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    環(huán)狀RNA與頭頸部腫瘤

    2019-06-14 02:54:26雷芳紅黃衛(wèi)國(guó)
    關(guān)鍵詞:內(nèi)含子環(huán)狀頭頸部

    姜 濤,雷芳紅,黃 蘊(yùn),黃衛(wèi)國(guó)

    (南華大學(xué)衡陽(yáng)醫(yī)學(xué)院腫瘤研究所,腫瘤細(xì)胞與分子病理學(xué)湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,湖南 衡陽(yáng) 421001)

    頭頸部腫瘤(head and neck cancer,HNC)是世界上第六大常見癌癥,具有高發(fā)病率和死亡率,其最常見的誘發(fā)因素包括吸煙和酗酒。除手術(shù)切除,放射和標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞毒性化療干預(yù)之外的治療選擇很少。盡管治療方法在不斷改進(jìn),但HNC的存活率并未顯著提高,仍只有50%左右。由于頭頸部的精細(xì)和復(fù)雜的解剖結(jié)構(gòu),使根治性切除手術(shù)難以實(shí)現(xiàn),迫使人們不斷找尋新的治療方法。與傳統(tǒng)的線性RNA相比,環(huán)狀RNA(Circular RNA,circRNA)不具有5′和3′末端,而是形成共價(jià)閉合的連續(xù)環(huán)。不易被核酸外切酶降解,半衰期長(zhǎng)達(dá)48h,比線性RNA更加穩(wěn)定,具有高度的保守性,組織特異性,在腫瘤診斷和治療靶點(diǎn)上存在潛在的價(jià)值[1]。

    1 環(huán)狀RNA的形成

    1971年,研究者首次在植物中發(fā)現(xiàn)環(huán)形植物類病毒,其基因組由閉合的單鏈RNA分子組成[2]。先前的觀點(diǎn)認(rèn)為,環(huán)狀RNA是錯(cuò)誤拼接的產(chǎn)物,并不具有生理功能。隨著高通量技術(shù)的發(fā)展,越來(lái)越多的環(huán)狀RNA分子被發(fā)現(xiàn)。目前發(fā)現(xiàn)的環(huán)狀RNA主要來(lái)源于基因外顯子,內(nèi)含子也很大程度參與了其形成。目前對(duì)環(huán)狀RNA的產(chǎn)生機(jī)制尚不明確,研究表明環(huán)狀RNA通過(guò)特殊的可變剪切產(chǎn)生,可變形式也多種多樣。外顯子環(huán)化形成的環(huán)狀RNA有兩種模型,一種是由基因外顯子共價(jià)結(jié)合構(gòu)成環(huán)化的“套索驅(qū)動(dòng)環(huán)化”;另一種是由雙內(nèi)含子互補(bǔ)配對(duì)形成環(huán)狀結(jié)構(gòu)的 “內(nèi)含子配對(duì)驅(qū)動(dòng)環(huán)化”,再通過(guò)剪接體剪切剩余內(nèi)含子形成不同的環(huán)狀RNA分子[3]。另外,由RNA結(jié)合蛋白(RNA Binding Protein,RBP)和反式作用因子也可以促進(jìn)環(huán)狀RNA的形成。根據(jù)環(huán)狀RNA成環(huán)方式不同,環(huán)狀RNA可分為僅具內(nèi)含子的ciRNA;外顯子來(lái)源的circRNA;由外顯子和內(nèi)含子共同組成的ElciRNA。此外,前體tRNA可以被切割成環(huán)以形成tricRNA。另外發(fā)現(xiàn)在白血病早幼粒白血病/維甲酸受體(PML/RARα)基因的染色體易位中發(fā)現(xiàn)了兩個(gè)融合環(huán)狀RNA,體內(nèi)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)其能促進(jìn)細(xì)胞轉(zhuǎn)化和腫瘤生長(zhǎng)[4]。

