潑河水庫(kù)底泥中細(xì)菌群落的調(diào)查

田海軍，付朝輝

（信陽(yáng)農(nóng)林學(xué)院水產(chǎn)學(xué)院，河南省漁業(yè)生物工程技術(shù)研究中心，河南 信陽(yáng) 464000）

湖泊生態(tài)系統(tǒng)在全球及區(qū)域地球化學(xué)循環(huán)中都發(fā)揮著重要的作用，而細(xì)菌作為有機(jī)化合物的主要分解者，調(diào)節(jié)水體環(huán)境，實(shí)現(xiàn)水質(zhì)的凈化，并在一定程度上反應(yīng)水體污染特征及其生態(tài)功能演變，因此細(xì)菌在湖泊生態(tài)系統(tǒng)中的作用日益受到重視，研究細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)和多樣性，對(duì)了解群落結(jié)構(gòu)間的動(dòng)態(tài)變化及生態(tài)功能、闡明群落與環(huán)境，功能間的具體聯(lián)系以及維護(hù)湖泊生態(tài)環(huán)境具有重要意義，同時(shí)也為水產(chǎn)品的安全養(yǎng)殖提供參考[1]。隨著分子生物學(xué)的理論與技術(shù)的發(fā)展，本研究將從分子水平上利用16S rRNA基因文庫(kù)技術(shù)分析研究潑河水庫(kù)底泥細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)特點(diǎn)[2]。

潑河水庫(kù)地處大別山北麓，坐落在淮河水系右支潑陂河上，在大別山北麓由深山向淺山丘陵地區(qū)延伸的過(guò)渡地帶，距光山縣潑陂河鎮(zhèn)3km，流域面積達(dá)到222km2，總庫(kù)容2.35億m3。潑河水庫(kù)地理位置獨(dú)特，南北分別距新縣、光山縣城各25km，潑河水庫(kù)風(fēng)景區(qū)地，集豫南山水田園風(fēng)光于一身，風(fēng)景區(qū)內(nèi)林木蔥郁，層巒疊翠，綠樹成蔭，多為天然次森林和人工林及散生亞熱帶經(jīng)濟(jì)林，潑河水庫(kù)漁業(yè)資源豐富，目前已發(fā)現(xiàn)有20余種經(jīng)濟(jì)魚類，景區(qū)自然景觀與人文景觀相映成趣，是難得的自然、生態(tài)旅游和休閑度假好去處。

潑河水庫(kù)氣候處于秦嶺淮河氣溫分界線上，屬亞熱帶向暖溫帶過(guò)渡區(qū)，氣候溫暖，四季分明，陽(yáng)光充足、雨量充沛、植被茂盛。水庫(kù)流域上游山巒起伏連綿、峰高谷深、河溪交錯(cuò)。風(fēng)景區(qū)內(nèi)林木蔥郁，層巒疊翠，綠樹成蔭，多為天然次森林和人工林及散生亞熱帶經(jīng)濟(jì)林。森林覆蓋率達(dá)75%。野生鳥類有貓頭鷹、啄木鳥、山雞、野鴨、白鷺等二十余種，野生動(dòng)物有黃羊、野豬、野兔、刺猬和松鼠等，主要特產(chǎn)有茶葉、板栗、銀杏、蓮子和山野菜。潑河水庫(kù)漁業(yè)資源豐富，目前已發(fā)現(xiàn)經(jīng)濟(jì)魚類有30多種，除花鰱、白鰱、青魚、草魚四大家魚外，還有鯽、鯉、黑魚、桂魚、銀魚、武昌魚等，主要商品魚類為花鰱、白鰱、鯽、鯉和蒙古紅鲌，其中野生魚類黃尾鲴為水庫(kù)獨(dú)特商品魚類。

潑河水庫(kù)流域面積廣闊，春夏季氣候溫暖濕潤(rùn)，儲(chǔ)藏豐富的魚類資源，盛產(chǎn)淡水魚類，種類、數(shù)量頗多。水底存在大量豐沃的底泥，為研究細(xì)菌群落的多樣性提供絕佳地點(diǎn)。水質(zhì)對(duì)于魚的生長(zhǎng)至關(guān)重要，而底泥中的微生物對(duì)水質(zhì)的變化有舉足輕重的作用且細(xì)菌群落參與自然界物質(zhì)循環(huán)和能量流動(dòng)，因此研究潑河水庫(kù)底泥中細(xì)菌群落的多樣性和豐富度就尤為重要。

