一株豬源產(chǎn)超廣譜β-內(nèi)酰胺酶大腸桿菌的分離鑒定與耐藥性分析

張青嫻，徐引弟，王治方，朱文豪，許 峰，王克領(lǐng)

（1.河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，河南 鄭州 450002；2.河南省畜禽繁育與營養(yǎng)調(diào)控重點實驗室，河南 鄭州 450002）

β-內(nèi)酰胺類抗生素為目前臨床使用率很高的抗生素，約占抗生素總使用量的30%～40%。近年來，隨著β-內(nèi)酰胺類抗生素的廣泛應(yīng)用，細菌尤其革蘭氏陰性菌迫于生存壓力對其耐藥性已經(jīng)產(chǎn)生，耐藥菌株逐年增多，且呈交叉耐藥和多重耐藥之趨勢[1]。β-內(nèi)酰胺類抗生素耐藥的主要機制是能產(chǎn)生超廣譜 β-內(nèi)酰胺酶（extended-spectrum β-lactamases,ESBLs），且ESBLs細菌攜帶ESBLs質(zhì)粒的同時可能帶有對喹諾酮類、氨基糖甙類和磺胺類等藥物的多種耐藥基因，使其具有多重耐藥表型，給臨床治療帶來嚴重的威脅，成為臨床關(guān)注的焦點[2-4]，大腸埃希氏菌和克雷伯氏菌是ESBLs的主要攜帶者[5]。

為指導(dǎo)獸醫(yī)臨床合理用藥，促進養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展，筆者于2018年3月對河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所傳染病研究室分離得到的大腸桿菌，進行了ESBLs的基因型檢測。經(jīng)分離培養(yǎng)和PCR檢測等方法，確認為TEM型ESBLs大腸桿菌，現(xiàn)將研究結(jié)果報告如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病料來源 2018年3月，本實驗室采集河南省某豬場發(fā)生腹瀉的仔豬病料，經(jīng)組織培養(yǎng)、革蘭氏染色、分離純化和PCR檢測等方法分離到3株大腸桿菌。

1.1.2 主要試劑、培養(yǎng)基等 麥康凱（Mac conkey,MC）瓊脂、普通營養(yǎng)瓊脂、革蘭氏染色液等試劑購自北京奧博星生物公司。藥敏紙片購自杭州濱和微生物試劑有限公司。Taq PCR master mix、DL 2 000 DNA Marker、GoldView等PCR試劑購自寶生物（大連）有限公司。膠回收試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒、DNA提取試劑盒等購自上海生工生物有限公司。頭孢他啶（CAZ）及頭孢他啶/克拉維酸（CAZ/CA），頭孢噻肟（CTX）及頭孢噻肟/克拉維酸（CTX/CA）等藥敏紙片、M-H（Muller-Hinton Medium）瓊脂培養(yǎng)基購自杭州濱和微生物有限公司。

1.2 方法

1.2.1 分離鑒定 將采集的病料無菌接種MC培養(yǎng)基，置于37℃溫箱培養(yǎng)18 h后，挑取單個玫紅色菌落做革蘭氏染色鏡檢，將疑似大腸桿菌的單菌落接種于普通營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基中純培養(yǎng)后做PCR鑒別試驗。用于鑒別大腸桿菌的上游引物P1：5′-ATGA AAGCTGGCTACAGGAAGGCC-3′，下游引物 P2：5′-GGTTTATGCAGCAACGAGACGTCA-3′，擴增產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳分析。

1.2.2 藥敏試驗

（1）紙片擴散法初篩ESBLs表型。將過夜培養(yǎng)的受試菌（菌液濁度0.5麥氏單位）均勻涂布于無菌M-H瓊脂培養(yǎng)皿上，同時貼上頭孢他啶CAZ（每片含 30 μg）、頭孢他啶/克拉維酸（CAZ/CA，每片含 30 μg/10 μg）、頭孢噻肟 CTX（每片含 30 μg）、頭孢噻肟/克拉維酸（CTX/CA，每片含 30 μg/10 μg），各紙片中心距20～25 mm；37℃過夜培養(yǎng)，分別測量抑菌環(huán)直徑。任意一組加克拉維酸比不加克拉維酸的抑菌環(huán)直徑≥5 mm即可確認為ESBLs陽性菌株。