    2 環(huán)狀RNA的生物學(xué)功能

    近年,隨著研究的不斷增多,環(huán)狀RNA的各種生物學(xué)功能不斷被發(fā)現(xiàn),內(nèi)源性環(huán)狀RNA通過(guò)不同的機(jī)制參與基因表達(dá)調(diào)控,發(fā)揮不同的功能。見圖1。

    2.1 調(diào)控線性RNA的表達(dá)

    環(huán)狀RNA的形成方式多種多樣,基因組同一位置可轉(zhuǎn)錄出mRNA和環(huán)狀RNA分子,同一基因位點(diǎn)又可以轉(zhuǎn)錄出不同的環(huán)狀RNA分子。環(huán)狀RNA可以通過(guò)非經(jīng)典剪切方式,與前體mRNA形成的經(jīng)典剪切方式相互競(jìng)爭(zhēng),影響mRNA的表達(dá)。此外,通過(guò)內(nèi)含子序列間競(jìng)爭(zhēng)互補(bǔ)配對(duì)可以形成不同的環(huán)狀RNA分子,這些環(huán)狀RNA分子間存在競(jìng)爭(zhēng)性平衡關(guān)系可影響到mRNA的表達(dá)。

    2.2 調(diào)控親本基因的轉(zhuǎn)錄

    不同的環(huán)狀RNA分子通過(guò)不同的途徑調(diào)控其親本基因的轉(zhuǎn)錄。分布在細(xì)胞核中且僅具有內(nèi)含子的ciRNA可直接與DNA聚合酶II (pol II)結(jié)合促進(jìn)其親本基因的轉(zhuǎn)錄;保留內(nèi)含子和外顯子的ElciRNA首先與核糖體U1小核RNA(SnRNPs)結(jié)合形成復(fù)合物,進(jìn)一步與Pol II結(jié)合促進(jìn)親本基因的轉(zhuǎn)錄。在細(xì)胞質(zhì)中富集且僅具外顯子的circRNA,可以吸附miRNA間接來(lái)調(diào)控其親本基因的表達(dá)。

    2.3 發(fā)揮內(nèi)源性競(jìng)爭(zhēng)RNA(ceRNA)的作用

    研究發(fā)現(xiàn),一些高度富集的環(huán)狀RNA能起到ceRNA的作用。CDR1基因來(lái)源的環(huán)狀RNA CiRs-7具有70個(gè)miR-7結(jié)合位點(diǎn),能夠大量吸附miR-7來(lái)影響哺乳動(dòng)物興奮性突觸傳遞功能[6]。此外,circRNA_036186 通過(guò)circRNA_036186/miR-193b-3p/14-3-3ζ信號(hào)軸發(fā)揮ceRNA作用來(lái)影響頭頸部腫瘤的發(fā)生發(fā)展。但是,大多數(shù)環(huán)狀RNA的表達(dá)水平很低,而且只有少數(shù)環(huán)狀RNA具有多個(gè)結(jié)合位點(diǎn)來(lái)結(jié)合一個(gè)特定的miRNA。并且環(huán)狀RNA的大部分功能還未知,作為miRNA海綿可能并不是環(huán)狀RNA的主要作用。

    2.4 通過(guò)相關(guān)蛋白起作用

    環(huán)狀RNA 可以與不同的RBP結(jié)合后可影響相關(guān)蛋白的功能。多功能蛋白甘露糖結(jié)合凝集素(mannose binding lectin,MBL)可以調(diào)控circMBL及其線性mRNA的產(chǎn)生,讓其達(dá)到一種平衡。此外,circFoxo3與ID-1,E2F1,F(xiàn)AK和HIFα多種蛋白結(jié)合共同作用影響其抗衰老作用。

    2.5 翻譯蛋白質(zhì)

