連翹精油萃取及其在荔枝保鮮中的應用研究

何 勇，張曉虎，張峻偉

(商洛學院 生物醫(yī)藥與食品工程學院，陜西商洛 726000)

引言

藥用植物連翹〔Forsythia suspensa(Thunb.)Vahl〕果實中含有豐富的揮發(fā)性精油，其化學組成主要有單萜類、倍半萜類、三萜類、萜醇類以及環(huán)烯醚萜類化合物，α-蒎烯和β-蒎烯的含量占揮發(fā)油總量的60%以上，此外，還有含硫和含氮的化合物。因此，連翹果實精油化學成分比較復雜且具有多種生物學功能，如抑菌消炎、抑制病毒、抗氧化等。連翹精油作為具有潛力的一種新型天然食品防腐物，由于對食品風味的影響小、價格適中，已成為現(xiàn)代食品添加劑領(lǐng)域研究的重要課題［1-7］。

傳統(tǒng)的連翹藥用部位是其果殼，而富含精油的占果實重約1/3 的種子往往被廢棄，造成資源浪費。陜西省商洛市是中國連翹主產(chǎn)區(qū)之一，野生、撫育及栽培的連翹面積、產(chǎn)量大，提取果實精油有利于促進當?shù)剡B翹資源的綜合利用［8］。研究以商洛連翹為對象，在單因素實驗的基礎(chǔ)上應用正交設計優(yōu)化超臨界CO2萃取連翹果實精油工藝，將連翹精油萃取物用于大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抑菌性試驗，以荔枝貯藏試驗檢驗連翹精油的保鮮效果，欲為萃取商洛連翹精油并用于食品保鮮提供技術(shù)參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑 材料:連翹果實，2018 年10月采于商洛市商州區(qū)金鳳山;新鮮荔枝，2019 年5月購于商洛市商州區(qū)五洲超市。

試劑:CO2(食品級，純度＞99%，購于成都市緣和基業(yè)化工有限責任公司);95%乙醇(分析純);蒸餾水。

菌種:大腸桿菌、金黃色葡萄球菌，購于成都埃法生物科技有限公司。

1.1.2 儀器與設備 高速萬能粉碎機(FS180-4 型，廣州雷邁機械設備有限公司);超臨界CO2萃取設備(WH890HA220-40-11 型，上海齊欣科學儀器有限公司);電熱恒溫鼓風干燥箱(DHG-9123A 型，北京中西遠大科技有限公司)。

1.2 研究方法

1.2.1 原料預處理 連翹果實沖洗后于60℃干燥至恒重，粉碎后過60 目篩，稱取若干份(每份10 g)，用紗布包裹分裝，密封待用。

1.2.2 連翹精油萃取 用CO2為萃取劑的超臨界萃取連翹果實精油過程包括流體的壓縮、萃取、減壓和分離等，其中分離器中CO2通過凈化后再壓縮，重新回到CO2壓縮機中，實現(xiàn)循環(huán)利用。

將包裹分裝的預處理后的連翹樣品置于萃取釜中，以CO2反復沖洗萃取釜，排盡其中空氣后進行萃取，最后分離出CO2流體以獲得連翹果實精油。準確稱量萃取物，按式(1)計算連翹精油的萃取率(Y)。

式中:m1為連翹萃取物的質(zhì)量，g;m0為樣品質(zhì)量，g。

1.2.3 單因素試驗

(1)萃取溫度對萃取率的影響

由于溶劑CO2的臨界溫度為31.6℃，萃取時的溫度需高于此臨界溫度，故設定條件為:萃取用時90 min、萃取壓力23 MPa、以濃度60%的乙醇為夾帶劑，探究不同萃取溫度(32、37、42、47、52、57℃)對連翹果實精油萃取率的影響。

(2)萃取壓力對萃取率的影響

由于溶劑CO2的臨界壓力為7.39 MPa，萃取時的壓力需高于此臨界壓力，故設定條件為:萃取用時90 min、萃取溫度32℃、以濃度60%的乙醇為夾帶劑，探究不同萃取壓力(8、13、18、23、28、33 MPa，萃取壓力最高不得超過35 MPa)對連翹果實精油萃取率的影響。

