棉花磷脅迫響應(yīng)基因GhWRKY6克隆及功能分析

李智 ，韓笑 ，張一豪 ，馬峙英 ，楊召恩 *

（1.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院棉花研究所/ 棉花生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,河南 安陽 455000；2.河北農(nóng)業(yè)大學(xué)/ 棉花生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室河北基地，河北 保定 071001；）

在植物整個(gè)生命活動(dòng)中磷元素是不可或缺的大量元素之一，對(duì)植物的生長(zhǎng)發(fā)育有著極其重要的作用。磷元素除了是細(xì)胞結(jié)構(gòu)物質(zhì)磷脂和核酸的重要成分外，還參與糖、脂、蛋白質(zhì)代謝以及蛋白磷酸化和去磷酸化等過程。此外，種子的萌發(fā)過程也需要含磷化合物作為磷源[1]。

磷酸根 （Pi） 是植物吸收磷的形式，主要以H2PO4－、HPO42－和 PO43－等形式存在，其中 H2PO4－最容易被植物吸收。雖然土壤中磷元素含量豐富，但多數(shù)以植物不能吸收的形式存在，導(dǎo)致有效磷的濃度降低，加之其又很容易被固定在土壤中，所以植物很容易處于缺磷環(huán)境中[2-3]。為了促進(jìn)作物產(chǎn)量的提高而大量施用磷肥不僅會(huì)導(dǎo)致生產(chǎn)成本的增加還會(huì)對(duì)環(huán)境造成不利影響。因此，研究植物磷營(yíng)養(yǎng)的調(diào)控通路，發(fā)掘及利用磷誘導(dǎo)的相關(guān)基因?qū)μ岣咦魑锬偷土啄芰哂兄匾饬x。

WRKY 轉(zhuǎn)錄因子是植物特有的轉(zhuǎn)錄因子，參與多種生物與非生物脅迫反應(yīng)[4]。最近王琛等鑒定出陸地棉中18個(gè)Ⅱc 族WRKY 轉(zhuǎn)錄因子在棉花對(duì)枯萎病菌的抗性方面發(fā)揮重要作用[5]，司愛君等研究報(bào)道GhWRKY40-1 在棉花干旱脅迫應(yīng)答中發(fā)揮重要作用[6]。關(guān)于WRKY 轉(zhuǎn)錄因子參與磷信號(hào)途徑在擬南芥中報(bào)道較多。WRKY75 的表達(dá)受低磷誘導(dǎo)非常明顯，該基因的RNAi 干涉株系在低磷條件下影響植株對(duì)磷的吸收[7]。WRKY45 可與PHT1；1 啟動(dòng)子內(nèi)的兩個(gè)W-box結(jié)合調(diào)控PHT1；1 上調(diào)表達(dá)從而參與擬南芥對(duì)低Pi 脅迫的反應(yīng)[8]。AtWRKY42 被研究證明參與磷信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程，對(duì)維持植物體內(nèi)Pi 的動(dòng)態(tài)平衡有調(diào)控作用[9]。過表達(dá)AtWRKY6 導(dǎo)致擬南芥對(duì)低磷脅迫敏感，降低了幼苗中磷元素的含量[10]。Gb-WRKY1 是最近報(bào)道的響應(yīng)磷脅迫的棉花WRKY基因，其參與調(diào)控Pi 的運(yùn)輸和活化過程，在擬南芥中過表達(dá)GbWRKY1 能夠緩解植物缺Pi 癥狀，但在Pi 缺乏條件下不會(huì)促進(jìn)Pi 的吸收[11]。

為了發(fā)掘棉花中應(yīng)答低磷脅迫的WRKY 轉(zhuǎn)錄因子，我們克隆到陸地棉GhWRKY6 基因的全長(zhǎng)cDNA 序列，其核酸序列與擬南芥AtWRKY6[10]相似性較高是其同源基因，故推測(cè)GhWRKY6 在磷轉(zhuǎn)運(yùn)調(diào)控方面有一定作用。本研究利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)獲得擬南芥轉(zhuǎn)基因株系，通過在低磷脅迫條件下轉(zhuǎn)基因擬南芥表型的鑒定，初步確定了Gh-WRKY6 的功能，為解析GhWRKY6 基因在棉花低磷脅迫應(yīng)答中的調(diào)控機(jī)制提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)中所用的野生型擬南芥是Col-0 型，wrky6 擬南芥突變體來自中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)陳義芳實(shí)驗(yàn)室。

