響應(yīng)面法優(yōu)化雞α干擾素工程菌發(fā)酵培養(yǎng)基

陳 瓊， 曹 丁， 昝繼清， 李學(xué)優(yōu)， 秦 鵬， 黃秀敏， 張宜靖

（廣州市微生物研究所，廣東廣州 510663）

畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)是一類較早被人類成功改造、高效表達(dá)外源蛋白的系統(tǒng)，利用該系統(tǒng)表達(dá)外源基因具有良好的應(yīng)用前景，是實(shí)現(xiàn)外源蛋白大規(guī)模生產(chǎn)進(jìn)而推動其實(shí)現(xiàn)商品化的重要方法（Yu等，2018）。干擾素（IFN）是一類能誘導(dǎo)人及動物細(xì)胞產(chǎn)生多種廣譜抗病毒蛋白的類激素蛋白，具有抗病毒、抗腫瘤和免疫調(diào)節(jié)等功能。目前禽類干擾素發(fā)展滯后于哺乳動物干擾素，存在著生產(chǎn)成本過高，表達(dá)效價低，養(yǎng)殖業(yè)對其用量大，難以實(shí)現(xiàn)規(guī)?；a(chǎn)等問題（王秀麗等，2017）。

本研究前期已構(gòu)建并篩選出雞α干擾素表達(dá)量高的畢赤酵母重組菌株，為改進(jìn)干擾素生產(chǎn)工藝，解決搖瓶配方成本高、效價低的問題，本研究采用單因素試驗(yàn)和響應(yīng)面法對畢赤酵母重組菌在搖瓶水平發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行優(yōu)化，以期獲得低成本高表達(dá)量的發(fā)酵工藝條件，加快雞α干擾素規(guī)模化生產(chǎn)的步伐。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器 重組畢赤酵母：廣東省微生物種質(zhì)資源庫保存提供；酵母提取物、胰蛋白胨（進(jìn)口）：OXOID公司；玉米漿干粉：山東康源生物科技有限公司；酵母基礎(chǔ)氮源培養(yǎng)基（YNB）：上海生工生物股份有限公司；PTM1鹽：上海瑞楚生物科技有限公司；葡萄糖、K2SO4、MgSO4等試劑均為國產(chǎn)分析純。752N紫外可見分光光度計：上海儀電分析儀器有限公司；PHS-3C pH計：上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司；SMART顯微鏡：重慶奧特光學(xué)儀器有限責(zé)任公司；LRH-250生化培養(yǎng)箱：上海一恒科學(xué)儀器有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 培養(yǎng)基的配制 YPD培養(yǎng)基：1%酵母提取物、2% 蛋白胨、2% 葡萄糖。發(fā)酵培養(yǎng)基：3%葡萄糖、1%酵母提取物、2%蛋白胨、1.8%K2SO4、1.5%MgSO4、0.1%CaSO4、0.5%KH2PO4、0.15%KOH、pH 6.0、PTM1 鹽 4.4 mL/L。

1.2.2 菌種搖瓶培養(yǎng) 將畢赤酵母從初始培養(yǎng)基平板接種至50 mL YPD搖瓶，30℃、180 r/min培養(yǎng)24 h。從YPD搖瓶以2%的接種量接至發(fā)酵培養(yǎng)基，于30℃、180 r/min培養(yǎng)48 h，取適量發(fā)酵液測定濕重。

1.2.3 培養(yǎng)基成分優(yōu)化

1.2.3.1 不同碳源對畢赤酵母濕重的影響 將初始培養(yǎng)基中的碳源分別替換為甘油、葡萄糖、蔗糖、糖蜜和乳糖（濃度均為3%），設(shè)置不加碳源為對照組，其他成分不變。在相同培養(yǎng)條件下?lián)u瓶發(fā)酵，測定菌體濕重。