（2）檢測ESBLs陽性菌株的藥物敏感性。采用K-B法測定ESBLs分離菌株對常用抗菌藥物的敏感性。所選藥敏紙片包括7大類18種抗生素：阿米卡星（AK）、四環(huán)素（TE）、氨芐西林（AMP）、阿莫西林（AMX）、卡那霉素（K）、氧氟沙星（OFX）、頭孢噻呋（EFT）、恩諾沙星（ENR）、頭孢唑林（CZ）、復(fù)方新諾明（STX）、新霉素（N）、頭孢哌酮（CFP）、氟苯尼考（FFC）、鏈霉素（S）、慶大霉素（GM）、環(huán)丙沙星（CIP）、頭孢他啶（CAZ）、頭孢噻肟（CTX）。

1.2.3 PCR基因分型 參考GenBank中大腸桿菌ESBLs耐藥基因相關(guān)序列，設(shè)計4對引物如下，CTX-M 基因：F 5'-AAAAATCACTGCGCCAGTTC-3'，R5'-AGCTTATTCATCGCCACGTT-3'；TEM 基因：F5'-CATTTCCGTGTCGCCCTTATTC-3'，R 5'-CGTTCATC CATAGTTGCCTGAC-3'；SHV 基因：F 5'-AGCCGCTT GAGCAAATTAAAC-3'，R 5'-ATCCCGCAGATAAAT CACCAC-3'；OXA 基因：F 5'-ATGAAAAACACAAT ACATATCAACTTCGC-3'，R 5'-GTGTGTTTAGAATGG TGATCGCATT-3'。

將純培養(yǎng)后的菌液提取DNA作為PCR模板，分別按如下反應(yīng)體系進行PCR擴增，13 μL Taq PCR master mix、5 μL dd H2O、1 μL P1（上游引物）、1 μL P2（下游引物）、5 μL 模板。PCR 反應(yīng)程序為：94℃變性5 min→94℃ 50 s→50～56℃退火45 s→72℃ 40 s，共30個循環(huán)，72℃延伸10 min。擴增產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳分析。

1.2.4 耐藥基因序列比對 將陽性PCR產(chǎn)物回收后提取質(zhì)粒，送至上海生工生物工程有限公司測序，將測出的基因序列用DNAStar的MegAlign軟件與NCBI上相關(guān)TEM序列比對，構(gòu)建系統(tǒng)進化樹。

2 結(jié)果

2.1 分離培養(yǎng)結(jié)果

分離菌株經(jīng)革蘭氏染色鏡檢，可在視野內(nèi)見到典型的或短或長的革蘭氏陰性短桿菌（圖1），經(jīng)PCR鑒別試驗得到的陽性菌株可在264 bp處得到目的條帶（圖2）。結(jié)果從肺臟、氣管和心血中各培養(yǎng)出1株大腸桿菌，將3株大腸桿菌做ESBLs表型和基因分型測定。

圖1 分離株的鏡檢結(jié)果（1 000×）

圖2 分離株的PCR鑒定

2.2 藥敏試驗結(jié)果

紙片擴散法結(jié)果從3株大腸桿菌中篩選出心源性大腸桿菌為ESBLs菌株，將該菌株命名為HB01株。藥敏結(jié)果顯示該菌株對7大類17種藥物均耐藥，耐藥譜為K+N+S+GM+OFX+ENR+CIP+TE+AMP+AMX+STX+FFC+CZ+CFP+EFT+CAZ+CTX，只對氨基糖甙類藥物阿米卡星敏感。

2.3 PCR基因分型結(jié)果

對菌株HB01做ESBLs耐藥基因分型試驗，結(jié)果只擴增出1條與預(yù)期大小一致的TEM型ESBLs基因片段，而沒有擴增出CTX-M、SHV、OXA型ESBLs基因片段（圖3）。