Polymerase chain reaction (PCR)所用的 TKS高保真聚合酶、載體構(gòu)建所用的T4 連接酶、限制性內(nèi)切酶和cDNA 反轉(zhuǎn)錄試劑盒均購(gòu)自TaKaRa（中國(guó)，大連）公司；氨芐、卡那霉素和利福平等抗生素購(gòu)自Sigma 公司； 植物總RNA 提取試劑盒和植物總DNA 提取試劑盒購(gòu)自天根生化科技有限公司（中國(guó)，北京）；PCR 產(chǎn)物膠回收純化試劑盒和大腸桿菌感受態(tài)DH5α 購(gòu)自全式金公司（中國(guó)，北京）；引物合成及片段測(cè)序由北京金唯智公司完成。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1RNA 的提取。采用改良 CTAB 法[12]提取在大田中生長(zhǎng)的陸地棉中棉所24 各組織的RNA，每個(gè)樣本3個(gè)重復(fù)，RNA 放置－80 ℃冰箱保存。

1.2.2GhWRKY6 基因的克隆?；诒緦?shí)驗(yàn)室未發(fā)表的RNA-seq 數(shù)據(jù)中發(fā)掘到了一個(gè)在非生物脅迫后表達(dá)量顯著上調(diào)的基因，該基因的核酸序列與擬南芥AtWRKY6 基因具有很高的相似性，故將其命名為GhWRKY6。根據(jù)GhWRKY6 基因編碼序列在primer premier5 軟件中設(shè)計(jì)目的基因擴(kuò)增引物GhWRKY6-F和GhWRKY6-R (表1)，PCR 擴(kuò)增得到GhWRKY6 基因片段并回收連接到pMD○R18-T SIMPLE 載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)DH5α，送PCR 鑒定的陽性菌到北京金唯智公司測(cè)序獲得正確序列的GhWRKY6 基因片段。

1.2.3生物信息學(xué)分析。使用DNAMAN 軟件進(jìn)行核苷酸多序列分析和比對(duì)，使用MEGA6 軟件構(gòu)建進(jìn)化樹，利用CDD （http://www.ncbi,nlm.nihgov/Structure/cdd/wrpsb.cgi） 對(duì)蛋白保守結(jié)構(gòu)域進(jìn)行預(yù)測(cè)，使用 EXPASY （http://web.expasy.org/cgi/-bin/compute_pi/pi_tool）對(duì)蛋白質(zhì)的相對(duì)分子質(zhì)量（Mr）和理論等電點(diǎn)進(jìn)行分析，使用SignalP 4.0 Server (http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)進(jìn)行跨膜結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)。

1.2.4GhWRKY6 的組織表達(dá)模式分析。為了進(jìn)一步研究GhWRKY6 的表達(dá)模式，以陸地棉中棉所 24 的根、莖、葉、花瓣（開花當(dāng)天）、胚珠（開花當(dāng)天）和纖維（開花后5 d、開花后10 d、開花后15 d） 為材料提取 RNA，提取方法如 1.2.1 所述。qRT-RCR 操作過程及計(jì)算方法如1.2.7 所述。

1.2.535S::GhWRKY6 過表達(dá)載體的構(gòu)建。Gh-WRKY6 基因片段和植物表達(dá)載體pCambia2300使用限制性內(nèi)切酶XbaⅠ和AscⅠ完成雙酶切，酶切產(chǎn)物片段使用凝膠回收試劑盒回收，之后使用T4 連接酶連接構(gòu)建完整的目的基因表達(dá)載體pCambia2300-GhWRKY6。使用電轉(zhuǎn)法[13]將構(gòu)建好的過表達(dá)載體轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌GV3101 菌株中以備轉(zhuǎn)化擬南芥。