1 材料與方法

1.1 樣品底泥的采集

材料為潑河水庫(kù)在2017年5月份和9月份以及2018年3月份三次在潑河水庫(kù)底泥，分別為下圖1中1#、2#、3#即從上游到下游的三處位置，所有的采樣點(diǎn)均使用定位系統(tǒng)GPS進(jìn)行定位，2017年5月份和9月份以及2018年3月份在潑河水庫(kù)從上游到下游使用采泥器采集水庫(kù)表層底泥，另外每個(gè)采樣點(diǎn)同時(shí)采集3個(gè)平行底泥樣品，然后放在干凈的聚乙烯薄膜袋里等待測(cè)試[3]。

圖1 潑河水庫(kù)底泥樣品采樣點(diǎn)Fig.1 Sampling point of mud samples from Pohe Reservoir

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 底泥樣品中細(xì)菌總DNA的提取及16SrRNA基因PCR擴(kuò)增

先完成基因組DNA的抽取，之后利用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)抽提的基因組DNA，按照指定的測(cè)序區(qū)域，合成帶有barcode的特異引物。PCR采用ABI GeneAmp9700型，全部樣品按照正式實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行，每個(gè)樣品3次重復(fù)，將同一樣品的PCR產(chǎn)物混合后用2%的瓊脂凝膠電泳檢測(cè)，使用AxyPrep DNA凝膠回收試劑盒（AXYGEN公司）切膠回收PCR產(chǎn)物，Tris-HCl洗脫；2%瓊脂電泳檢測(cè)。

1.2.2 高通量測(cè)序及數(shù)據(jù)分析

高通量測(cè)序技術(shù)是對(duì)傳統(tǒng)測(cè)序一次革命性改變，一次可以對(duì)幾十萬(wàn)到幾百萬(wàn)條DNA分子進(jìn)行序列測(cè)定[5]。將PCR產(chǎn)物用QuantiFluorTM-ST藍(lán)色熒光定量系統(tǒng)（Promega公司）進(jìn)行檢測(cè)定量，之后按照每個(gè)樣品的測(cè)序量要求，進(jìn)行相應(yīng)比例的混合。連接“Y”字形接頭，使用磁珠篩選去除接頭自連片段，利用PCR擴(kuò)增進(jìn)行文庫(kù)模板的富集，氫氧化鈉變性，產(chǎn)生單鏈DNA片段。由美吉生物科技公司上機(jī)測(cè)序，得出數(shù)據(jù)報(bào)告，繼而進(jìn)行后續(xù)分析。

表1 潑河水庫(kù)各采樣點(diǎn)自然概況Tab.1 Natural overview of each sampling point in Pohe Reservoir

2 結(jié)果與分析

2.1 測(cè)序情況和多樣性指數(shù)

OTU（Operational Taxonomic Units）是在系統(tǒng)發(fā)生學(xué)或者群體遺傳學(xué)研究中，為了便于分析，人為的給某一個(gè)分類單元設(shè)置同一個(gè)標(biāo)志，表2中的1-1#、1-2#、1-3#，分別代表第一次采樣的 1 號(hào)、2 號(hào)、3號(hào)點(diǎn)，然后以此類推分別是第二次、第三次的采樣點(diǎn)[6]。該指數(shù)實(shí)際反映了本次測(cè)序結(jié)果是否代表樣本的真實(shí)情況，由表2可知，Coverage數(shù)值較高都在90%以上，Shannon是香濃指數(shù)用來(lái)估算樣品中微生物的多樣性指數(shù)之一[7]。它與Simpson多樣性指數(shù)均為常用的反映微生物多樣性的指數(shù)，Simpson是辛普森指數(shù)來(lái)估算樣品中微生物的多樣性指數(shù)之一，在生態(tài)學(xué)中常用來(lái)定量的描述一個(gè)區(qū)域的生物多樣性。從本表中看到辛普森指數(shù)較低說(shuō)明測(cè)試樣品中微生物群落多樣性比較高。