1.2.3.2 不同氮源對畢赤酵母濕重的影響 根據(jù)碳源篩選試驗(yàn)的結(jié)果，選取甘油作為碳源進(jìn)行氮源優(yōu)化試驗(yàn)。將初始培養(yǎng)基中的氮源分別替換為玉米漿干粉、YNB、NH4H2PO4、酵母提取物、蛋白胨、（NH4）2SO4和 NH4Cl（濃度均為 3%），設(shè)置不加氮源為對照組，其他成分不變。在相同培養(yǎng)條件下?lián)u瓶發(fā)酵，測定菌體濕重。

1.2.4 Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計 Plackett-Burman設(shè)計是通過對可能影響響應(yīng)值的每個因子取高低兩個水平來進(jìn)行分析，通過比較各個因子兩水平的差異與整體的差異來確定因子的顯著性。利用Minitab軟件，對發(fā)酵培養(yǎng)基的8個因素進(jìn)行Plackett-Burman組合設(shè)計，各個因素及水平如表1所示，其中“-”和“+”分別表示因素的低水平和高水平（胡瑞萍等，2018）。以菌體濕重（Y）作為試驗(yàn)的響應(yīng)值，共進(jìn)行12組試驗(yàn)，考察各個因素的主效應(yīng)和交互效應(yīng)的一級作用，從中篩選出對菌體濕重具有顯著作用的3個因素。

表1 Plackett-Burman設(shè)計各因素及其水平

1.2.5 最陡爬坡試驗(yàn) 響應(yīng)面擬合方程只在考察的緊接鄰域里才充分近似真實(shí)情形，在其他區(qū)域擬合方程與被近似的函數(shù)方程毫無相似之處，幾乎無意義。因此，要先逼近最佳值區(qū)域后才能建立有效的響應(yīng)面擬合方程。因此通過最陡爬坡法以試驗(yàn)值變化的梯度方向?yàn)榕榔路较?，根?jù)Plackett-Burman試驗(yàn)結(jié)果中顯著因素效應(yīng)值的大小確定變化步長，確定響應(yīng)面的中心點(diǎn)和最大值范圍（姚兵莉等，2018）。

1.2.6 Box-Behnken響應(yīng)面優(yōu)化 根據(jù)上述最陡爬坡試驗(yàn)結(jié)果，3個因素的水平已在最優(yōu)點(diǎn)附近，可以此濃度為中心點(diǎn)采用Box-Behnken響應(yīng)面試驗(yàn)建立模型，選取3個因素，如表2所示。將因素對響應(yīng)值的關(guān)系通過擬合二次方程，來對發(fā)酵培養(yǎng)基作進(jìn)一步的優(yōu)化，以尋求最優(yōu)值。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同碳源對畢赤酵母濕重的影響 由表3可知，培養(yǎng)基中未添加碳源，嚴(yán)重影響畢赤酵母的發(fā)酵水平。當(dāng)添加不同碳源時，畢赤酵母濕重均有一定程度的提高，最佳碳源為甘油，此時菌體濕重最高達(dá)到81.5 g/L；其次是糖蜜，葡萄糖。

表2 Box-behnken試驗(yàn)設(shè)計各因素水平及其編碼值

表3 不同碳源對畢赤酵母濕重的影響

2.2 不同氮源對畢赤酵母濕重的影響 表4的結(jié)果顯示，蛋白胨和NH4H2PO4生物量比較接近，但有機(jī)氮源成本相對較高，且不利于后期純化，因此選擇NH4H2PO4作為氮源進(jìn)行下一步試驗(yàn)。

表4 不同氮源對畢赤酵母濕重的影響

2.3 Plackett-Burman試驗(yàn)結(jié)果與分析 Plackett-Burman試驗(yàn)由軟件Minitab設(shè)計，共8個因素1個虛擬變量12次試驗(yàn)。各因素對菌體濕重的具體影響依然采用Minitab軟件進(jìn)行分析，對顯著性水平大于95%作為重要因素。

由表5、表6和表7結(jié)果分析可得：在α=0.05水平上，甘油含量對響應(yīng)值影響較大，且效應(yīng)能力由強(qiáng)到弱排序分別為甘油、NH4H2PO4、初始pH、CaSO4。初始pH、甘油含量對生物量具有正促進(jìn)作用，需適當(dāng)增加，NH4H2PO4對生物量具有負(fù)促進(jìn)效果，應(yīng)適當(dāng)減少，可使生物量增加。R-Sq=99.48%＞75%，說明該模型線性關(guān)系良好，回歸顯著，符合實(shí)際，是可信的。