1.2.6擬南芥的生長(zhǎng)條件和低磷脅迫。使用營(yíng)養(yǎng)土和蛭石比例為1:1 的混合土壤種植擬南芥植株，放置于人工氣候室（溫度19～20 ℃，濕度70%，光周期為 16 h 光 /8 h 黑暗）生長(zhǎng)至收獲種子。

利用低磷 （10 μmol·L－1）MS 培養(yǎng)基模擬擬南芥的低磷脅迫環(huán)境，同時(shí)設(shè)置正常磷濃度的（1.25 mmol·L－1）MS 培養(yǎng)基作為對(duì)照。無論是擬南芥種子萌發(fā)的統(tǒng)計(jì)還是根長(zhǎng)的統(tǒng)計(jì)都需要預(yù)先對(duì)種子進(jìn)行滅菌處理。首先將種子在NaClO（50%）溶液中滅菌5 min，然后用無菌蒸餾水洗滌5～6 次，之后均勻鋪在正常MS 或低磷MS培養(yǎng)基。對(duì)于擬南芥種子萌發(fā)的統(tǒng)計(jì)是每天固定時(shí)間點(diǎn)統(tǒng)計(jì)種子萌發(fā)數(shù)目，連續(xù)統(tǒng)計(jì)1 周。對(duì)于擬南芥根部的觀察是先將滅菌的種子在正常MS培養(yǎng)基上生長(zhǎng)1 周，之后轉(zhuǎn)入低磷或正常MS 培養(yǎng)基上繼續(xù)生長(zhǎng)，所有培養(yǎng)基需要垂直放置。

需要注意的是擬南芥在轉(zhuǎn)入恒溫培養(yǎng)室之前要預(yù)先在4 ℃低溫、黑暗環(huán)境處理2 d，以保持種子萌發(fā)一致。

1.2.7RT-PCR 和qRT-PCR。采用 TaKaRa 公司的PrimeScript○RRT Reagent Kit with gDNA Eraser反轉(zhuǎn)錄試劑盒對(duì)RNA 完成反轉(zhuǎn)錄，具體步驟可參考試劑盒說明書。RT-PCR 的程序?yàn)椋?4 ℃5 min；98 ℃ 15 s,60 ℃ 15 s,68 ℃ 30 s，27個(gè)循環(huán)；68 ℃ 3 min；4 ℃保存。

Real-time PCR 反應(yīng)體系和反應(yīng)程序按照SYBR Premix Ex Taq (DRR041A) 熒光定量試劑盒說明書進(jìn)行，使用的熒光定量PCR 儀器型號(hào)是ABI 7900，操作方法可參考分析儀說明書。棉花組織內(nèi)參基因?yàn)镚hHistone3，擬南芥組織內(nèi)參基因?yàn)锳tactin2，每個(gè)反應(yīng)設(shè)置3個(gè)重復(fù)。獲得結(jié)果采用2－△△Ct計(jì)算基因的相對(duì)表達(dá)量。

表1 本研究中使用的引物Table 1 Primers used in this study

2 結(jié)果與分析

2.1 GhWRKY6基因的克隆及特征分析

對(duì)GhWRKY6 基因的開放閱讀框（Open reading frame,ORF）全長(zhǎng)序列設(shè)計(jì)特異擴(kuò)增引物，以非生物脅迫處理后的陸地棉中棉所24 cDNA 為模板，通過TA 克隆并測(cè)序驗(yàn)證得到正確的Gh-WRKY6 基因序列 （圖1-A）。該基因全長(zhǎng) 1 575 bp，編碼525個(gè)氨基酸 。GhWRKY6（Gh_A01G0639 ） 定位于A01號(hào)染色體的1 1509 602-1 1511 977 bp （base pair）位置，包含有6個(gè)外顯子(圖1-B)。利用在線網(wǎng)站 CDD 對(duì)蛋白的保守結(jié)構(gòu)域進(jìn)行預(yù)測(cè)，結(jié)果顯示GhWRKY6 有1個(gè)典型的 WRKY 結(jié)構(gòu)域（281～341AA），表明其是 WRKY 家族成員（圖1-C）。