    環(huán)狀RNA結(jié)構(gòu)的特殊性使其翻譯蛋白的方式不同于線性RNA分子。環(huán)狀RNA分子通過(guò)翻譯啟動(dòng)元件(Internal Ribosome Entry Site,IRES)和開放閱讀框(Open Reading Frame,ORF)翻譯蛋白質(zhì)。初步研究顯示,circ-ZNF609通過(guò)IRES可直接翻譯蛋白并參與肌肉的發(fā)生過(guò)程[7]。此外,基于核糖體印跡分析發(fā)現(xiàn)果蠅大腦中也存在大量可翻譯蛋白的環(huán)狀RNA。

    2.6 通過(guò)融合環(huán)狀RNA發(fā)揮作用

    基因的突變過(guò)程可以產(chǎn)生大量的融合基因,并普遍存在于癌癥基因組中。研究發(fā)現(xiàn),環(huán)狀RNA也參與了這一過(guò)程,協(xié)同其他致癌因素如融合蛋白發(fā)生異常融合,促進(jìn)腫瘤的發(fā)生發(fā)展[4]。

    2.7 作為疾病診斷標(biāo)志物

    環(huán)狀RNA的生物學(xué)特性,使得環(huán)狀RNA在外泌體、血漿、尿液、唾液中比mRNA、miRNA,長(zhǎng)鏈非編碼RNA(long non-coding RNA,LncRNA)更穩(wěn)定。環(huán)狀RNA有望成為疾病診斷的生物標(biāo)志物(表1)。

    表1 環(huán)狀RNA作為診斷標(biāo)志物

    3 環(huán)狀RNA與頭頸部腫瘤

    環(huán)狀RNA在消化,神經(jīng)和免疫系統(tǒng)疾病中起重要作用,并且在胚胎和外泌體以及腫瘤中高度富集。與正常細(xì)胞相比,環(huán)狀RNA在腫瘤細(xì)胞外泌體中大量富集,并且腫瘤患者血清外泌體環(huán)狀RNA的富集程度與腫瘤的大小有關(guān)[8]。表明環(huán)狀RNA在腫瘤診斷和治療中具有潛在作用(圖2)。

    圖2 環(huán)狀RNA與頭頸部腫瘤

    3.1 環(huán)狀RNA與口腔癌

    在人口腔鱗狀細(xì)胞癌(Oral squamous cell carcinoma,OSCC)中,hsa_circ_0109291表達(dá)顯著增加,低表達(dá)可抑制OSCC細(xì)胞系的增殖和遷移。并且,環(huán)狀RNA可通過(guò)hsa_circ_0008309-miR-136-5P/hsa-miR-382-5P-ATXN1信號(hào)軸調(diào)節(jié)口腔癌的進(jìn)程[9]。此外,circRNA_100290在OSCC組織中上調(diào),并與細(xì)胞周期依賴性蛋白激酶6(cyclin dependent kinase 6,CDK6)共表達(dá),通過(guò)海綿吸附miR-29b家族成員調(diào)節(jié)CDK6表達(dá),體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)敲除circRNA_100290能降低CDK6的表達(dá)并抑制OSCC細(xì)胞的增殖。此外,研究發(fā)現(xiàn)circSry擁有16個(gè)miR-138結(jié)合位點(diǎn)而發(fā)揮ceRNA的作用[10],并且在口腔鱗狀細(xì)胞癌中,miR-138顯著下調(diào),而miR-138能結(jié)合Yes相關(guān)蛋白1的mRNA的3′-非翻譯區(qū)(untranslated region,UTR)來(lái)抑制細(xì)胞增殖,從而調(diào)控口腔癌的發(fā)生發(fā)展。近期研究發(fā)現(xiàn),circDOCK1通過(guò)調(diào)控miR-196a-5p的表達(dá)靶向調(diào)節(jié)BIRC3,從而抑制OSCC凋亡[11]。不僅如此,OSCC患者術(shù)后唾液中hsa_circ_0001874和hsa_circ_0001971的表達(dá)水平明顯降低。此外,hsa_circ_001242的表達(dá)水平與腫瘤大小和T分期呈負(fù)相關(guān)。因此,環(huán)狀RNA在口腔鱗癌中起著重要的作用。