圖2 潑河泥香濃指數(shù)Fig.2 Sprinkling incense index

Shannon指數(shù)用于反應(yīng)樣品中微生物群落的多樣性（圖2），受樣品群落中物種豐富的和物種均勻度的影響，Shannon數(shù)值越大，就越表明樣品中物種越豐富，Shannon指數(shù)越小，則表明樣品中物種豐富度越低。如圖2所示，當(dāng)隨機(jī)抽取的測(cè)序條數(shù)大于5000時(shí)，Shannon指數(shù)走勢(shì)平穩(wěn)，表示其測(cè)序得到的數(shù)據(jù)以及物種覆蓋面足夠，基本能反應(yīng)出樣品中微生物的基本信息[8]，而且通過(guò)表2的Shannon指數(shù)可以直觀的看出，在不同的樣品中底泥細(xì)菌的多樣性：3-3#＞1-1#＞3-1#＞2-1#＞2-3#＞2-2#＞3-2#＞1-2#＞1-3#。

2.2 群落結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)分析

為了得到每個(gè)OTU對(duì)應(yīng)的物種分類信息，本研究采用了RDP classifier貝葉斯算法對(duì)97%相似水平的OTU序列進(jìn)行分類學(xué)分析得出群落結(jié)構(gòu)圖（表3），在這個(gè)表中為了研究方便將上面表1由屬的水平進(jìn)一步合并到目的水平。由表3可知，一共有67個(gè)目，其中Others代表將其他比較少的目合并成一個(gè)目。由表2可知，在不同的樣品中各種目的細(xì)菌所占的比例，12個(gè)樣品物種組成共覆蓋45種，其中厭氧繩菌目Anaerolineaceae_uncultured，黃單胞菌目Xanthomonadales_uncultured為優(yōu)勢(shì)種群。

圖3的柱形圖是將表2的數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換成柱形圖，從中可以直觀的不同的底泥樣品中不同種類的細(xì)菌所占的比例。

表2 測(cè)序情況和多樣性指數(shù)表Tab.2 Sequencing and diversity index tables

表3 細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)分析表Tab.3 Analysis of bacterial community structure

續(xù)表3

圖3 群落結(jié)構(gòu)柱形圖Fig.3 Community structure column chart

圖4 OUT分布韋恩圖Fig.4 Venn diagram of OUT distribution

2.3 底泥細(xì)菌季度差異情況分析

Venn圖用于統(tǒng)計(jì)樣品間所共有以及獨(dú)有的OTU數(shù)目，由圖4可以直觀的比較出樣品中OTU數(shù)目組成的相似性以及重疊情況?，F(xiàn)在以不同季度在細(xì)菌科的分類水平上進(jìn)行分析，2017年5月樣品中共檢測(cè)到210個(gè)物種，其中特有的物種有5種；2017年9月份共檢測(cè)出217個(gè)物種，其中特有物種12種，和2017年5月份共有的物種一共197種；2018年3月樣品中共檢測(cè)出226種，和2017年9月份共有的物種一共有200種。同時(shí)也可以看出在這三個(gè)不同的時(shí)間段內(nèi)共有的物種有192種，其中第一次和第二次和第三次所特有的OTU數(shù)目分別為5、12、18，第三次采樣的底泥中特有的OTU最多，預(yù)示著有比較多的特有細(xì)菌。

2.4 底泥細(xì)菌空間差異分析

圖5是將三次采樣同一個(gè)位點(diǎn)的放在一起，來(lái)分析同一個(gè)采樣點(diǎn)在不同的時(shí)間段里細(xì)菌種類組成的特點(diǎn)。由圖5可知1#采樣點(diǎn)和2#采樣點(diǎn)在三個(gè)不同的時(shí)間段內(nèi)共有的細(xì)菌種類有201種，1#采樣點(diǎn)特有細(xì)菌種類16種，2#采樣點(diǎn)特有種類12種，3#采樣點(diǎn)特有細(xì)菌種類10種，三個(gè)采樣點(diǎn)共有細(xì)菌種類189種。2.5 理化指標(biāo)分析

典范對(duì)應(yīng)分析方法主要是用于環(huán)境變量和物種帆布關(guān)系的解析，能很好地幫助我們研究由定性變量的交互匯總表來(lái)揭示變量間的聯(lián)系[10]，交互表的信息以圖形的方式展示。常用于多個(gè)類別的定類變量，可以揭示同一個(gè)變量的各個(gè)類別之間的差異，以及不同變量各個(gè)類別之間的對(duì)應(yīng)關(guān)系，多用于兩個(gè)或者多個(gè)定類變量。

