敲低鈣調(diào)磷酸酶結(jié)合蛋白1引起腎小管上皮細(xì)胞線粒體損傷

吳汪麗 溫躍強(qiáng)

廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院 (廣州 510260)

腎小管上皮細(xì)胞(renal tubular epithelial cells，RTECs)損傷是腎臟疾病發(fā)生發(fā)展的重要因素。研究表明，血管緊張素II和TGF-β等因子引起RTECs慢性損傷，促進(jìn)腎小管-間質(zhì)纖維化，導(dǎo)致腎功能惡化和慢性腎臟病進(jìn)展[1]。同時(shí)，線粒體功能障礙是RTECs損傷的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。據(jù)報(bào)道，化療藥物等損傷因素通過(guò)降低RTECs線粒體膜電位和減少線粒體DNA復(fù)制，誘導(dǎo)RTECs產(chǎn)生線粒體自噬和凋亡[2]。鈣調(diào)磷酸酶結(jié)合蛋白1(calcineurin binding protein 1, Cabin1)廣泛存在于心、腦、肝等器官中，參與多種細(xì)胞功能的調(diào)節(jié)。我們的前期研究發(fā)現(xiàn)，Cabin1在足細(xì)胞和RTECs線粒體損傷時(shí)表達(dá)升高[3- 4]，但具體的分子機(jī)制尚未闡明。本研究旨在觀察敲低Cabin1對(duì)RTECs線粒體功能的影響，闡明其在RTECs線粒體損傷中的作用機(jī)制，以期為延緩腎臟纖維化提供新靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 RTECs培養(yǎng)

采用質(zhì)量濃度為100 g/L的胎牛血清和100 U/mL青-鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱，培養(yǎng)大鼠腎小管上皮細(xì)胞(NRK-52E，中山六院姜宗培教授惠贈(zèng))。

1.2 采用siRNA敲低Cabin1的表達(dá)

待細(xì)胞長(zhǎng)至80%左右匯合度時(shí)，用質(zhì)量濃度為0.5 g/L的trypsin-EDTA消化傳代，并接種到6孔板中。待細(xì)胞匯合度達(dá)60%左右時(shí)，采用無(wú)血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)12 h，使其生長(zhǎng)同步化。進(jìn)而將細(xì)胞分成3組： ①對(duì)照組： 采用無(wú)血清DMEM培養(yǎng)48 h；②陰性對(duì)照組： 采用陰性對(duì)照的siRNA轉(zhuǎn)染NRK-52E細(xì)胞，6 h后更換為無(wú)血清DMEM培養(yǎng)基，共培養(yǎng)48 h；③敲低組： 采用敲低Cabin1蛋白的siRNA(正義鏈： 5′-CCGGAGGAGAUAAAUCUAATT-3′；反義鏈： 5′-UUAGAUUUAUCUCCUCCGGTT-3′)(GenePharma, China)轉(zhuǎn)染NRK-52E細(xì)胞，6 h后更換為無(wú)血清DMEM培養(yǎng)基，共培養(yǎng)48 h。轉(zhuǎn)染試劑采用Lipofectamine?RNAiMAX(invitrogen,USA)，轉(zhuǎn)染過(guò)程按說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。48 h后收集細(xì)胞，Western Blot檢測(cè)細(xì)胞中Cabin1蛋白表達(dá)。

1.3 WB檢測(cè)Cabin1蛋白的表達(dá)

取等量蛋白行電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉，加入一抗(GAPDH, Kangchen, China ;Cabin1, Abcam, UK)4 ℃ 孵育過(guò)夜，接著用相應(yīng)二抗(Anti-rabbit IgG, Cell Signaling Technology, USA)室溫孵育1 h，最后加入ECL發(fā)光試劑，曝光、顯影、定影，采用Image J圖像分析軟件進(jìn)行分析。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 采用siRNA敲低RTECs中Cabin1蛋白表達(dá)

在正常對(duì)照組和陰性對(duì)照組，Cabin1蛋白在RTECs中具有高的表達(dá)，采用siRNA干預(yù)RTECs后，Cabin1蛋白的表達(dá)量較對(duì)照組和陰性對(duì)照組降低50%以上，見(jiàn)圖1。