    3.2 環(huán)狀RNA與下咽癌

    通過(guò)circRNA微陣列分析下咽鱗狀細(xì)胞癌(hypopharyngeal squamous cell carcinoma,HSCC)獲得2392個(gè)差異環(huán)狀RNA分子。其中,1303個(gè)circRNA在HSCC組織中上調(diào),1088個(gè)circRNA下調(diào)。在HSCC組織中,hsa_circ_0058106,hsa_circ_0058107和hsa_circ_0024108的表達(dá)顯著增高。hsa_circ_0036722,hsa_circ_0002260和hsa_circ_0001189的表達(dá)顯著降低[12]。但針對(duì)這些circRNA在HSCC中的作用尚未進(jìn)行證實(shí),仍需進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)。此外,也有研究通過(guò)分析HSCC中失調(diào)環(huán)狀RNA差異譜,發(fā)現(xiàn)hsa_circ_0008287和hsa_circ_0005027兩個(gè)環(huán)狀RNA,可通過(guò)circRNA-miRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)調(diào)控miR-548C-3p的表達(dá),通過(guò)調(diào)控miR-548C-3p的表達(dá)間接調(diào)控ErbB,Hippo信號(hào)傳導(dǎo)途徑進(jìn)而影響HSCC的預(yù)后[13]。

    3.3 環(huán)狀RNA與喉頭癌

    通過(guò)高通量測(cè)序篩選喉鱗狀細(xì)胞癌(Laryngeal squamous cell carcinoma,LSCC)組織,獲得698個(gè)差異環(huán)狀RNA,其中302個(gè)表達(dá)上調(diào)和396個(gè)表達(dá)下調(diào)。其中,hsa_circRNA_100855在LSCC組織中顯著上調(diào),并且hsa_circRNA_100855的高表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和晚期臨床分期有關(guān)。相反,hsa_circRNA_104912在LSCC組織中顯著下調(diào),且與TMN分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)。最新研究發(fā)現(xiàn)通過(guò)檢測(cè)環(huán)狀RNA分子可以區(qū)分LSCC標(biāo)本和正常標(biāo)本[14]。綜上所述,環(huán)狀RNA可能在LSCC的發(fā)生發(fā)展中起重要作用,并可能有助于該疾病的診斷和預(yù)后。

    3.4 環(huán)狀RNA與鼻咽癌

    研究發(fā)現(xiàn),在鼻咽癌中[15],miR-7可影響鼻咽癌細(xì)胞系CNE-1和CNE-2的放射敏感性,其表達(dá)水平越高,細(xì)胞對(duì)輻射的敏感性越強(qiáng)。ciRS-7發(fā)揮ceRNA作用,海綿吸附miR-7影響鼻咽癌的放療敏感性[10]。并且miR-7還通過(guò)抑制EGFR/PI3K/Akt信號(hào)傳導(dǎo)途徑抑制鼻咽癌細(xì)胞增殖和集落形成。最新研究發(fā)現(xiàn),在鼻咽癌患者血清和組織中,circRNA_0000285顯著增加,并影響鼻咽癌患者的放療敏感性[16]。另外,circSry通過(guò)海綿吸附miR-138影響細(xì)胞周期蛋白D1的表達(dá),從而影響鼻咽癌的發(fā)生發(fā)展。研究報(bào)道,cir-ITCH是一種腫瘤抑制基因,在食管鱗狀細(xì)胞癌中顯著下調(diào),充當(dāng)miR-17和miR-214海綿,提高ITCH水平;而ITCH的過(guò)表達(dá)可促進(jìn)泛素介導(dǎo)的蓬亂蛋白2(DVL2)降解并抑制癌基因c-Myc的表達(dá),從而抑制Wnt /β-catenin信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑來(lái)影響鼻咽癌的進(jìn)程[17]。

