UPLC-MS/MS 法測(cè)定凡納濱對(duì)蝦中呋喃西林新型生物標(biāo)志物

胡夢(mèng)玲，張小軍，嚴(yán)忠雍，梅光明，方雙琪,，張 帥,

(1.浙江海洋大學(xué)食品與醫(yī)藥學(xué)院，浙江舟山 316021；2.浙江海洋大學(xué)海洋與漁業(yè)研究所，浙江省海洋水產(chǎn)研究所，浙江省海洋漁業(yè)資源可持續(xù)利用技術(shù)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江舟山 316022)

硝基呋喃類抗生素是一系列廣譜抗菌藥物的總稱，常用的主要有以下4 種：呋喃唑酮(Forazolidone,FZD)、呋喃它酮(Furaltadone,FTD)、呋喃西林(Nitrofurazone,NFZ)和呋喃妥因(Nitrofurantoin,NFT)[1-2]，以呋喃西林為例，原藥及其代謝產(chǎn)物氨基脲的2-硝基苯甲醛(NP)衍生物結(jié)構(gòu)式如圖1 所示。

圖1 原藥呋喃西林(Nitrofurazone，NFZ)及其衍生物(NP-SEM，DNPH-NF)的結(jié)構(gòu)圖Fig.1 Structure diagram of parent NFZ and derivatives

硝基呋喃類藥物是人工合成的一類廣譜抗菌藥物[2-4]，此類抗生素以其良好的抗菌作用、藥物代謝較快的特性和價(jià)格低等特點(diǎn)[5-6]，最早被用于家禽、家畜、水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物細(xì)菌性疾病的防治[3]。常因用于預(yù)防和治療魚(yú)類及畜禽類因感染沙門氏菌和大腸埃希菌而產(chǎn)生的疾病在畜牧業(yè)及水產(chǎn)養(yǎng)殖中曾被廣泛使用[2-3]。

硝基呋喃類藥物在生物體內(nèi)代謝速率非常快[7-8]，消除半衰期從幾小時(shí)到十幾小時(shí)不等，因此，從飼料或給藥動(dòng)物體內(nèi)檢測(cè)硝基呋喃原形藥是比較困難且不準(zhǔn)確的，原藥的殘留量不足以反映真實(shí)的用藥情況。然而，硝基呋喃的代謝產(chǎn)物5-甲基嗎啉-3-氨基-2-噁唑烷基酮(AMOZ)、氨基脲(semicarbazide，SEM)、1-氨基-2-內(nèi)酰脲(AHD)、3-氨基-2-噁唑烷基酮(AOZ)能與組織蛋白結(jié)合而長(zhǎng)期存在[8-12]。硝基呋喃類藥物有一定的毒性，尤其代謝物被證實(shí)長(zhǎng)期服用具有潛在的“三致”作用(致癌、致畸和致突變)[13-17]。因此包括中國(guó)在內(nèi)的大多數(shù)國(guó)家已禁止在動(dòng)物源性食品中使用[18-19]。目前針對(duì)呋喃西林違禁用藥的檢測(cè)方法主要有酶聯(lián)免疫法(ELISA)[5,12]、原子吸收法[14]高效液相色譜-紫外檢測(cè)法(HPLC-UV)[5,8,16]、高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(HPLC-MS/MS)[18-19]、免疫膠體金法[9]和分光光度法等。基于SEM 為生物標(biāo)志物的檢測(cè)方法無(wú)法分辨“陽(yáng)性”的SEM 究竟來(lái)自于呋喃西林還是自然產(chǎn)生，這使得沿用至今的SEM 是否能夠繼續(xù)作為呋喃西林檢測(cè)的標(biāo)志物在業(yè)內(nèi)引起了巨大爭(zhēng)議[15,17]。近年來(lái)，研究人員開(kāi)發(fā)了新的檢測(cè)方法以及探索新型的呋喃西林生物標(biāo)志物以解決SEM 檢測(cè)“假陽(yáng)性”問(wèn)題。WANG Yuesong，et al[20]對(duì)呋喃西林在鯰魚(yú)體內(nèi)的代謝途徑進(jìn)行了研究，提出了一種全新的氰基代謝物，并認(rèn)為可替代SEM 作為呋喃西林檢測(cè)的確證標(biāo)志物。對(duì)于這種全新的標(biāo)示物，相關(guān)文獻(xiàn)僅用同位素質(zhì)譜法進(jìn)行了分析推斷，如果能夠分離出純物質(zhì)，采用核磁等方法對(duì)氰基代謝物結(jié)構(gòu)加以確證，則會(huì)更加有說(shuō)服力。