圖1 GhWRKY6 基因的克隆及特征分析Fig.1 Cloning and characterization of GhWRKY6 gene

2.2 GhWRKY6及其編碼蛋白的生物信息學(xué)分析

在 EXPASY 網(wǎng) 站上的 ProtParam 對(duì)Gh-WRKY6 基因編碼蛋白進(jìn)行理化性質(zhì)分析，結(jié)果表明，該蛋白的理論相對(duì)分子質(zhì)量為57.629 kD，理論等電點(diǎn)為6.95，分子式為C2444H3919N761O804S25，脂肪酸系數(shù)為66.15，平均親水性為－0.772，不穩(wěn)定系數(shù)為41.0，根據(jù)Guruprasad 等方法的計(jì)算結(jié)果表明，該蛋白為不穩(wěn)定蛋白。利用SignalP4.0 Server 人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)算法對(duì)GhWRKY6 基因編碼蛋白進(jìn)行信號(hào)肽預(yù)測(cè)，結(jié)果表明該蛋白的N 端至第70 位氨基酸之間剪切位點(diǎn)分值（C-Value）和綜合剪切分值（Y-Value）無明顯峰值，說明該蛋白的N 端不存在剪切位點(diǎn)，不包含信號(hào)肽，推測(cè)其為非分泌蛋白。利用TMHMM2.0 SERVER對(duì)GhWRKY6 基因編碼蛋白進(jìn)行跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)，在1～525個(gè)氨基酸之間沒有峰值，表明不存在跨膜蛋白，因此推測(cè)其不具有跨膜結(jié)構(gòu)，是細(xì)胞膜外蛋白。

將GhWRKY6在NCBI中行進(jìn)BLASTP比對(duì)，在氨基酸水平上發(fā)現(xiàn)與已報(bào)道的哥倫比亞錦葵 （Herrania umbratical,XP_021287397.1）、可可（Theobroma cacao,XP_007020766.2）、擬南芥（Arabidopsis thaliana,NP_564792.1）、煙草（Nicotiana attenuata,XP_0129249656.1）、葡萄 （Vitis vinifera,XP_002269696.2）和毛果楊（Populus trichocarppe,XP_002321134.3） 的相似性分別為73%、72%、50%、52%、51%和51%。序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)GhWRKY6 基因編碼的氨基酸序列與以上物種存在高度保守區(qū)域（圖2-A）。用MEGA6 軟件繪制系統(tǒng)進(jìn)化樹，結(jié)果表明GhWRKY6 蛋白與可可、哥倫比亞錦葵和擬南芥中的基因存在同源性（圖2-B）。

2.3 GhWRKY6的組織表達(dá)模式

提取陸地棉中棉所24 的根、莖、葉、花瓣（開花當(dāng)天）、胚珠（開花當(dāng)天）和纖維（開花后5 d、開花后10 d、開花后15 d）組織的RNA 進(jìn)行組織特異性表達(dá)模式分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)該基因在根、莖和葉中均有表達(dá)，其中莖中表達(dá)量最高，是根中表達(dá)量的約5.5 倍；但是在花瓣、胚珠和纖維中表達(dá)量極低，尤其是在胚珠中幾乎不表達(dá)(圖3）。由此可知GhWRKY6 在棉花中有很明顯的組織特異性表達(dá)。

2.4 轉(zhuǎn)基因擬南芥的獲得

野生型擬南芥通過蘸花法[14]進(jìn)行轉(zhuǎn)化后收獲種子，使用含有卡那霉素的MS 培養(yǎng)基篩選得到抗性苗。使用GhWRKY6 基因特異引物（表1）對(duì)篩選出的抗性苗進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，以去除假陽性苗。結(jié)果有34 株擬南芥抗性苗可以擴(kuò)增出與陽性對(duì)照（質(zhì)粒）一致的特異性條帶（圖4-B）。