    3.5 環(huán)狀RNA與舌癌

    在舌鱗癌細(xì)胞中(Tongue squamous cell,TSCC)[18],ciRS-7可海綿吸附miR-7,促進(jìn)胰島素樣生長(zhǎng)因子1受體(insulin-like growth factor 1,IGF1R)的表達(dá),誘導(dǎo)由胰島素樣生長(zhǎng)因子1(IGF1)誘導(dǎo)的Akt信號(hào)通路激活,促進(jìn)細(xì)胞增殖和細(xì)胞周期,抑制細(xì)胞凋亡的作用。circ-ITCH海綿吸附miR-214,促進(jìn)p53蛋白質(zhì)的表達(dá),抑制Bcl-2/Bax相關(guān)蛋白質(zhì)的作用,達(dá)到抑癌的效果。此外,circSry通過(guò)吸附miR-138促進(jìn)GNAI2的表達(dá),影響舌鱗狀細(xì)胞癌的轉(zhuǎn)移。通過(guò)高通量測(cè)序分析TSCC組織和鄰近組織發(fā)現(xiàn),環(huán)狀RNA在一定程度上參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展,并且與腫瘤相關(guān)的miRNA具有復(fù)雜的相關(guān)性。

    4 環(huán)狀RNA研究策略

    環(huán)狀RNA在疾病中作用機(jī)制的研究是時(shí)下的熱點(diǎn)。用于檢測(cè)環(huán)狀RNA表達(dá)及其功能研究的方法有很多??梢酝ㄟ^(guò)RNA測(cè)序和微陣列篩選目標(biāo)環(huán)狀RNA,然后利用逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng),液滴數(shù)字PCR,RNA印跡和熒光原位雜交進(jìn)行驗(yàn)證。通過(guò)過(guò)表達(dá)或敲除實(shí)驗(yàn)進(jìn)行環(huán)狀RNA功能研究。結(jié)合生物信息學(xué),RNA免疫共沉淀和RNA質(zhì)譜進(jìn)行機(jī)制研究。目前,已經(jīng)開發(fā)了很多的數(shù)據(jù)庫(kù)和分析工具供研究者使用(表2)。CircInteractome具有環(huán)狀RNA引物和干擾RNA設(shè)計(jì)功能。ExoRBase用于分析血液外泌體中特異性環(huán)狀RNA分子。通過(guò)這些免費(fèi)工具,我們可以分析組織、血液、外泌體中環(huán)狀RNA的差異表達(dá),預(yù)測(cè)與之結(jié)合的miRNA,研究環(huán)狀RNA分子具有的功能。

    表2 環(huán)狀RNA數(shù)據(jù)庫(kù)

    5 結(jié) 論

    綜上所述,環(huán)狀RNA的穩(wěn)定性和特異性,在靶點(diǎn)的準(zhǔn)確性上優(yōu)于miRNA和lncRNA,在腫瘤診斷和治療中存在潛在的價(jià)值。如果能實(shí)現(xiàn)體內(nèi)控制內(nèi)源環(huán)狀RNA在特定組織和細(xì)胞中的表達(dá),可能增加治療的療效,極大降低外源物質(zhì)所帶來(lái)的副作用,這將增加環(huán)狀RNA的價(jià)值,也將是未來(lái)基因治療的重大突破。盡管已經(jīng)初步提出了環(huán)狀RNA的形成模型,但是仍需要大量的實(shí)驗(yàn)來(lái)探索其生成機(jī)制,包括環(huán)狀RNA的產(chǎn)生、二級(jí)結(jié)構(gòu),以及不同RNA之間的的相互關(guān)系。目前,腫瘤中環(huán)狀RNA的檢測(cè)主要依賴于組織樣本,而頭頸部腫瘤位置的特殊性以及復(fù)雜性使組織樣品獲得困難,增加了臨床研究難度。與組織相比,血液中的環(huán)狀RNA表達(dá)通常很高,細(xì)胞可以通過(guò)外泌體將環(huán)狀RNA分泌到血液中。因此,血液,尿液,唾液等更容易獲得的非侵入性臨床樣本將在未來(lái)頭頸部腫瘤環(huán)狀RNA研究中廣泛應(yīng)用。

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