標(biāo)本經(jīng)1 000×g離心20 min,取上清即為血清。根據(jù)試劑盒說(shuō)明,每個(gè)樣本取50 μL血清進(jìn)行ELISA檢測(cè)。

腎臟病理分析 腎組織置于4%中性甲醛溶液中固定24 h,常規(guī)石蠟包埋,切片(厚度為4 μm),行HE和Masson染色。光鏡(×200)下觀察Masson染色結(jié)果,每只小鼠隨機(jī)選取10個(gè)不重疊視野,采用ImageJ測(cè)定腎小管間質(zhì)纖維化面積占總面積的百分比。

Western blot檢測(cè) 提取腎臟組織蛋白后BCA法測(cè)蛋白質(zhì)濃度。取20～50 μg總蛋白,經(jīng)6%SDS-PAGE,濕轉(zhuǎn)至PVDF膜上,PVDF膜用5%脫脂奶粉室溫封閉1 h,一抗4 ℃孵育過(guò)夜;TBST洗膜3次,室溫下二抗孵育1 h;ECL發(fā)光顯影。用ImageJ分析條帶灰度值,以GAPDH作為內(nèi)參校正。

免疫組織化學(xué)染色 腎組織切片經(jīng)二甲苯脫蠟和乙醇水化后,微波修復(fù)抗原,10%正常山羊血清封閉,一抗4 ℃孵育過(guò)夜,加入生物素標(biāo)記的二抗在37 ℃孵育15 min,DAB顯色,蘇木精復(fù)染。光鏡下(×200)觀察腎組織切片,胞質(zhì)呈棕黃色為陽(yáng)性。

RT-PCR檢測(cè) 向組織勻漿中加入Trizol,經(jīng)氯仿、異丙醇分離沉淀RNA,溶于DEPC水中,測(cè)RNA濃度。取500 ng RNA,按PrimeScript RT Master Mix試劑盒(TaKaRa)說(shuō)明進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄,用SYBR Premix Ex Taq (TaKaRa)進(jìn)行PCR反應(yīng)。TET1上游引物:5’-TGAAGATGACAAGCAGC-AAACC-3’,TET1下游引物:5’-TTGTTGAGCG-GAAGGTGTGT-3’;TET2上游引物:5’-GACT-CAACGGTTATCAGGCTTTT-3’,TET2下游引物:5’-CATTGCTCTTTATTCTTCCTCT-GTAA-3’;TET3上游引物:5’-CTCCCCTGCTGTCTTC-AGA-3’,TET3下游引物:5’-CCTGAGGCTCTG-TGGAAGTA-3’。

雙加氧酶活性 采用核漿蛋白提取試劑盒提取組織核蛋白并檢測(cè)濃度。取6 μg核蛋白按照5mC-羥化酶TET活性/抑制分析試劑盒說(shuō)明操作,于450和655 nm波長(zhǎng)下讀取吸光度(D)值,計(jì)算公式:TET活性=(D樣品-D空白)×1 000/(6×90)。

焦磷酸測(cè)序 根據(jù)Klotho啟動(dòng)子區(qū)CpG島位置(-431～-401)設(shè)計(jì)引物(上游引物:5’-TGG-GAGAGCTCCCTTTGATGGTTT-3’,下游引物:5’-CCCAAATCAAATTCATTCTCACCTACCTT-T-3’)。測(cè)序引物:5’-AGTGAAGAGTAGGTG-3’。按照DNA提取試劑盒說(shuō)明提取腎組織基因組DNA,測(cè)定DNA濃度,根據(jù)甲基化檢測(cè)試劑盒說(shuō)明對(duì)DNA進(jìn)行亞硫酸鹽修飾,未甲基化的胞嘧啶變成尿嘧啶。修飾后的DNA經(jīng)PCR擴(kuò)增。根據(jù)說(shuō)明使用PyroMark Q96 MD焦磷酸測(cè)序系統(tǒng)對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行定量焦磷酸測(cè)序。某一位點(diǎn)甲基化率為甲基化胞嘧啶占總胞嘧啶的比例,結(jié)果為啟動(dòng)子區(qū)6個(gè)CpG位點(diǎn)的平均值。