(3)萃取時間對萃取率的影響

在設定萃取壓力23 MPa、萃取溫度32℃和乙醇夾帶劑濃度60%的條件下，探究不同萃取時間(30、45、60、75、90、105 min)對連翹果實精油萃取率的影響。

(4)乙醇夾帶劑濃度對萃取率的影響

在設定萃取壓力23 MPa、萃取溫度32℃和萃取時間90 min 的條件下，探究不同乙醇夾帶劑濃度(0、20、40、60、80、100%)對連翹果實精油萃取率的影響。

1.2.4 正交試驗 基于單因素試驗，選取3 個影響較顯著的因子，每因子設置3 個水平，采用L9(33)正交試驗確定最佳提取工藝參數(shù)。

1.2.5 抑菌效果試驗

(1)培養(yǎng)基的制備

準確稱量定量的瓊脂粉于250 mL 錐形瓶中，加入蒸餾水，用軟木塞堵塞瓶子，用牛皮紙包裹瓶子，用細繩擰緊，經(jīng)混合充分，高壓滅菌處理，以獲得無菌培養(yǎng)基。

(2)菌懸液的制備

在裝有9 mL 蒸餾水的試管中加入適量活化的供試細菌，混合充分制備細菌懸浮液，在試管中加入1 mL 完全混合的細菌懸浮液，加入蒸餾水制作不同濃度的細菌懸浮液。采用平板計數(shù)法，將濃度調(diào)到含菌體數(shù)106～107個/mL 的菌懸液，備用。

(3)抑菌圈的測定

濾片抑菌圈測定采用瓊脂擴散法［9］。首先，將少量的連翹精油溶解在無水乙醇中，分別制備成質(zhì)量百分比為0.5、1.0、2.0%的溶液，然后將濃度為1 ×105cfu/mL 細菌懸浮液均勻地涂在固化表面培養(yǎng)皿中，蓋好平皿。將滅菌的直徑為6 mm 濾紙浸泡在上述3 種含有連翹精油成分的乙醇溶液中，濾紙用無菌鑷子夾起，等待1～2 min。干燥后輕輕貼在平板的表面上，每個板材貼紙3片，以無菌水為對照，在37℃下恒溫培養(yǎng)48 h 后測量，結(jié)果為三次測量之平均值。

1.2.6 連翹果實精油對荔枝保鮮效果的指標測定 取無損壞、無病蟲且大小均勻，未經(jīng)防腐劑處理的新鮮荔枝，隨機分成四組。將荔枝分別在含有連翹果實精油0.5、1.0、2.0%的乙醇溶液和蒸餾水中浸泡3 min，取出后放置在實驗室通風處晾干，置于一次性消毒塑料盒中，室溫下在紙箱中存放，以蒸餾水處理為對照組，貯藏期間取樣一次的時間間隔為1 d/次，測定各項指標，重復三次，按式(2)計算失重率。

采用糖度計法測量荔枝漿中可溶性固體含量［10］，儀器經(jīng)校正后，在棱鏡玻璃表面滴下2 滴荔枝汁，觀察，讀取在光暗交匯處線上的刻度，即荔枝的可溶性固形物含量(%)，試驗重復三次。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗結(jié)果與分析

圖1 萃取溫度對萃取率的影響

2.1.1 萃取溫度對萃取率的影響 分析圖1 可知，47℃以下隨溫度的升高萃取率顯著提高，但當溫度超過47℃時，連翹果實精油萃取率明顯下降?？赡苁怯捎跍囟鹊陀?7℃，萃取溫度的不斷升高，CO2 分子熱運動加劇，從而會造成流體粘度降低，進而使流體可以迅速地攜帶連翹果實精油，因此顯示出圖中的上升趨勢;當溫度超過47℃以后，繼續(xù)升高溫度時，使得流體密度變小，其攜帶連翹果實精油的能力降低，所以顯現(xiàn)出下降的趨勢。故選擇47℃為試驗的較佳萃取溫度。