可以從各個(gè)采樣點(diǎn)的中心點(diǎn)向任意的一項(xiàng)理化指標(biāo)所在的向量做垂線，例如如果從圖6所有的9個(gè)采樣點(diǎn)做垂線到SD所在的向量，可以看出垂點(diǎn)越靠近SD（透明度）向量正方向的表示這個(gè)采樣點(diǎn)和 SD 的相關(guān)性越強(qiáng)，分別是 2-2#＞1-2#＞3-2#＞2-1#＞1-1#＞1-3#＞3-3#＞2-3#＞3-1#，另外從各個(gè)向量的夾角來(lái)看，當(dāng)從中心向任意兩個(gè)點(diǎn)做向量的時(shí)候，如果夾角是銳角的話那就表示這兩個(gè)指標(biāo)具有相關(guān)性，銳角越小說(shuō)明相關(guān)性越大，如pH和T的夾角是銳角，而且角度比較小那么說(shuō)明這兩個(gè)指標(biāo)是具有相關(guān)性的，同樣T和DO夾角是銳角也有比較強(qiáng)相關(guān)性，而SD和TP（總磷）在圖中可以看到夾角為鈍角，那么說(shuō)明SD和TP這兩個(gè)指標(biāo)之間沒(méi)有相關(guān)性，第三從各個(gè)指標(biāo)距離中心點(diǎn)的位置看，越靠近中心，越?jīng)]有特征，越遠(yuǎn)離中心，說(shuō)明特征越明顯，從圖中可以看到TP距離中心點(diǎn)最遠(yuǎn)，說(shuō)明TP特征最強(qiáng)也就是說(shuō)TP對(duì)這九個(gè)采樣點(diǎn)最重要，而COD（化學(xué)需氧量）距離中心最近說(shuō)明COD在這9個(gè)樣品中特征不明顯。

3 討論

底泥微生物群落是湖泊生態(tài)系統(tǒng)的重要組成部分，是促進(jìn)生態(tài)養(yǎng)殖系統(tǒng)新陳代謝的重要參與者，底泥細(xì)菌的存在對(duì)于凈化水體，改良池底生態(tài)環(huán)境，疾病防控等方面都具有重要的作用。我國(guó)目前對(duì)底泥中細(xì)菌的研究也不多。研究底泥細(xì)菌的情況，對(duì)了解底泥細(xì)菌的組成和種類分布，了解群落結(jié)構(gòu)間的動(dòng)態(tài)變化及生態(tài)功能，維護(hù)湖泊生態(tài)環(huán)境具有積極意義。潑河水底存在大量豐沃的底泥，為研究細(xì)菌群落的多樣性提供絕佳地點(diǎn)。水質(zhì)對(duì)于魚的生長(zhǎng)至關(guān)重要，而底泥中的微生物對(duì)水質(zhì)的變化有舉足輕重的作用且細(xì)菌群落參與自然界物質(zhì)循環(huán)和能量流動(dòng)。不同時(shí)間段由于湖泊生態(tài)系統(tǒng)的選擇作用，潑河水庫(kù)底泥細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)是有變化的。

（1）從潑河水庫(kù)樣品的測(cè)序情況來(lái)看，所有樣品的香濃指數(shù)都比較高，辛普森指數(shù)都較低，這些共同說(shuō)明了潑河水庫(kù)在2017年5月、9月和2018年3月時(shí)間段內(nèi)潑河水庫(kù)底泥中細(xì)菌群落具有很高的多樣性細(xì)菌的群落組成很豐富。

（2）潑河水庫(kù)底泥細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)組成在檢測(cè)的三個(gè)時(shí)間段內(nèi)是有較大差異的，在2017年5月采樣的樣品中特有的物種有5種所占樣品中比例為5%，2017年9月份特有物種12種所在樣品中比例為4.8%，2018年3月特有物種13種所占比例7.3%，說(shuō)明在不同的時(shí)間段內(nèi)潑河水庫(kù)底泥細(xì)菌群落發(fā)生了演替。在時(shí)間分布上，潑河水庫(kù)底泥細(xì)菌群落數(shù)量最高值出現(xiàn)在2018年3月份，最小值出現(xiàn)在2017年5月份，而在王曉丹等[11]在北京密云山水庫(kù)的研究中，7月份細(xì)菌總數(shù)達(dá)到最大值，這可能是受到研究水域的緯度和其它物理因素的影響，另一方面，可能是水庫(kù)生態(tài)環(huán)境的不同以及細(xì)菌種類差別導(dǎo)致了群落數(shù)量最高值出現(xiàn)時(shí)間的差別。

