治療母豬子宮內(nèi)膜炎中藥組合物的體外抑菌效果研究

劉洪明，郭 峰，周靈芝，楊 磊，孫汝江

（1.煙臺市農(nóng)業(yè)綜合執(zhí)法支隊，山東 煙臺 264000；2.棲霞市動物疫病預(yù)防與控制中心，棲霞 265300；3.煙臺開發(fā)區(qū)農(nóng)業(yè)與海洋漁業(yè)局，煙臺 264006；4.煙臺海納生物技術(shù)研究所，煙臺 264000；5.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)煙臺研究院，煙臺 264000）

母豬子宮內(nèi)膜炎是指母豬在配種、分娩及難產(chǎn)助產(chǎn)過程中因操作不當(dāng)，導(dǎo)致細(xì)菌入侵引起子宮內(nèi)膜感染的一種常見產(chǎn)科疾病，是母豬繁殖障礙綜合征的一種主要類型。本病的病因極為復(fù)雜，國內(nèi)外學(xué)者將其大致歸結(jié)為原發(fā)的細(xì)菌感染、母豬患疾繼發(fā)細(xì)菌感染、公豬患疾引發(fā)母豬感染以及飼養(yǎng)過程中不嚴(yán)格執(zhí)行操作規(guī)程等幾個方面。目前，各地均投入大量人力物力用于本病的防治，但發(fā)病率仍居高不下，歸根結(jié)底是因為本病病原繁多，且抗生素和消毒藥的不規(guī)范使用，極易導(dǎo)致耐藥性的產(chǎn)生，難以達(dá)到預(yù)期治療效果，即使能夠抑制細(xì)菌、病毒的繁殖，也無法清除病豬體內(nèi)的毒素，使病豬出現(xiàn)病情反復(fù)、休克甚至昏迷死亡。本試驗研究一種治療母豬子宮內(nèi)膜炎的中藥組合物體外抑菌效果，旨在為治療母豬子宮內(nèi)膜炎提供一種新思路。

1 試驗材料

1.1 試驗時間與地點

試驗于2018年3—11月在煙臺海納生物技術(shù)研究所進(jìn)行。

1.2 試驗菌液

大腸桿菌10株、金黃色葡萄球菌10株、無乳鏈球菌10株，均從已確診患子宮內(nèi)膜炎的病豬分離制得。

將保存于斜面的大腸桿菌、金黃色葡萄球菌接種于普通瓊脂平板，無乳鏈球菌接種于血平板，37℃培養(yǎng)24 h；挑取數(shù)個大腸肝菌、金黃色葡萄球菌的菌落接種于MH肉湯，無乳鏈球菌接種于血清肉湯，37℃培養(yǎng)24 h，分別用滅菌生理鹽水稀釋，以0.5麥?zhǔn)媳葷峁鼙葷幔{(diào)其含菌量為1×108CFU/mL。然后再用滅菌生理鹽水將大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、無乳鏈球菌稀釋1 000倍，使其濃度為1×105～1×106CFU/mL備用。

1.3 中藥組合物

中藥組合物由以下成分混合均勻制備而成：海桐皮水提物4 g、老鶴草水提物1 g、透骨草水提物3 g、海風(fēng)藤水提物1 g。中藥原藥材均購自煙臺市藥材公司。

海桐皮水提物、老鶴草水提物、透骨草水提物和海風(fēng)藤水提物制備方法相同，具體為：將傳統(tǒng)煎煮法略作改進(jìn)，生藥粉碎，顆粒度為20～200目，得生藥粉末，按藥水比 1∶15～25，得到浸膏，并制成粉末。

1.4 試驗動物

健康、清潔級昆明小鼠（20±2）g，雌雄各半，由山東省實驗動物中心提供，合格證號SYXK（魯）20140010。試驗開始前，于實驗室飼養(yǎng)7 d以了解其正?；顒忧闆r和健康狀況，適應(yīng)本試驗環(huán)境。

2 試驗方法

2.1 小鼠致病性試驗

將大腸桿菌菌株、金黃色葡萄球菌菌株及無乳鏈球菌菌株分別接種于肉湯培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)24 h后作為供試菌液。每株菌的菌液通過腹腔途徑接種昆明鼠，0.5 mL/只，觀察結(jié)果。

2.2 抑菌作用測定

在表面均勻涂布供試菌液的瓊脂平板上打孔，每板3孔，孔徑6 mm，孔間距＞20 mm。將濃度為1 g/mL的單藥提取物和中藥組合物提取物溶液分別加于孔中，將接種大腸肝菌、金黃色葡萄球菌的瓊脂平板在37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18 h，無乳鏈球菌培養(yǎng)24 h，觀察結(jié)果，試驗重復(fù)3次。抑菌效果按照《中藥藥理學(xué)》的標(biāo)準(zhǔn)判定，抑菌圈直徑≥20 mm為極度敏感，14 mm≤抑菌圈直徑＜20 mm為高度敏感，10 mm≤抑菌圈直徑＜14 mm為中度敏感，10 mm以下為低度敏感[1-3]。