為了得到單拷貝的純合高代轉(zhuǎn)基因擬南芥，我們需要對(duì)陽性苗進(jìn)行逐步篩選。經(jīng)PCR 檢測(cè)獲得最終確定的陽性苗為T1代陽性苗，收獲種子并用含有卡那霉素的MS 培養(yǎng)基篩選，選擇后代中抗性性狀與非抗性性狀比值符合3:1 的株系，即T2代陽性苗。繼續(xù)收獲T2代陽性苗的種子再經(jīng)過含有卡那霉素的MS 培養(yǎng)基篩選，選擇后代全部為抗性性狀的株系，即T3代純合陽性苗（圖4-A）。后續(xù)試驗(yàn)選擇基因表達(dá)量較高的兩個(gè)純合轉(zhuǎn)基因株系OE3 和OE6 進(jìn)行。

2.5 轉(zhuǎn)基因擬南芥表現(xiàn)出對(duì)低磷脅迫的超敏感表型

我們通過GhWRKY6 在擬南芥中的過表達(dá)來進(jìn)一步明確GhWRKY6 在低磷脅迫中的功能。將野生型擬南芥、GhWRKY6 轉(zhuǎn)基因擬南芥和wrky6 突變體擬南芥種子在正常磷濃度的MS 培養(yǎng)基和低磷濃度（LP）的MS 培養(yǎng)基中生長(zhǎng)1 周后發(fā)現(xiàn)，所有擬南芥種子在正常的MS 培養(yǎng)基上萌發(fā)和萌發(fā)后生長(zhǎng)均無明顯差異，植物長(zhǎng)勢(shì)正常；但在低磷MS 培養(yǎng)基中兩個(gè)轉(zhuǎn)基因株系OE3和OE6 表現(xiàn)出比野生型更明顯的受脅迫，種子萌發(fā)速率下降，子葉黃化，而此條件下的wrky6 突變體植株則表現(xiàn)出比野生型較強(qiáng)的抗性，植株的長(zhǎng)勢(shì)稍強(qiáng)于野生型擬南芥（圖5-A）。

低磷脅迫會(huì)影響植物地上和地下部分的生長(zhǎng)。我們將正常MS 培養(yǎng)基上生長(zhǎng)1 周的野生型擬南芥、GhWRKY6 轉(zhuǎn)基因擬南芥和wrky6 突變體擬南芥轉(zhuǎn)移到低磷 （LP）MS 培養(yǎng)基上繼續(xù)生長(zhǎng)，同時(shí)設(shè)置在正常磷含量的MS 培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的擬南芥為對(duì)照，結(jié)果觀察到當(dāng)Pi 充足時(shí)，所有株系的擬南芥根部和葉片生長(zhǎng)無明顯差異；但是當(dāng)Pi 缺乏時(shí)，轉(zhuǎn)基因擬南芥主根生長(zhǎng)受到抑制，側(cè)根數(shù)目減少。因此，在低磷脅迫下，GhWRKY6轉(zhuǎn)基因擬南芥與野生型擬南芥相比，無論是地上部分還是地下部分，其生長(zhǎng)發(fā)育均受到抑制，抗逆性減弱，而wrky6 突變體的種子萌發(fā)和生長(zhǎng)均強(qiáng)于野生型。