羥甲基化DNA免疫共沉淀聯(lián)合實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè) 取2 μg腎組織DNA經(jīng)Bioruptor超聲儀(Diagenode)超聲破碎為200～1 000 bp,取10 μL記為內(nèi)參(input),剩余DNA中加入5hmC一抗4 ℃孵育過(guò)夜;4 ℃下抗體-DNA結(jié)合物與G蛋白磁珠旋轉(zhuǎn)混合過(guò)夜,1×IP緩沖液洗滌3次,向磁珠中加入蛋白酶K和蛋白酶消化緩沖液,50 ℃震蕩孵育3 h,即得到羥甲基化產(chǎn)物。以產(chǎn)物與內(nèi)參為模板,進(jìn)行qPCR擴(kuò)增(結(jié)果以%input表示)。取5 μL PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳。

結(jié) 果

UUO小鼠血清H2S濃度和腎組織H2S合成關(guān)鍵酶表達(dá)的變化 通過(guò)ELISA方法對(duì)UUO造模后第7天小鼠血清H2S濃度進(jìn)行檢測(cè),結(jié)果顯示Sham組和UUO組血清H2S水平分別為(5.18±0.34) nmol/mL和(4.23±0.21) nmol/mL。與Sham組相比,UUO組血清H2S水平顯著降低(P=0.032 5,圖1A)。免疫組化染色結(jié)果顯示,CBS、CSE主要表達(dá)于腎皮質(zhì),梗阻7天后CBS(P=0.002 7)、CSE(P=0.018 0)表達(dá)均顯著下降(圖1B)。Western blot結(jié)果顯示,UUO組腎皮質(zhì)CBS(P=0.000 3)、CSE蛋白表達(dá)較Sham組顯著降低(P=0.001 5,圖1C)。

圖1 UUO小鼠血清H2S濃度和腎組織H2S合成關(guān)鍵酶表達(dá)的變化
Fig 1 Change of the concentration of serum H2S and renal expression of H2S synthetase in mice with UUO

NaHS對(duì)UUO小鼠腎臟Klotho表達(dá)和基因啟動(dòng)子甲基化的影響 免疫組化染色顯示:Klotho主要表達(dá)于腎皮質(zhì),免疫組化染色(圖3A)和Western blot(圖3B)均顯示UUO小鼠梗阻側(cè)腎臟Klotho表達(dá)顯著低于Sham組(P分別為0.001 4和0.001 9),NaHS組Klotho表達(dá)較UUO組顯著升高(P分別為0.000 3和0.002 7)。通過(guò)焦磷酸測(cè)序和hMeDIP-qPCR檢測(cè)各組Klotho基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化和羥甲基化水平,結(jié)果顯示Sham 組、UUO組、NaHS組腎組織Klotho基因甲基化率分別為3.65%±0.26%、11.83%±0.53%和7.39%±0.70%。與Sham組相比,UUO組Klotho甲基化率顯著升高(P<0.0001);與UUO組相比,NaHS組Klotho甲基化率顯著降低(P=0.000 5,圖3C)。Sham組與UUO組Klotho羥甲基化水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,NaHS組Klotho羥甲基化水平顯著高于UUO組(P=0.038 7,圖3D)。

圖2 NaHS減輕UUO小鼠腎臟纖維化
Fig 2 NaHS ameliorates renal tubulointerstitial fibrosis in mice with UUO