2.1.2 萃取壓力對萃取率的影響 分析圖2 可知，當萃取壓力小于23 MPa 時，連翹果實精油的萃取率隨萃取壓力的增加而升高，但是當萃取壓力超過23 MPa 時，萃取率反而呈現(xiàn)下降的趨勢。可能一方面是由于壓力增加時，使得超臨界流體的密度增加，流體攜帶連翹果實精油的能力提高;另一方面是由于壓力過高時，超臨界流體密度過大，反而阻礙了傳質(zhì)的效率，所以，萃取壓力在23 MPa 后，繼續(xù)增壓，連翹果實精油的萃取率反而呈現(xiàn)下降的趨勢。故選擇23 MPa 為試驗的較佳萃取壓力。

圖2 萃取壓力對萃取率的影響

2.1.3 萃取時間對萃取率的影響

圖3 萃取時間對萃取率的影響

分析圖3 可知，隨著萃取時間的增加，萃取率始終保持升高趨勢，但從萃取率升高的幅度觀察，當萃取時間超過90 min 后，其萃取率的增幅明顯降低，從能耗的角度來看，萃取時間越長，能耗越多，考慮到節(jié)能和經(jīng)濟效益，故選擇90 min 為試驗的較佳萃取時間。

2.1.4 乙醇夾帶劑濃度對萃取率的影響 分析圖4 可知，隨著濃度的增加，萃取率先升高后降低，當乙醇夾帶劑濃度為60%時萃取率最高，繼續(xù)增加乙醇夾帶劑濃度，則其萃取率明顯降低。原因可能是，連翹精油溶于乙醇，隨濃度的增大，導致溶液極性變化，使連翹精油溶解度下降，萃取率降低。故選擇60%為試驗較佳的乙醇夾帶劑濃度。

圖4 乙醇夾帶劑濃度對萃取率的影響

2.2 正交試驗結(jié)果與分析

2.2.1 正交試驗結(jié)果及直觀分析 以連翹精油萃取率為指標，取單因素試驗中萃取的時間、壓力、溫度3 個影響較大因素，每因素設置3 個水平設計正交試驗。正交試驗因素水平見表1，試驗結(jié)果及直觀分析見表2。

表2 直觀分析可知:對連翹果實精油萃取率影響最大的因素是C(萃取時間);影響次之的是因素A(萃取壓力);影響最小的因素是B(萃取溫度)。綜合分析可得最優(yōu)組合:A1B3C3，即萃取壓力為23 MPa，萃取溫度為52℃，萃取時間為90 min。

2.2.2 正交試驗方差分析 經(jīng)試驗數(shù)據(jù)分析處理，得出正交試驗方差分析結(jié)果見表3。

表1 正交試驗因素水平

表2 正交試驗結(jié)果及直觀分析

表3 分析可知，因素C 對應的F 比為2.246＜5.140，可得因素C(萃取時間)對連翹果實精油的萃取率影響顯著;因素A 對應的F 比為0.603＜5.140，可得因素A(萃取壓力)對連翹果實精油的萃取率影響較為顯著;因素B 對應的F 比為0.151(0.151 ＜0.603 ＜2.246 ＜5.140)，可得因素B(萃取溫度)對連翹果實精油萃取率影響不顯著。綜合分析可得:超臨界CO2萃取連翹果實精油的最佳工藝條件是A1B3C3，即萃取壓力為23 MPa，萃取溫度為52℃，萃取時間為90 min。由此看出，正交分析結(jié)果與極差分析結(jié)果一致，在此條件下連翹果實精油萃取率為0.58%。

表3 正交試驗方差分析結(jié)果

2.3 抑菌試驗結(jié)果與分析

萃取的商洛連翹果實精油抑菌結(jié)果見表4。

由表4 可得，0.5%的連翹精油就有抑菌效果，2.0%的連翹精油對金黃色葡萄球菌的最大抑菌圈直徑為15.6 mm，對大腸桿菌的最大抑菌圈直徑10.2 mm。表明連翹果實精油對革蘭氏陽性菌金黃色葡萄球菌的抑菌效果大于對革蘭氏陰性菌大腸桿菌的抑菌效果。