與對(duì)照組相比，*P<0.05；與陰性對(duì)照組相比，#P<0.05。圖1 采用siRNA敲低RTECs中Cabin1蛋白表達(dá)

2.2 敲低RTECs中Cabin1引起線粒體形態(tài)學(xué)改變

對(duì)照組與陰性對(duì)照組細(xì)胞中，線粒體形態(tài)規(guī)則，呈圓形或橢圓形，線粒體膜完整，線粒體嵴清晰可見(jiàn)(白色箭頭所示)。敲低組細(xì)胞中，線粒體腫脹，呈長(zhǎng)條形或不規(guī)則形，線粒體膜、線粒體嵴結(jié)構(gòu)模糊甚至消失(白色箭頭所示)，見(jiàn)圖2。

圖2 敲低RTECs中Cabin1引起線粒體形態(tài)學(xué)改變

3 討 論

RTECs中富含線粒體，后者通過(guò)氧化磷酸化為前者提供ATP，供給細(xì)胞正常代謝的能量。線粒體功能障礙引起氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)，誘導(dǎo)RTECs損傷，進(jìn)而導(dǎo)致急慢性腎臟疾病的發(fā)生發(fā)展[5- 6]。本研究采用siRNA敲低RTECs中Cabin1表達(dá)，發(fā)現(xiàn)敲低Cabin1引起RTECs線粒體形態(tài)學(xué)改變，提示Cabin1與RTECs線粒體功能障礙密切相關(guān)。

我們的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，敲低Cabin1引起RTECs線粒體呈長(zhǎng)條形或不規(guī)則形，出現(xiàn)線粒體腫脹，線粒體膜、線粒體嵴結(jié)構(gòu)模糊甚至消失。線粒體形態(tài)學(xué)的改變是線粒體功能障礙的重要指標(biāo)，與腎臟細(xì)胞損傷密切相關(guān)[7]。研究者發(fā)現(xiàn)在阿霉素腎病大鼠模型中，模型組足細(xì)胞線粒體由圓形或橢圓形變成細(xì)長(zhǎng)而不規(guī)則型[8]。此外，Gucer等在局灶性節(jié)段性腎小球硬化的患者腎組織中同樣發(fā)現(xiàn)足細(xì)胞線粒體的形態(tài)學(xué)改變[9]。因此，我們推斷Cabin1是維持RTECs線粒體正常功能的重要分子。

我們的前期研究發(fā)現(xiàn)AngII引起線粒體膜電位下調(diào)及細(xì)胞色素c蛋白的上調(diào)，同時(shí)Cabin1蛋白的表達(dá)明顯升高；敲低足細(xì)胞中Cabin1引起細(xì)胞骨架蛋白F-actin的破化和細(xì)胞色素c蛋白的高表達(dá)[3]。此外，我們的體內(nèi)外研究，同樣證實(shí)Cabin1在RTECs線粒體損傷時(shí)表達(dá)升高[4]。我們的結(jié)果充分說(shuō)明Cabin1是維持腎臟細(xì)胞線粒體功能的關(guān)鍵分子。那Cabin1通過(guò)什么具體的分子機(jī)制調(diào)控腎臟細(xì)胞線粒體功能呢？Cabin1通過(guò)調(diào)控p53參與多種細(xì)胞功能的調(diào)節(jié)，參與足細(xì)胞的損傷調(diào)節(jié)[10]。Peng[11]等認(rèn)為p53的磷酸化引起B(yǎng)ax轉(zhuǎn)位到線粒體膜上，繼而加速細(xì)胞色素c自線粒體釋放到細(xì)胞漿，導(dǎo)致線粒體功能障礙。Cabin1在細(xì)胞受損時(shí)，通過(guò)調(diào)控p53的表達(dá)，穩(wěn)定線粒體膜上的細(xì)胞色素c，維持線粒體的正常功能。Cabin1在RTECs損傷中的具體分子機(jī)制需要我們下一步的研究來(lái)證實(shí)。

綜上所述，本研究采用siRNA敲低RTECs中Cabin1表達(dá)，發(fā)現(xiàn)敲低Cabin1引起RTECs線粒體損傷，提示Cabin1是RTECs線粒體功能障礙的關(guān)鍵分子。但本研究尚未闡明Cabin1在RTECs線粒體損傷中的具體分子機(jī)制，將在下一步研究中深入探討。