討 論

腎臟纖維化是各種病因引起的急慢性腎損傷進(jìn)展為終末期腎臟病的共同通路,其發(fā)生發(fā)展機(jī)制與表觀遺傳修飾密切相關(guān)[8]。H2S可抑制成纖維細(xì)胞增殖與腎上皮細(xì)胞間充質(zhì)轉(zhuǎn)分化,減輕腎臟纖維化,改善腎功能,但具體機(jī)制仍不清楚。本研究通過(guò)建立UUO模型,證實(shí)外源性補(bǔ)充小劑量H2S可通過(guò)升高腎組織TET活性誘導(dǎo)Klotho基因啟動(dòng)子羥甲基化,減輕Klotho基因啟動(dòng)子甲基化而上調(diào)Klotho表達(dá),從而改善UUO小鼠腎臟纖維化。

圖3 NaHS對(duì)UUO小鼠腎臟Klotho表達(dá)和基因啟動(dòng)子甲基化的影響
Fig 3 Effects of NaHS on expression of renal Klotho and methylation level inKlothopromoter region in mice with UUO

圖4 NaHS誘導(dǎo)腎組織Klotho基因啟動(dòng)子去甲基化的機(jī)制
Fig 4 Mechanism of NaHS inducing hydroxymethylation in renalKlothopromoter region

UUO模型是以腎小管間質(zhì)纖維化為特點(diǎn)的腎損傷模型。通過(guò)對(duì)C57BL/6小鼠進(jìn)行單側(cè)輸尿管結(jié)扎,既往研究[9]和本實(shí)驗(yàn)均發(fā)現(xiàn)小鼠腎小管間質(zhì)損傷伴有膠原纖維沉積和間質(zhì)增寬,證明UUO模型成功。同時(shí)我們發(fā)現(xiàn),UUO小鼠血清H2S濃度下降,腎組織內(nèi)源性H2S合成關(guān)鍵酶CBS和CSE表達(dá)降低。這種現(xiàn)象也在多種腎臟纖維化動(dòng)物模型中得到證實(shí)[6],還有研究證實(shí)CSE基因敲除可加重輸尿管梗阻引起的腎臟損傷[10]。既往研究與我們的結(jié)果均證實(shí)外源性小劑量補(bǔ)充H2S可顯著減輕腎臟纖維化[6]。以上研究結(jié)果說(shuō)明腎臟纖維化的發(fā)生發(fā)展與內(nèi)源性H2S缺乏密切相關(guān)。

Klotho可通過(guò)抑制促纖維化相關(guān)蛋白表達(dá)、RAS系統(tǒng)、TGF-β/Smad通路和Wnt/β-catenin通路等多種機(jī)制而發(fā)揮其抗腎臟纖維化的作用[11-14]。Klotho缺乏可引起腎臟纖維化,而Klotho過(guò)表達(dá)或外源性補(bǔ)充Klotho可減輕腎臟纖維化[15]。DNA甲基化是一種調(diào)節(jié)基因表達(dá)的重要表觀遺傳方式,由DNMTs將S-腺苷甲硫氨酸的甲基團(tuán)轉(zhuǎn)移至胞嘧啶的第5位C原子上,從而形成5-甲基胞嘧啶,且啟動(dòng)子區(qū)發(fā)生甲基化可沉默基因轉(zhuǎn)錄[16-17]。Klotho表達(dá)與其啟動(dòng)子甲基化狀態(tài)密切相關(guān),啟動(dòng)子超甲基化可沉默Klotho表達(dá)。既往研究提示腎臟Klotho基因啟動(dòng)子甲基化是腎臟Klotho低表達(dá)的重要機(jī)制,Klotho基因啟動(dòng)子區(qū)的CpG島可在DNMT1作用下發(fā)生甲基化,沉默Klotho表達(dá)而參與腎臟纖維化的發(fā)生[18-19]。腎臟纖維化患者和多種腎臟纖維化動(dòng)物模型腎組織中均發(fā)現(xiàn)Klotho啟動(dòng)子超甲基化,且與腎臟纖維化嚴(yán)重程度呈正相關(guān)[19-20]。本研究發(fā)現(xiàn)UUO小鼠腎組織Klotho表達(dá)明顯降低,同時(shí)伴有Klotho基因啟動(dòng)子甲基化水平顯著升高,而補(bǔ)充H2S可升高Klotho基因啟動(dòng)子羥甲基化水平而降低Klotho基因啟動(dòng)子甲基化水平,同時(shí)上調(diào)Klotho表達(dá)。此結(jié)果提示,H2S可通過(guò)誘導(dǎo)Klotho基因啟動(dòng)子去甲基化水平而上調(diào)Klotho表達(dá),改善腎臟纖維化。