表4 連翹精油抑菌結(jié)果

2.4 保鮮試驗結(jié)果與分析

圖5 失重率指標測定結(jié)果

2.4.1 失重率指標測定結(jié)果 從圖5 可以看出，隨貯藏期延長荔枝失重率一直處于上升趨勢，表明荔枝中的水分、養(yǎng)分在持續(xù)遺失，其質(zhì)量愈來愈差，除以蒸餾水為對照組外，其它三組濃度處理的荔枝，前3 d 失重率基本保持穩(wěn)定狀態(tài)，表明連翹精油能有效減緩荔枝失重率的增大。3 d 后的處理組和對照組的荔枝失重率均呈明顯上升趨勢，但對照組失重率明顯高于處理組，且處理組的連翹果實精油含量越高，其失重率越低。所以，連翹果實精油含量為2.0%的乙醇溶液對荔枝有較好的保水性，對保持荔枝品質(zhì)的效果較為明顯。

2.4.2 可溶性固形物含量指標測定結(jié)果 從圖6可以看出，總體上隨貯藏期延長可溶性固形物處于不斷下降的趨勢，表明荔枝的營養(yǎng)成分在持續(xù)損失，作為荔枝大量成分的可溶性固形物糖類物質(zhì)，會因呼吸作用的消耗而不斷降低。在第7 d時，2.0%精油溶液處理的荔枝可溶性固形物含量與初始值對比僅損失了1.9%，該組相比其它三組對可溶性固形物的保持效果更好。蒸餾水對照組對可溶性固形物的保持效果最差，與初始值對比損失了3.4%。所以，連翹果實精油含量2.0%的乙醇溶液能較好保持荔枝可溶性固形物含量，對保持荔枝品質(zhì)的保鮮效果較為明顯。

圖6 可溶性固形物含量指標測定結(jié)果

3 結(jié)論與討論

3.1 結(jié)論

(1)萃取試驗結(jié)果表明，影響超臨界CO2萃取連翹果實精油的因素順序為:萃取時間＞萃取壓力＞萃取溫度;正交試驗取得的優(yōu)化工藝參數(shù)為:萃取時間90 min、萃取壓力23 MPa、萃取溫度52℃，在該條件下選擇60%的乙醇夾帶劑濃度獲得的連翹果實精油萃取率為0.58%。

(2)抑菌試驗結(jié)果表明，連翹果實精油對兩種試驗菌的抑菌效果為:金黃色葡萄球菌＞大腸桿菌，2.0%連翹果實精油對金黃色葡萄球菌的最大抑菌圈直徑為15.6 mm，對大腸桿菌的最大抑菌圈直徑10.2 mm，即連翹精油對革蘭氏陽性菌的抑菌能力較強。

(3)荔枝貯藏試驗表明，以失重率和可溶性固形物含量為指標的保鮮效果為:含有2.0%連翹果實精油的乙醇溶液能夠有效降低失重率、較好保持可溶性固形物含量，可適當延長荔枝保藏時間。

3.2 討論

本文采用超臨界CO2萃取連翹果實精油，相比于水蒸氣蒸餾法、醇提法，具有溶解性能好、傳質(zhì)性能高、流動性能強、提取效率較高、安全無污染等突出優(yōu)點。但該技術(shù)亦有一定局限，如對設備要求較高、操作難度較大、能量消耗過大等，使其在實際生產(chǎn)中受到限制。

本研究以連翹果實為對象的精油提取率低于文獻報道的以連翹種子為對象的精油提取率［5］，究其原因一是種子中連翹精油含量最高;二是10月份采摘連翹果實時，蒴果已發(fā)黃而開裂，相當一部分種子掉于樹下土壤，所采果實中種子所剩無幾［11］。

連翹果實揮發(fā)性精油是一種成分較為復雜的混合物，將連翹精油用于荔枝保鮮效果良好。鑒于時間、經(jīng)費等的關(guān)系，本文未對連翹精油各組分做進一步分離純化研究，未闡述其對新鮮果蔬防腐的保鮮機理，這些尚需在今后的相關(guān)研究中予以關(guān)注。