判定硝基呋喃類抗生素是否用藥的傳統(tǒng)檢測(cè)方法是通過(guò)測(cè)定其生物標(biāo)志殘留物來(lái)實(shí)現(xiàn)的，以檢測(cè)呋喃西林代謝物氨基脲(SEM)為例，在適當(dāng)?shù)乃嵝运夥諊?，與組織蛋白結(jié)合的SEM 會(huì)重新游離出來(lái)。從檢測(cè)的角度出發(fā)，SEM 是一類小分子量化合物，對(duì)液相色譜常用的紫外和熒光檢測(cè)器響應(yīng)均不理想，因而加入2-硝基苯甲醛(NP)作為衍生化試劑，衍生產(chǎn)物NP-SEM 如圖1 所示，經(jīng)過(guò)分離純化后，用UPLC/MS/MS 分析，檢測(cè)限可達(dá)歐盟法規(guī)要求的1 μg·kg-1[21]。

本研究以5-硝基-2-糠醛(NF)為新型生物標(biāo)志物，經(jīng)2,4-二硝基苯肼(DNPH)柱前衍生后，將NF 轉(zhuǎn)化成穩(wěn)定的腙類化合物，再進(jìn)行分離提取并檢測(cè)，用于識(shí)別和確證因呋喃西林用藥殘留問(wèn)題，傳統(tǒng)SEM 與新型NF 標(biāo)志物衍生途徑分別如圖1 所示。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

5-硝基-2-糠醛標(biāo)準(zhǔn)品(CAS：698-63-5，純度>97%)，日本東京化工集團(tuán)；呋喃西林、氨基脲鹽酸鹽、13C15N2氨基脲鹽酸鹽同位素標(biāo)準(zhǔn)品，德國(guó)Dr.Ehrenstorfer 公司；呋喃西林藥粉，商丘市亮峰衛(wèi)生用品有限公司；DNPH-NF 衍生物標(biāo)準(zhǔn)品，浙江省海洋水產(chǎn)研究所實(shí)驗(yàn)室自制；乙腈、甲醇、乙酸乙酯、正己烷、(均為色譜純)，德國(guó)Merck 公司；甲酸、乙酸銨(均為色譜純)，美國(guó)Sigma 公司；2,4-二硝基苯肼、硫酸、鹽酸、無(wú)水磷酸氫二鉀(均為AR)，上海國(guó)藥集團(tuán)有限公司；實(shí)驗(yàn)用水均為Millipore-Q 系統(tǒng)制備的超純水。

1.2 儀器與設(shè)備

ACQUITYTM UPLC I-Class/Xevo TQ-S 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀(配有電噴霧離子源) 美國(guó)Waters 公司；SPE-24 固相萃取裝置 美國(guó)supelco 公司；N-EVAP-11634 氮?dú)獯蹈蓛x 美國(guó)Organomation 公司；LPD2500多管漩渦混合儀萊普特科學(xué)儀器(北京) 有限公司；超聲波清洗器上?？茖?dǎo)超聲儀器有限公司；Centrifuge 5810 高速離心機(jī) 德國(guó)Eppendorf 公司；Oasis PRiME HLB 凈化柱(柱容量3 mL)美國(guó)Waters 公司。

1.3 方法

1.3.1 溶液的配制

磷酸鹽緩沖液(0.1 mol·L-1)：分別稱取二水合磷酸二氫鈉2.18 g，十二水合磷酸氫二鈉12.90 g，氯化鈉8.50 g，用水溶解并定容至1 000 mL。

鹽酸溶液(0.2 mol·L-1)：量取濃鹽酸6 mL，用水溶解并定容至1 000 mL。

2,4-二硝基苯肼衍生化試劑：精確稱取藥品250 mg 于250 mL 棕色容量瓶中，先用5 mL 乙醇溶解，再加入2.5 mL 鹽酸，后用乙醇定容至250 mL，配制成濃度為1 mg·mL-1的使用液，在4 ℃下避光保存。

NF-DNPH 標(biāo)準(zhǔn)溶液：精確稱取適量的NF-DNPH 標(biāo)準(zhǔn)品粉末，用乙腈稀釋定容至50 mL 容量瓶，4 ℃避光保存，保存時(shí)間為6 個(gè)月；使用時(shí)用乙腈逐級(jí)稀釋至100 μg·L-1備用。

1.3.2 呋喃西林暴露實(shí)驗(yàn)