2.3 最小抑菌濃度測定

取滅菌試管10支，第1—9管中各加入無菌肉湯或血清肉湯培養(yǎng)基2 mL（大腸桿菌、金黃色葡萄球菌接種于肉湯培養(yǎng)基，無乳鏈球菌接種于血清肉湯），然后于第1管中加入1 g/mL的單藥或組合物溶液2 mL，混勻后取出2 mL加入第2管，依此類推，直到第8管中取出2 mL棄去，第9管為肉湯對照組，第10管為藥液對照組。分別于第1—9管加入供試菌液0.1 mL，搖勻，置37℃恒溫箱中培養(yǎng)18 h，不出現(xiàn)渾濁的最高藥物稀釋倍數(shù)為該藥的最小抑菌濃度（MIC）。

3 試驗結(jié)果

3.1 小鼠致病性試驗結(jié)果

小鼠接種后6～48 h全部死亡，剖檢、涂片染色、鏡檢，從小鼠體內(nèi)分離到與接種菌株相同的細(xì)菌，表明這3種菌為母豬子宮內(nèi)膜炎的病原菌。

3.2 抑菌圈直徑測定結(jié)果

中藥組合物對大腸桿菌、無乳鏈球菌、金黃色葡萄球菌的抑菌圈直徑分別是（26.09±0.50）mm、（16.87±0.65）mm、（23.13±0.22）mm；4 種單藥對大腸桿菌、無乳鏈球菌、金黃色葡萄球菌的抑菌圈直徑詳見表1。

表1 3株細(xì)菌的抑菌圈直徑測定結(jié)果 mm

3.3 最小抑菌濃度測定結(jié)果

中藥組合物對大腸桿菌、無乳鏈球菌、金黃色葡萄球菌的最小抑菌濃度（MIC）分別是31.25 g/L、31.25 g/L和15.625 g/L；4種單藥對大腸桿菌、無乳鏈球菌、金黃色葡萄球菌的MIC詳見表2。

表2 3株細(xì)菌的最小抑菌濃度（MIC）測定結(jié)果 g/L

從試驗結(jié)果可以看出，中藥組合物對3種病原菌的抑菌圈直徑顯著大于4種單藥中任何一種單藥的抑菌圈直徑，且其MIC顯著小于3種單藥中任何一種單藥的MIC，由此可以證實中藥組合物對母豬子宮內(nèi)膜炎病原菌的抑制作用強于海桐皮水提物、老鶴草水提物、透骨草水提物和海風(fēng)藤水提物四者單用對母豬子宮內(nèi)膜炎病原菌的抑制能力。

4 討論

本試驗通過4種具有抑菌抗炎作用的中藥聯(lián)合用藥，合理配伍、增效減毒，在體外對母豬子宮內(nèi)膜炎致病菌有很好的抑制作用。試驗所用的中藥組合物包括海桐皮、老鶴草、透骨草、海風(fēng)藤。方劑中的海桐皮，味苦、辛，性平，歸肝、腎經(jīng)，具有祛風(fēng)濕、通經(jīng)絡(luò)、殺蟲止痛等功效?，F(xiàn)代藥理研究表明，海桐皮有鎮(zhèn)靜鎮(zhèn)痛、抗?jié)?、抗缺氧等作用，主治脹滿下疾、溫病發(fā)熱，熱毒癰瘍和腫瘤等癥。老鶴草，味苦、微辛，性平，歸肝、腎、大腸經(jīng)，能祛除風(fēng)濕，常用于風(fēng)濕痹痛。老鶴草提取物的滅菌水溶液在體外對福氏痢疾桿菌、大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、綠膿桿菌均有抑制作用。透骨草，味甘、辛，性溫，入肺、肝二經(jīng)，有活血化瘀、利尿解毒、通經(jīng)透骨之功效，對于一身上下，心腹腰膝，內(nèi)外各種疼痛，均可選用該品治之，取其辛溫善走，活血利氣之功，血氣通則不痛。海風(fēng)藤，味辛、苦，性微溫，歸肝經(jīng)，能祛風(fēng)濕、通經(jīng)絡(luò)、止痹痛，用于風(fēng)寒濕痹，肢節(jié)疼痛，筋脈拘攣，屈伸不利。

本中藥組合物的配伍原則是“增效減毒”，方中海桐皮、透骨草活血止痛，海風(fēng)藤、老鶴草溫經(jīng)散寒，四藥相伍，全方得以標(biāo)本兼治、扶正祛邪，全面調(diào)整、平衡陰陽。各藥相伍，共同達(dá)到活血止痛、溫經(jīng)散寒的作用，且調(diào)整體內(nèi)氣血運行，可以快速緩解病豬疼痛等癥狀，修復(fù)子宮內(nèi)膜。中藥組合物對母豬子宮內(nèi)膜炎病原菌的抑菌圈直徑大于4種單藥中的任何一種，而最小抑菌濃度則小于4種單藥中的任何一種，因而可證實中藥組合物對母豬子宮內(nèi)膜炎病原菌的抑制作用強于4種單藥水提物分別對母豬子宮內(nèi)膜炎病原菌的抑制作用之和。