（3）從典范對(duì)應(yīng)分析中得知，潑河水庫(kù)中的DO和T、T和pH、DO和TP，指標(biāo)之間具有相關(guān)性且關(guān)系密切互相影響，而SD和COD指標(biāo)之間相互關(guān)系最弱幾乎沒(méi)有，最后TP是對(duì)細(xì)菌的組成最重要的指標(biāo)。錢瑋等研究發(fā)現(xiàn)總氮（TN）、總磷（TP）、總有機(jī)碳對(duì)太湖底泥細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的影響最大，其次是總磷（TP）和總有機(jī)碳（TOC）[12]。

（4）研究發(fā)現(xiàn)，在2017年5月、9月和2018年3月三次采樣三個(gè)時(shí)間段內(nèi)在科的分類水平上共有192種細(xì)菌，所占比例為77.4%，說(shuō)明潑河水庫(kù)中至少七成的細(xì)菌是長(zhǎng)期固定不變的。這說(shuō)明潑河水庫(kù)底泥擁有穩(wěn)定的特性，考慮到底泥細(xì)菌生活的特殊環(huán)境，即遠(yuǎn)離表層水體，以及水深程度的相關(guān)因素，底泥細(xì)菌生長(zhǎng)環(huán)境遠(yuǎn)離表層，不容易受到水體水質(zhì)變化的影響。潑河水庫(kù)3個(gè)采樣點(diǎn)12個(gè)樣品物種組成共覆蓋45種，其中厭氧繩菌目Anaerolineaceae_uncultured，黃單胞菌目Xanthomonadales_uncultured為優(yōu)勢(shì)種群。成敏玲研究東湖不同富營(yíng)養(yǎng)化區(qū)域底泥的優(yōu)勢(shì)種群，官橋湖區(qū)為脫氯單胞菌屬Dechloromonas、Desulfatiglans和硫桿菌屬 Thiobacillus，海洋世界區(qū)為硝化螺菌屬Nitrospira[13]。曲艷嬌等于2009至2010年對(duì)海浪河河夾村段水體及底泥中細(xì)菌組成與時(shí)空分布進(jìn)行研究，結(jié)果表明，該流域分離出的細(xì)菌隸屬于5個(gè)細(xì)菌菌屬，其中微球菌屬M(fèi)icrococcus是優(yōu)勢(shì)菌屬，其次是假單胞菌屬Pseudomonas和動(dòng)膠菌屬Zoogloeaitzigsohn[14]。張東升等對(duì)碧流河水庫(kù)2008年4—11月水體細(xì)菌生物量為（4.94±2.37）mg·L-1，細(xì)菌密度最高值出現(xiàn)在 5月份下游右側(cè)中層，細(xì)菌數(shù)量水平、垂直分布無(wú)規(guī)律[15]。厭氧繩菌、黃單胞菌、硫桿菌屬為革蘭氏陰性，厭氧菌數(shù)量較多，說(shuō)明含氧量低不利于好氧細(xì)菌的生長(zhǎng)和繁殖，不能進(jìn)行光合作用的菌屬，因?yàn)榈啄嘁话阍谒休^深處，陽(yáng)光無(wú)法照射，在有合適的無(wú)機(jī)電子供體時(shí)，能同化有機(jī)物，同時(shí)可以降低亞硝酸鹽，硫化氫含量，分解有機(jī)物，可作為無(wú)機(jī)營(yíng)養(yǎng)菌。潑河水庫(kù)存在大量淡水魚類，潑河水庫(kù)漁業(yè)資源豐富，目前已發(fā)現(xiàn)經(jīng)濟(jì)魚類有30多種，厭氧繩菌和黃單胞菌等底泥細(xì)菌的大量存在為魚類改善環(huán)境條件，因此具有十分必要的存在。