實(shí)驗(yàn)所用凡納濱對(duì)蝦購(gòu)于浙江省舟山市臨城華潤(rùn)萬(wàn)家超市，運(yùn)送至實(shí)驗(yàn)室后，立即暫養(yǎng)于配有增氧泵的水槽中，24 h 后檢查并剔除死亡的對(duì)蝦，隨后選取個(gè)頭較小的對(duì)蝦制樣，檢測(cè)硝基呋喃殘留。判定空白無(wú)殘留后，挑選個(gè)體長(zhǎng)度、鮮活程度均等的對(duì)蝦進(jìn)行藥物暴露實(shí)驗(yàn)。

因甲殼類動(dòng)物的特殊性，通過(guò)口服、注射等方式難以達(dá)到預(yù)期的給藥效果，結(jié)合水產(chǎn)用藥的實(shí)際情況，本文擬采用藥浴的方式給藥。稱取5、50、500 mg 的呋喃西林藥粉，溶解于5 L 水中，分別制成濃度為1、10、100 mg·L-1呋喃西林藥浴，如圖2 所示，將檢測(cè)為空白的對(duì)蝦(每只約15 g)放入藥浴中浸泡24 h 后，按標(biāo)準(zhǔn)規(guī)范要求去殼后混合制樣檢測(cè)。

1.3.3 樣品前處理

稱取1.00 g(準(zhǔn)確到0.01 g)待測(cè)樣品，置于50 mL 塑料離心管中，加入10 mL 稀鹽酸(0.2 mol·L-1)，100 μL 2,4-二硝基苯肼(衍生試劑DNPH，1 mg·L-1)，渦旋振蕩1 min，超聲振蕩30 min 后，用磷酸氫二鉀(0.1 mol·L-1)調(diào)pH 至7.5 后，將8 mL 乙酸乙酯分2 次加入，7 000 r·min-1離心5 min，合并上清液至15 mL 離心管，在40 ℃水浴條件下氮吹濃縮至干，加入1 mL 流動(dòng)相乙腈/水(7：3，V/V)溶解，旋渦振蕩1 min，經(jīng)Oasis PRiME HLB 凈化柱除雜，過(guò)0.22 μm 有機(jī)微孔濾膜后，液相色譜-質(zhì)譜分析。

SEM 檢測(cè)方法參照《農(nóng)業(yè)部783 號(hào)公告-1-2006 水產(chǎn)品中硝基呋喃代謝物殘留的測(cè)定 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法》[22]。

圖2 凡納濱對(duì)蝦的呋喃西林藥物暴露實(shí)驗(yàn)Fig.2 L.vannamei exposure to nitrofurazone

1.3.4 高效液相色譜條件

色譜柱：ACQUITYTM UPLC BEH C18 柱(2.1 mm×50 mm，1.7 μm)；進(jìn)樣量10 μL；樣品室溫度4 ℃；流動(dòng)相A 為純水(2 mol·L-1乙酸銨)，B 為乙腈，柱溫40 ℃；流速0.2 mL·min-1；梯度洗脫：0～4.0 min，70%～30%A；4.0～6.0 min，30%A。

1.3.5 質(zhì)譜條件

電噴霧離子源，DNPH-NF 檢測(cè)為負(fù)離子掃描(Electrospray ionization，ESI-)模式；NP-SEM 檢測(cè)為正離子掃描方式：多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式(Multiple Reaction Monitor，MRM)；離子源溫度：150 ℃；脫溶劑氣溫度：380℃；毛細(xì)管電壓：2.5 kV；錐孔氣流量：60 L·h-1；脫溶劑氣流量：600 L·h-1；錐孔電壓、碰撞能量、分析物母離子及子離子等質(zhì)譜多反應(yīng)監(jiān)測(cè)實(shí)驗(yàn)條件如表1。

表1 分析物的質(zhì)譜多反應(yīng)監(jiān)測(cè)實(shí)驗(yàn)條件Tab.1 Conditions of multiple reaction monitoring for analyte

2 結(jié)果與分析

2.1 質(zhì)譜條件優(yōu)化

由于沒(méi)有商品化的5-硝基-2-糠醛衍生物標(biāo)準(zhǔn)品可購(gòu)買，因此本實(shí)驗(yàn)組合成并提純了NF-DNPH，該衍生物的質(zhì)譜分析條件也無(wú)相關(guān)文獻(xiàn)可供借鑒，分別在電噴霧正、負(fù)離子掃描模式下以10 μL·min-1流動(dòng)注射NF-DNPH 標(biāo)準(zhǔn)溶液，發(fā)現(xiàn)該化合物在負(fù)離子模式下的響應(yīng)靈敏，質(zhì)譜信號(hào)強(qiáng)。因此選擇電噴霧負(fù)離子模式對(duì)分析物的質(zhì)譜參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化。經(jīng)過(guò)一級(jí)質(zhì)譜掃描分析確定NF-DNPH 的母離子峰[M-H]-為m/z 320.07。通過(guò)二級(jí)碰撞誘導(dǎo)分析收集分析物子離子信息，選取m/z 320.07>273.08 和m/z 320.07>179.07 豐度最強(qiáng)的兩個(gè)離子碎片峰作為分析物的子離子，并對(duì)錐孔電壓，碰撞能量等參數(shù)進(jìn)一步優(yōu)化，如圖3 所示，得出最佳的質(zhì)譜多反應(yīng)監(jiān)測(cè)條件列于表1。