2.6 GhWRKY6影響磷信號(hào)通路相關(guān)基因的表達(dá)

為了進(jìn)一步研究GhWRKY6 在低磷脅迫信號(hào)通路中的作用，我們對(duì)WT、GhWRKY6 轉(zhuǎn)基因擬南芥和wrky6 突變體在正常和低磷處理?xiàng)l件下Pi 轉(zhuǎn)運(yùn)通路中一些重要Marker 基因的表達(dá)量進(jìn)行檢測(cè)。有研究表明，磷酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)體（Phosphate transporter,PHT） 家族基因和 SPX-EXS 亞家族PHO1 基因是維持植物體內(nèi)Pi 穩(wěn)態(tài)的關(guān)鍵基因[15]。因此我們重點(diǎn)關(guān)注了這兩類基因在野生型、wrky6 突變體和轉(zhuǎn)基因擬南芥中表達(dá)量的變化。結(jié)果表明： 無論是在Pi 充足還是缺乏的條件下，PHT1；1和PHO1 基因的表達(dá)量在wrky6 突變體中均明顯上調(diào)。在轉(zhuǎn)基因株系中，當(dāng)Pi 充足時(shí)，PHO1 基因的表達(dá)量下降，PHT1；1 基因的表達(dá)量上升； 當(dāng)Pi 缺乏時(shí)，PHO1 基因的表達(dá)量上升，PHT1；1 基因的表達(dá)被抑制。根據(jù)以上結(jié)果我們推測(cè)GhWRKY6 在磷元素的轉(zhuǎn)運(yùn)調(diào)控中起到作用，且對(duì)PHT1；1 和PHO1 基因的調(diào)控依賴于磷含量的變化。

圖5 低磷脅迫對(duì)擬南芥的影響Fig.5 The effect of low phosphorus stress on Arabidopsis

當(dāng) Pi 含量充足時(shí)，PHT 家族中的PHT1;2和PHT1;3 的表達(dá)量在所有擬南芥株系中差異不明顯，但是在低磷（LP）處理?xiàng)l件下PHT1;3 表達(dá)量升高，PHT1;2 表達(dá)量變化不明顯，這可能是低Pi 處理誘導(dǎo)了PHT1;3 的表達(dá)。通過對(duì)低磷脅迫信號(hào)通路中Marker 基因表達(dá)量的變化，我們推測(cè)GhWRKY6 可能是通過調(diào)控磷轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)基因的表達(dá)影響植物體內(nèi)Pi 的穩(wěn)態(tài)，從而響應(yīng)低磷脅迫。

圖6 qRT-PCR 分析基因的表達(dá)量Fig.6 Analysis of the gene expression by qRT-PCR

3 討論

WRKY 轉(zhuǎn)錄因子是植物中最重要的轉(zhuǎn)錄因子家族之一。WRKY 轉(zhuǎn)錄因子家族最顯著的特征是家族成員至少包含一個(gè)由60個(gè)氨基酸殘基構(gòu)成的WRKY 結(jié)構(gòu)域。根據(jù)WRKY 結(jié)構(gòu)域的數(shù)量及鋅指結(jié)構(gòu)的特征，WRKY 轉(zhuǎn)錄因子家族可以被分為3 大組：Ⅰ組通常含有2個(gè)WRKY 結(jié)構(gòu)域，位于C 端的WRKY 結(jié)構(gòu)域具有DNA 結(jié)合活性，N 端的WRKY 域不能單獨(dú)與DNA 結(jié)合，該組鋅指結(jié)構(gòu)是C2H2； Ⅱ組和Ⅲ組都含有一個(gè)WRKY結(jié)構(gòu)域，但不同的是Ⅱ組鋅指結(jié)構(gòu)是C2H2，而Ⅲ組鋅指結(jié)構(gòu)是C2HC[25]。Dou 等利用基因組測(cè)序鑒定出了102個(gè)陸地棉WRKY 基因，并發(fā)現(xiàn)非生物脅迫下表達(dá)量明顯升高的大多是Ⅱ組和Ⅲ組的WRKY 基因[26]。本研究從陸地棉中克隆到一個(gè)WRKY 家族轉(zhuǎn)錄因子GhWRKY6，其屬于WRKY 轉(zhuǎn)錄因子家族的Ⅱb 亞組。GhWRKY6 與擬南芥AtWRKY6 的蛋白序列相似性最高為50%，故兩者可能存在相似功能。雖然有文獻(xiàn)報(bào)道了AtWRKY6 能夠影響種子萌發(fā)[16]，增強(qiáng)擬南芥對(duì)病原體的抗性，加速擬南芥的早衰[17]，參與磷的轉(zhuǎn)運(yùn)調(diào)控[10]，但對(duì)于陸地棉中GhWRKY6 的功能還尚未明確。因此我們通過構(gòu)建過表達(dá)Gh-WRKY6 的轉(zhuǎn)基因擬南芥初步明確了GhWRKY6在植物響應(yīng)低磷脅迫信號(hào)途徑中有重要功能。植物受到低磷脅迫時(shí)，主根的生長(zhǎng)受到抑制，側(cè)根數(shù)量和長(zhǎng)度會(huì)增加[18]；地上部分生物量降低，葉片由于花青素積累顏色由綠變紫[19]。GhWRKY6 轉(zhuǎn)基因擬南芥在低磷脅迫條件下比野生型擬南芥表現(xiàn)出更為明顯的受脅迫，而wrky6 突變體在長(zhǎng)勢(shì)上強(qiáng)于野生型。因此，GhWRKY6 可能作為一個(gè)負(fù)調(diào)控因子參與到植物響應(yīng)低磷脅迫信號(hào)通路中。相對(duì)于干旱、高鹽、冷害和生物脅迫，WRKY 基因參與磷脅迫途徑的報(bào)道相對(duì)較少，尤其是在棉花中。海島棉GbWRKY1 基因是最近幾年報(bào)道的參與Pi 轉(zhuǎn)運(yùn)調(diào)控的棉花WRKY 基因[20]，而有關(guān)陸地棉WRKY 基因的類似報(bào)道目前并未出現(xiàn)，因此本研究結(jié)果為棉花WRKY 基因的功能研究提供了新的依據(jù)。