2.4 最陡爬坡試驗(yàn)結(jié)果與分析 最陡爬坡試驗(yàn)設(shè)計及結(jié)果見表8。隨著甘油、NH4H2PO4和初始pH的變化，五組不同配方培養(yǎng)基中菌體濕重先升高后降低。在甘油濃度4.4%、NH4H2PO4濃度1.6%、初始pH 7.0時，菌體濕重達(dá)到最大值為162.9 g/L，以此作為后續(xù)試驗(yàn)中心點(diǎn)進(jìn)行響應(yīng)面分析。

2.5 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果與分析 根據(jù)Boxbehnken試驗(yàn)結(jié)果 （表9），利用軟件Design Ex-pert對其進(jìn)行回歸分析，其回歸方程為：Y=161.30-0.1125X1-1.35X2-2.6125X3-5.825X1X2+1.05X1X3+2.275X2X3+6.15X12+0.675X22-10.5X32。經(jīng)過軟件分析，經(jīng)F值檢驗(yàn)，檢驗(yàn)P值越小，則變量的顯著性越高。由表10可知，該回歸模型（P＜ 0.0001）極顯著，模型失擬項(xiàng)（P=0.2754）為不顯著，說明本模型的整個回歸區(qū)域擬合較好。模型的相關(guān)系數(shù)R2=0.9961，校正系數(shù)RAdj2=0.9481，表明該回歸方程能很好的模擬預(yù)測真實(shí)的響應(yīng)值。該方程中 X2、X3、X1X2、X2X3、X12、X32（P ≤ 0.01）對濕重影響為極顯著；X1X3（0.01＜P ≤ 0.05）對濕重影響為顯著。

表5 Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計及結(jié)果

表6 Plackett-Burman試驗(yàn)各因素對響應(yīng)值的估計效應(yīng)及系數(shù)

表7 生物量（g/L)的方差分析

表8 最陡爬坡試驗(yàn)設(shè)計及菌體濕重

表9 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計及結(jié)果

表10 響應(yīng)面回歸方程的顯著性及方差分析

利用軟件Design Expert考察各因素及其相互作用對酵母濕重的影響，保持其他因素不變，獲得任意兩個因素及其相互作用對濕重的響應(yīng)曲面圖。由圖1、2、3可判斷，等高線為橢圓狀，各因素之間具有明顯的交互作用，響應(yīng)面弧度不明顯，說明范圍選擇較小（甘祥武等，2018）。

圖1 甘油與pH交互影響

圖2 磷酸二氫銨與pH交互影響

根據(jù)軟件，進(jìn)行最高濕重預(yù)測，當(dāng)X1為1，X2為-1，X3為-0.182， 即甘油濃度為 46 g/L，NH4H2PO4為 14 g/L，初始 pH為 6.96時，酵母濕重達(dá)到最高值，為175.54 g/L。

3 結(jié)論

圖3 磷酸二氫銨與甘油交互影響

本文采用響應(yīng)面法優(yōu)化高產(chǎn)雞α干擾素畢赤酵母重組菌發(fā)酵培養(yǎng)基，通過碳源、氮源的篩選，Plackett-Burman試驗(yàn)，最陡爬坡試驗(yàn)綜合響應(yīng)面建模，確定最佳培養(yǎng)基配方為：甘油 46 g/L，NH4H2PO414 g/L，K2SO418 g/L，MgSO415 g/L，Ca-SO41.0 g/L，KH2PO45 g/L，KOH 1.5 g/L， 初始 pH 6.96，PTM1鹽4.4 mL/L。在此條件下，畢赤酵母發(fā)酵濕重為175.54 g/L，生物量比優(yōu)化前提高了50%，并且培養(yǎng)基組分成本低廉，成分簡單，方便調(diào)控和后期分離純化，適合大規(guī)模發(fā)酵生產(chǎn)。