圖3 優(yōu)化的錐孔電壓、碰撞能和子離子質(zhì)譜碎裂圖Fig.3 Optimization of cone volatage collision energy and daughter spectrum

2.2 衍生化條件的優(yōu)化

柱前衍生反應(yīng)通常受溫度、衍生時(shí)間、酸濃度、衍生試劑用量等條件的影響，衍生化條件對(duì)衍生效率的影響至關(guān)重要并最終影響定量檢測(cè)的精確性，為提高前處理的高效性，需對(duì)柱前衍生反應(yīng)進(jìn)行優(yōu)化。由于5-硝基-2-糠醛本身的熱不穩(wěn)定性，溫度過(guò)高容易造成分解，衍生效率低，定量不準(zhǔn)確；而衍生化溫度過(guò)低，導(dǎo)致衍生過(guò)慢而反應(yīng)不完全，綜合考慮本文采用室溫，25 ℃，作為衍生反應(yīng)溫度。

2.2.1 鹽酸用量

5-硝基-2-糠醛與2,4-二硝基苯肼的衍生化反應(yīng)過(guò)程，屬于羰基的親核加成反應(yīng)，反應(yīng)過(guò)程中溶液的酸性氛圍可以加強(qiáng)羰基碳的正極性，有利于促進(jìn)親核加成反應(yīng)的進(jìn)行。因而合適的酸性條件下有利于衍生化反應(yīng)的順利完成。實(shí)驗(yàn)選取5～30 mL 鹽酸(0.2 mol·L-1)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，以鹽酸體積與與衍生物峰面積作關(guān)系曲線，從圖4 可以看出，當(dāng)加入的鹽酸體積超過(guò)10 mL 后，衍生物峰面積基本無(wú)變化，考慮到磷酸氫二鉀中和后的體積，本文選取10 mL 作為鹽酸用量。

2.2.2 衍生時(shí)間

選取10～60 min 進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，以為衍生時(shí)間和衍生物峰面積作關(guān)系曲線，從圖5 可以看出，衍生物峰面積隨著衍生時(shí)間增加而逐漸提高，10～30 min 時(shí)間段提高較為顯著，30 min 達(dá)到峰值并趨于穩(wěn)定，可以視為衍生反應(yīng)基本完全，因此本文選取30 min 作為最佳衍生化時(shí)間。

2.2.3 衍生試劑用量

2,4-二硝基苯肼在反應(yīng)里將較不穩(wěn)定的5-硝基-2-糠醛轉(zhuǎn)化為腙類，以便衍生物在后續(xù)的樣品前處理過(guò)程中能夠穩(wěn)定存在，因此衍生化試劑的用量對(duì)目標(biāo)化合物的回收率有重要作用。實(shí)驗(yàn)對(duì)2,4-二硝基苯肼(1 mg·L-1)的用量從50～300 μL。以衍生化試劑的用量和衍生物峰面積作關(guān)系曲線，從圖6 可以看出，衍生物峰面積隨著衍生化試劑的增加而逐漸提高，當(dāng)用量為100 μL 時(shí)候，峰面積達(dá)到最高；用量超過(guò)100 μL 以后，反而使得峰面積逐漸下降，這可能是由于過(guò)量的衍生化試劑使得基質(zhì)效應(yīng)增強(qiáng)而干擾了質(zhì)譜檢測(cè)，因此要嚴(yán)格控制2,4-二硝基苯肼的用量，本文選取100 μL 作為2,4-二硝基苯肼的最佳用量

圖4 鹽酸用量對(duì)分析物的影響Fig.4 The amount of hydrochloric acid on the impact of the analyte