植物從外界吸收磷元素主要依賴于磷酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，通過磷酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白將外界無機(jī)形式的磷轉(zhuǎn)為能夠被植物吸收和利用的有效磷[21]。磷酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白可被分為PHT 和PHO 兩大類，PHO 家族基因主要作用于植物體內(nèi)Pi 的運(yùn)輸[22]，PHT 家族基因主要作用于植物從外界對(duì)磷的獲取[23]。前人的研究表明擬南芥AtWRKY6 在Pi 充足條件下結(jié)合PHO1 啟動(dòng)子的W-box 抑制PHO1 基因表達(dá)[10]。AtWRKY42 與AtWRKY6 在調(diào)控 Pi轉(zhuǎn)運(yùn)信號(hào)途徑中存在部分功能冗余，兩者都可以抑制PHO1 的表達(dá)，但是PHT1;1 的表達(dá)受AtWRKY42 的激活，從而提高植物獲取Pi 的能力[9]。PHT1;1和PHO1 基因的表達(dá)在wrky6 突變體中上調(diào)，而在轉(zhuǎn)基因株系中，GhWRKY6 對(duì)PHT1;1 和PHO1 基因的調(diào)控依賴于磷含量的變化。因此，GhWRKY6 在棉花中是否存在相似的調(diào)控機(jī)制還需要進(jìn)一步試驗(yàn)證明。

4 結(jié)論

本文以陸地棉cDNA 為模板克隆到一個(gè)WRKY 轉(zhuǎn)錄因子，cDNA 序列全長(zhǎng) 1 575 bp，編碼 525個(gè)氨基酸，定位于 A01 號(hào)染色體的11 509 602～115 119 77 bp 位置，包含有 6個(gè)外顯子，有 1個(gè)典型的 WRKY 結(jié)構(gòu)域 （281～341 AA），命名為GhWRKY6。組織表達(dá)模式分析表明該基因在棉花的根、莖、葉組織中表達(dá)量較高，在其他組織不表達(dá)或表達(dá)量極低，顯示出較明顯的組織特異性表達(dá)模式。過表達(dá)GhWRKY6 轉(zhuǎn)基因擬南芥與野生型擬南芥相比在低磷脅迫下主根生長(zhǎng)受到抑制，側(cè)根減少，生物量減少，表現(xiàn)為磷脅迫敏感表型。磷轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)基因的qRT-PCR分析表明，GhWRKY6 參與磷轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因的調(diào)控。上述結(jié)果表明GhWRKY6 作為負(fù)調(diào)控因子參與到棉花低磷脅迫響應(yīng)信號(hào)途徑中。