圖3 分離株TEM基因擴增

2.4 耐藥基因序列對比結(jié)果

TEM耐藥基因測序后，用BLAST在線比對以后，下載相關(guān)序列，其信息見表1。

表1 HB01株比對的相關(guān)序列信息統(tǒng)計

圖4 HB01株的TEM基因系統(tǒng)進化樹

如表1和圖4所示，HB01株與GenBank上相關(guān)TEM基因同源性達99%，即該分離株與人類糞便和尿液、禽類肝臟和糞便、豬糞便、狗陰囊液及未使用過的導(dǎo)尿管等分離株的同源性均為99%，提示了該菌株的耐藥基因可能在寵物、人、畜禽以及醫(yī)用器材之間的轉(zhuǎn)移和傳播。該耐藥基因與狗源最接近，提示應(yīng)注意人畜共患病的危險。

3 討論

隨著抗菌藥物選擇性壓力不斷增大，以及獸醫(yī)臨床上抗菌藥物的不規(guī)范使用，促進了攜帶ESBLs基因質(zhì)粒的轉(zhuǎn)移，致使ESBLs菌株檢出率大幅提高，我國產(chǎn)ESBLs豬大腸桿菌的流行呈逐年上升趨勢[6-10]。Yuan等研究表明產(chǎn)ESBLs菌的多重耐藥程度顯著高于非產(chǎn)ESBLs菌，流行的耐藥基因以CTX-M和TEM基因型為主[11-15]。本試驗所分離到的產(chǎn)ESBLs豬大腸桿菌耐藥性很強，常用的7大類抗生素只對阿米卡星敏感，其耐藥基因是TEM型，與國內(nèi)眾多學(xué)者研究結(jié)果一致。

本研究表明，該分離株的遺傳基因與畜禽、人及寵物間同源性非常接近，這不得不引起科研工作者的重視。耐藥基因在被污染的土壤、水源、畜禽之間和以及畜禽與人之間互相轉(zhuǎn)移的現(xiàn)象，是否已呈流行趨勢，這使得公共衛(wèi)生面臨嚴峻挑戰(zhàn)。

細菌的耐藥性可通過染色體或質(zhì)粒介導(dǎo)在細菌間傳播和擴散[16-17]，且耐藥性增強導(dǎo)致的潛在危害能在動物和人之間交叉感染。Johnson等[18-19]在貓狗中檢出與人相關(guān)的ST131表現(xiàn)出相似的耐藥性和毒力因子。王影等[20]的研究發(fā)現(xiàn)，雞源與人源大腸桿菌共同攜帶的耐藥基因gyr B、sul2、TEM和flo R的同源性均高于97%。Thorsteinsdottir等[21]的研究也證實E.coli普遍存在的耐藥性可以從動物傳播到人，動物與人源大腸桿菌可能攜帶同一耐藥基因，耐藥基因可能在雞源與人源大腸桿菌中水平傳播，進而導(dǎo)致耐藥性的傳播，致使個別超級耐藥菌株出現(xiàn)。

本試驗進一步說明豬源ESBLs的耐藥性相當(dāng)普遍，耐受譜呈復(fù)雜和增大趨勢。作為高熱綜合征的病原體之一，豬源ESBLs在公共衛(wèi)生學(xué)上的重大意義，使我們不得不重視目前的耐藥現(xiàn)狀。臨床和生產(chǎn)中應(yīng)按照一定時間分離豬群ESBLs，并及時對其做藥物敏感性試驗，合理安排藥物配伍，盡可能減少用藥，降低ESBLs耐藥性的產(chǎn)生和傳播。

在目前的研究基礎(chǔ)上，應(yīng)更保守地使用現(xiàn)有抗生素，加強產(chǎn)酶耐藥菌的監(jiān)測和研究，以及通過投資激勵研究人員精準研究、嚴格合理應(yīng)用抗生素。此外，疫苗、噬菌體療法和微生物組操縱等非抗生素的治療方法，正受到日益廣泛的關(guān)注。這些都可以有效防止產(chǎn)ESBLs大腸桿菌病的暴發(fā)和流行。