圖5 衍生時(shí)間對(duì)分析物的影響Fig.5 Derivation of the impact of the analyte

圖6 衍生試劑用量對(duì)分析物的影響Fig.6 Influence of derivative reagent on analyte

2.3 方法驗(yàn)證

為了測(cè)試衍生物的穩(wěn)定性和特異性，在2 個(gè)月的周期內(nèi)，將DNPH-NF 的標(biāo)準(zhǔn)溶液每隔2 周分析1 次，色譜峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差小于5%，這表明DNPH-NF衍生物具備足夠的穩(wěn)定性，可以存放數(shù)月。用分析不同種類空白樣品(魚(yú)，蟹和蝦)的方式考察衍生物的特異性。樣品的質(zhì)譜離子流圖顯示，檢測(cè)目標(biāo)物峰形對(duì)稱且附近沒(méi)有基質(zhì)效應(yīng)的干擾作用。

將6 種不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液各分析3 次，用于建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。在上述優(yōu)化的柱前衍生、色譜-質(zhì)譜條件下，DNPH-NF 在0.4～20 μg·kg-1的濃度范圍內(nèi)，NP-SEM 在0.5～20 μg·kg-1的濃度范圍內(nèi)線性良好。線性方程相關(guān)系數(shù)分別為：r2=0.993，r2=0.995。DNPH-NF 用外標(biāo)法定量，而NP-SEM 采用13C15N-SEM 內(nèi)標(biāo)法定量。實(shí)際樣品的DNPH-N 與NP-SEM 加標(biāo)回收率范圍分別為83.4%～90.3%、85.3%～93.1%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差<10%。方法的理論檢出限(LOD)和定量限(LOQ)分別以3 倍信噪比和10 倍信噪比計(jì)算，最終確定新型生物標(biāo)志物檢出限和定量限分別為0.3 μg·kg-1和1.0 μg·kg-1。

2.4 實(shí)際樣品的分析

為考察方法的適用性和實(shí)用性，采用本方法對(duì)空白及不同濃度呋喃西林浸泡后的凡納濱對(duì)蝦樣品進(jìn)行分析檢測(cè)。

如圖7 所示，空白組結(jié)果有1～5 μg·kg-1的SEM 檢出，說(shuō)明SEM 內(nèi)源性問(wèn)題是存在的；而5-硝基-2-糠醛檢出量低于檢測(cè)限，表明對(duì)蝦中NF 無(wú)內(nèi)源性產(chǎn)生。

圖7 空白對(duì)蝦樣品的MRM 圖譜Fig.7 MRM chromatograms of blank L.vannamei

如圖8 所示，檢測(cè)結(jié)果表明，在1、10 和100 mg·L-1的呋喃西林浸泡條件下，24 h 后取樣分析，SEM 在蝦肉中殘留分別為55，325 和2 187 μg·kg-1。

圖8 凡納濱對(duì)蝦中NP-SEM 質(zhì)譜圖，正離子模式Fig.8 MRM chromatograms of NP-SEM in L.vannamei after the administration of NFZ,positive electrospray ionization

如圖9 所示，檢測(cè)結(jié)果表明，在1、10 和100 mg·L-1的呋喃西林浸泡條件下，24 h 后取樣分析，NF 在蝦肉中殘留分別為2.7、19 和173 μg·kg-1。

圖9 凡納濱對(duì)蝦中DNPH-NF 質(zhì)譜圖，負(fù)離子模式Fig.9 MRM chromatograms of DNPH-NF in L.vannamei after the administration of NFZ,negative electrospray ionization

與NP-SEM 檢測(cè)相比，DNPH-NF 檢測(cè)結(jié)果偏低[10]幾十倍，除了代謝殘留量較低的原因，還有一個(gè)因素則是SEM 的檢測(cè)為內(nèi)標(biāo)法定量，13C15N-SEM 同位素內(nèi)標(biāo)物可以補(bǔ)償樣品前處理帶來(lái)的損失，由于5-硝基-2-糠醛的同位素內(nèi)標(biāo)物沒(méi)有出售，因而本文采用了外標(biāo)法定量[12]，也會(huì)導(dǎo)致測(cè)定結(jié)果比真實(shí)值偏低。

3 結(jié)論

本研究利用5-硝基-2-糠醛為生物標(biāo)志物檢測(cè)呋喃西林殘留，方法特異性好，無(wú)內(nèi)源性問(wèn)題[14]，衍生化時(shí)間短，大大節(jié)省了樣品前處理的時(shí)間，且衍生物性質(zhì)穩(wěn)定、質(zhì)譜響應(yīng)好，檢測(cè)靈敏度低至0.3 μg·kg-1。鑒于5-硝基-2-糠醛的化學(xué)特性及其在凡納濱對(duì)蝦中的實(shí)際代謝殘留量，本方法可以與傳統(tǒng)的氨基脲檢測(cè)方法配合使用，適用于對(duì)蝦等氨基脲內(nèi)源性問(wèn)題樣品的呋喃西林初期用藥情況的判定。