首發(fā)兒童精神分裂癥患者腦源性神經營養(yǎng)因子水平及神經元凋亡研究

楊 俊，佟 靚，周立國*

(1.大理州第二人民醫(yī)院，云南 大理 671000；2.云南省精神病醫(yī)院，云南 昆明 650101

兒童精神分裂癥具有起病年齡小、易反復發(fā)作、治療難度大、預后差的特點，嚴重影響患者身心健康[1]。精神分裂癥的病因學研究指出，神經發(fā)育障礙是精神分裂癥發(fā)病的重要影響因素。精神分裂癥患者存在腦室擴大、腦溝變寬、海馬體積縮小、腦體積減小等顱腦異常[2]。Sporn等[3]研究顯示，兒童精神分裂癥患者的腦灰質和腦體積較健康兒童小，且其腦灰質密度降低早于精神分裂癥的癥狀出現(xiàn)，精神分裂癥患者的腦發(fā)育異常在胎兒期就已出現(xiàn)，主要表現(xiàn)為腦室擴大，這種病理改變貫穿于童年期[4]。腦源性神經營養(yǎng)因子(Brain-derived neurotrophic factor，BDNF)是神經發(fā)生蛋白，是神經可塑性的重要調節(jié)因子[5-6]，BDNF表達減少可引起內嗅皮質、額葉皮質、海馬和扣帶回細胞結構紊亂，破壞神經元的交互對話，導致顱腦發(fā)育異常[7]，BDNF對神經元的生物學作用提示其可能是精神分裂癥發(fā)病的影響因素。β Ⅲ型微管蛋白(β-Ⅲ-tubulin，Tuj-1)是一種參與神經元細胞類型特異性分化的微管蛋白，在神經元突觸分化時表達增加，參與神經元的交互對話[8]。當神經元受損、突觸分化障礙時，Tuj-1表達水平降低，Tuj-1可作為神經元突觸分化的特異性標志物[9]。在細胞凋亡進程中，胱天蛋白酶3(Caspase-3)被激活提示細胞凋亡已進入不可逆階段，有研究指出，Caspase-3作為神經元凋亡相關指標在神經元輕微損傷時表達就會增加[10]?；诰穹至寻Y的顱腦病變特點及BDNF對神經元的調節(jié)作用，本研究探索BDNF、神經元標志物Tuj-1和凋亡標志物Caspase-3在兒童精神分裂癥中的變化，為揭示兒童精神分裂癥的病因和發(fā)病機制提供參考。

1 對象與方法

1.1 對象

以2015年8月-2018年3月在大理州第二人民醫(yī)院就診的兒童精神分裂癥患者為研究組。納入標準：①符合《精神障礙診斷與統(tǒng)計手冊(第4版)》(Diagnostic and Statistical Manual of Mental Disorders，fourth edition，DSM-IV)精神分裂癥診斷標準；②年齡3～12歲；③既往未經任何治療的首發(fā)患兒，無系統(tǒng)精神類藥物應用史；④漢族；⑤無心、肝、腎等器質性疾病。排除標準：①合并腦炎、癲癇、多發(fā)性硬化、精神發(fā)育遲滯等神經系統(tǒng)器質性疾病者；②有顱腦外傷病史者。符合納入標準且不符合排除標準共35例。同期采用計算機隨機法從在大理州第二人民醫(yī)院體檢的兒童中選取30例年齡、性別、受教育程度與研究組匹配的健康兒童為對照組。納入標準：①年齡3～12歲；②漢族；③無心、肝、腎等器質性疾病。排除標準：①合并腦炎、癲癇、多發(fā)性硬化、精神發(fā)育遲滯等神經系統(tǒng)器質性疾病者；②有顱腦外傷病史者；③二系三代有精神病家族史或自殺史者。本研究經大理州第二人民醫(yī)院倫理委員會審核批準。研究對象均由其監(jiān)護人簽署知情同意書。

1.2 BDNF、Caspase-3和Tuj-1的mRNA檢測

所有兒童于入組當日08∶00-10∶00由護士抽取空腹靜脈血5 mL置于抗凝管中作為標本。用Trizol裂解液提取總RNA后于-80℃保存，將總RNA逆轉錄為cDNA，再進一步進行cDNA擴增。

使用逆轉錄試劑盒將總RNA逆轉錄為cDNA。逆轉錄體系50 uL：5×PrimeScript Buffer 10 μL，Oligo(dT) primer (50 μM) 2.5 μL，Prime Script RT Enzyme MixI 2.5 μL，Random 6 mers(100 uM)2.5 μL，Total RNA 2.5 μL，RNase Free ddH2O 30 μL。RNA逆轉錄條件：① 37℃，15 min，然后進行；②85℃，5 s，最后進行；③4℃，forever。在cDNA中加入引物后進行擴增，RT-PCR反應體系20 μL：cDNA 1 μL，Primer1 0.5 μL，Primer2 0.5 μL，Mix 10 μL，RNase Free ddH2O 8 μL。RT-PCR順序反應條件：①50℃，2 min，②95℃，2 min，③95℃ 15s，60℃ 1min 該步驟進行40個循環(huán)，④95℃，15 s，⑤60℃，30 s，⑥ 95℃，15 s。每個樣本做3個重復。BDNF、Caspase-3、Tuj-1基因引物由美國英杰(Invitrogen)生物公司合成。BDNF：上游引物：5′-CAGAGGAGCCAGCCCGGTGCG-3′，下游引物：5′-CTCCTGCACCAAGCCCCATTC-3′。Caspase-3：上游引物：5'-ACCGATGTCGATGCAGCTAA-3'；下游引物：5'-GGTGCGGTAGAGTAAGCATA-3'。GAPDH：上游引物：5'-GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT-3'；下游引物：5'-TTGGCTCCACCCTTCAAGTG-3'。Tuj-1：上游引物：5'-CCATCTAGCTACTGACACTG-3'；下游引物：5'-AAGTGGACTCACATGGAGTG-3'。本研究所有實驗均重復3次。