研究證實(shí),體細(xì)胞中的DNA甲基化是一個(gè)可逆的過(guò)程,DNA雙加氧酶TET蛋白家族能夠催化DNA中的5-甲基胞嘧啶氧化成為5-羥甲基胞嘧啶,從而完成DNA的主動(dòng)去甲基化過(guò)程[21]。文獻(xiàn)報(bào)道TET1、TET2和TET3在腎臟均有表達(dá)[22]。我們推測(cè)NaHS可能通過(guò)TET依賴的方式調(diào)控Klotho基因啟動(dòng)子甲基化水平,為證明這一推測(cè),我們檢測(cè)了各組腎組織TET1、TET2和TET3的表達(dá)水平。結(jié)果顯示UUO組TET1、TET2和TET3表達(dá)均顯著高于Sham組,這可能是由于機(jī)體為維持體內(nèi)甲基化和羥甲基化水平相對(duì)平衡而出現(xiàn)的代償性結(jié)果,而補(bǔ)充H2S后并不能上調(diào)UUO小鼠腎臟TET1、TET2和TET3的表達(dá)。由于TET發(fā)揮羥甲基化作用依賴酶的催化活性,我們檢測(cè)了各組腎組織TETs活性,發(fā)現(xiàn)雖然UUO小鼠腎組織TETs蛋白質(zhì)水平上調(diào),但其活性顯著低于Sham組,因此Klotho羥甲基化水平仍處于較低水平,而外源性補(bǔ)充H2S后TET活性明顯升高,Klotho羥甲基化水平相應(yīng)顯著升高。以上結(jié)果說(shuō)明H2S主要通過(guò)調(diào)節(jié)TET活性而非其表達(dá)量調(diào)控Klotho基因啟動(dòng)子的甲基化水平。另一方面,由于H2S可下調(diào)UUO小鼠腎臟DNMT1,減輕Klotho甲基化水平,因此給予NaHS治療的UUO小鼠腎臟TET升高不如UUO組明顯。

本研究存在一些局限性:(1)由于NaHS是H2S的一種快釋放劑,難以在體內(nèi)維持長(zhǎng)效、穩(wěn)定的生理濃度,因此我們使用的NaHS劑量高于文獻(xiàn)劑量;且目前檢測(cè)體內(nèi)H2S濃度的方法不同,檢測(cè)值也不同,因此生理性H2S濃度仍需進(jìn)一步確認(rèn)。(2)由于腎臟組織成分較為復(fù)雜,大多數(shù)文獻(xiàn)只觀察腎臟組織TET的轉(zhuǎn)錄水平表達(dá)情況,我們也僅檢測(cè)了TET mRNA表達(dá)水平。(3)由于缺乏有效的方法檢測(cè)TET各蛋白質(zhì)的酶活性,H2S是通過(guò)調(diào)控哪種或哪幾種TET酶活性尚不明確。

綜上所述,本研究證實(shí)外源性補(bǔ)充小劑量H2S可通過(guò)調(diào)節(jié)TET活性調(diào)控Klotho基因啟動(dòng)子的甲基化水平,誘導(dǎo)Klotho基因啟動(dòng)子去甲基化,上調(diào)Klotho表達(dá)而減輕腎臟纖維化。外源性補(bǔ)充小劑量H2S是一種很有前景的抗腎臟纖維化的治療手段。關(guān)于H2S調(diào)控TET活性的機(jī)制將在后續(xù)的實(shí)驗(yàn)中進(jìn)行深入研究。