1.3 設備與試劑

Trizol裂解液購買于美國西格瑪(Sigma)生物公司。逆轉錄試劑盒購買于日本他卡若生物公司。PCR擴增儀購于美國伯樂公司，型號Tetrad2。RT-PCR系統(tǒng)購于美國應用生物系統(tǒng)公司，型號7300。

1.4 統(tǒng)計方法

2 結 果

2.1 兩組一般資料比較

研究組年齡(8.31±2.16)歲；男生18例，女生17例；小學19例，學齡前16例。對照組年齡(9.02±1.76)歲；男生15例，女生15例；小學16例，學齡前14例。

2.2 兩組BDNF mRNA、Caspase-3 mRNA和Tuj-1 mRNA表達水平比較

研究組BDNF mRNA和Tuj-1 mRNA表達水平均低于對照組，Caspase-3 mRNA表達水平高于對照組，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05或0.01)。見表1、圖1。

表1 兩組BDNF mRNA、Caspase-3 mRNA和Tuj-1 mRNA表達比較

圖1 兩組BDNF mRNA、Caspase-3 mRNA和Tuj-1 mRNA表達比較

3 討 論

兒童精神分裂癥是較常見的兒童精神疾病，與神經發(fā)育異常關系密切。精神分裂癥與神經元的變性、凋亡密切相關，其特異性癥狀、認知缺陷的持續(xù)進展及治療效果較差可能與神經細胞的功能下降有關。兒童及青少年階段是神經細胞快速增殖、生長時期，這一時期神經細胞發(fā)生大量凋亡必將影響兒童的腦組織生長和發(fā)育，從而導致一系列神經及精神問題。

本研究顯示，兒童精神分裂癥患者Tuj-1表達較健康兒童低。Tuj-1是一種微管蛋白，是神經元的特異性抗原之一。研究顯示[11-12]，在大腦發(fā)育過程中，神經干細胞分化為神經元是一個循序漸進的過程，分別經歷了神經干細胞、神經祖細胞、神經母細胞、不成熟神經元和成熟神經元階段。在此過程中，Tuj-1的表達增加提示神經元正處于發(fā)展和成熟的過程，Tuj-1表達減低提示神經元減少[13]。本研究中患兒Tuj-1表達降低，提示精神分裂癥患兒腦內神經元減少、受損或死亡。

Caspase-3是細胞凋亡下游的關鍵執(zhí)行者之一，其表達上調提示凋亡蛋白表達增加，即凋亡的細胞數量增加。本研究顯示，精神分裂癥患兒Caspase-3表達較健康兒童高，提示精神分裂癥患兒腦內凋亡的神經元數量較正常兒童多。

本研究中，研究組BDNF mRNA表達低于對照組，推測BDNF表達減少后神經元失去相應滋養(yǎng)，從而導致神經元凋亡，產生功能缺損，表現(xiàn)出精神分裂癥的一系列癥狀。神經營養(yǎng)因子在神經元的發(fā)生、發(fā)育、成熟及凋亡過程中均發(fā)揮重要調節(jié)作用，對中樞和外周神經元的存活起到支撐作用[14-15]。BDNF表達于大腦皮層、海馬、紋狀體等與精神分裂癥發(fā)病相關的腦區(qū)，對新神經元的發(fā)生、發(fā)育和存活具有調控作用，對發(fā)育成熟神經元的功能維持具有保護作用[16-17]，BDNF表達降低會產生一系列顱腦發(fā)育異常及神經精神障礙[18]。本研究結果顯示，精神分裂癥患兒BDNF表達減少，與既往研究結果一致。

綜上所述，兒童精神分裂癥患者BDNF mRNA和Tuj-1mRNA表達減少，Caspase-3 mRNA表達增加，推測BDNF、Tuj-1和Caspase-3可能與兒童精神分裂癥的發(fā)病相關。本研究的局限性在于：僅觀察35例首發(fā)精神分裂癥患兒的BDNF、Tuj-1及Caspase-3的mRNA表達變化，且未對mRNA轉錄的蛋白質進行研究，在今后的研究中應擴大樣本量，同時對相關轉錄因子及轉錄后蛋白進行研究，并進一步探討B(tài)DNF表達減少、神經元凋亡后神經元的功能及交互對話，以揭示兒童精神分裂癥的病因和發(fā)病機制。