蟲白蠟治療雄激素性脫發(fā)的作用機(jī)理研究

1.中國林業(yè)科學(xué)院資源昆蟲研究所，云南 昆明 650233；2.玉溪師范學(xué)院化學(xué)生物與環(huán)境學(xué)院，云南 玉溪 653100

脫發(fā)已經(jīng)成為一個世界性的難題，它嚴(yán)重影響患者的自尊心。脫發(fā)藥物的研究與開發(fā)成為當(dāng)今研究熱點(diǎn)。文獻(xiàn)報道延長毛囊生長期能有效的阻止毛發(fā)的脫落[1]。提高毛囊營養(yǎng)供應(yīng)和阻止毛囊由生長期進(jìn)入退休期是阻止毛發(fā)生長的有效措施之一,由皮乳頭細(xì)胞分泌血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)是毛囊營養(yǎng)的主要來源[2]。VEGF通過促進(jìn)毛細(xì)血管的形成，調(diào)控與毛球相連的毛細(xì)血管的數(shù)量，為毛囊的生長提供營養(yǎng)。存在于毛囊的內(nèi)根鞘的表皮生長因子。具有調(diào)節(jié)角質(zhì)細(xì)胞的增殖和分化，促進(jìn)外根鞘細(xì)胞的生長，控制毛囊生長期的長短的作用[3-5]。毛囊的生長周期分為生長期、退行期和休止期，不同生長階段毛囊的形態(tài)和毛囊內(nèi)堿性磷酸酶的表達(dá)量不同。生長期，毛囊逐漸由表皮層延伸到真皮層，毛囊柄逐漸延長，毛球膨大呈圓形，毛囊結(jié)構(gòu)完整(即在毛囊橫切面能明顯看到毛干、內(nèi)根鞘、外根鞘和芥蒂組織)。退行期，毛囊從真皮層逐漸萎縮上升到表皮層，毛囊柄萎縮變短，毛球呈釘型，毛囊的內(nèi)根鞘結(jié)構(gòu)紊亂，看不到毛囊內(nèi)根鞘[6]。休止期，毛囊柄繼續(xù)縮短，位于皮膚的表皮層。由于毛囊循環(huán)具有不可逆性，因此，生長期毛囊數(shù)量和退行期毛囊數(shù)量的比值是評價毛囊生長狀態(tài)重要的指標(biāo)之一[7]。堿性磷酸酶是存在于毛囊內(nèi)的有一種鋅指酶，其表達(dá)量的高低反應(yīng)了毛囊所處的生長階段。堿性磷酸酶表達(dá)量在毛囊生長期的初級階段最高，隨后逐漸降低直至退行期。毛囊進(jìn)入下一個循環(huán)后，堿性磷酸酶表達(dá)量也隨之發(fā)生升降變化[8]。由此可知，生長期與休止期毛囊數(shù)量的比值(A/T)可用于評價毛發(fā)的生長狀況。堿性磷酸酶在皮膚內(nèi)表達(dá)量反應(yīng)毛囊的生長階段。提高血管內(nèi)皮生長因子和表皮生長因子的表達(dá)量，可延長毛囊的生長期，阻止毛發(fā)脫落。

蟲白蠟是半翅目Hemiptera蚧總科Coccoidea蟲白蠟蚧屬Ericerus的蟲白蠟蟲雄性幼蟲在寄主植物枝條上分泌的次生代謝物質(zhì)，其主要成分為碳原子數(shù)在48～64范圍內(nèi)蠟酯，含量為93%～95%[9]，是我國特有的一種昆蟲藥。早在《本草綱目》收錄的《集玄方》中記載“頭上禿瘡，蠟燭頻涂，勿令日曬，久則生發(fā)”，表明蟲白蠟對真菌感染引起的脫發(fā)具有一定的作用效果。筆者研究發(fā)現(xiàn)蟲白蠟?zāi)苊黠@促進(jìn)脂溢性脫發(fā)模型小鼠毛發(fā)的生長，但對其治療脂溢性脫發(fā)的機(jī)理尚不清楚。本文以脂溢性脫發(fā)小鼠為模式動物，通過檢測蟲白蠟對毛發(fā)重量、不同時期毛囊數(shù)量、表皮生長因子、血管內(nèi)皮生長因子和堿性磷酸酶的表達(dá)量，探究蟲白蠟對毛囊生長期的調(diào)節(jié)作用，為蟲白蠟產(chǎn)品的開發(fā)和應(yīng)用奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)藥物 蟲白蠟：購自于四川峨眉蟲白蠟研究所；米諾地爾酊劑(曼迪)：購自浙江萬晟藥業(yè)有限公司，含量為5%，批號：160103。丙酸睪酮購自杭州動物藥品廠，生產(chǎn)批號：150813，丙酸睪酮溶解到滅菌大豆油中，配置成濃度為5 mg/mL的溶液；堿性磷酸酶試劑盒：南京建成生物工程研究所，批號：20160618；血管內(nèi)皮生長因子試劑盒和表皮細(xì)胞生長因子試劑盒：上海依科賽生物制品有限公司，批號分別為21F120和21E254；一步法動物組織活性蛋白提取試劑盒：生工生物工程股份有限公司，批號：C325DA0008。

1.2 試驗(yàn)動物 試驗(yàn)動物：KM小鼠購自于北京華阜康生物科技股份有限公司，SPF級，5周齡雄鼠，批準(zhǔn)文號：11401300042992，在室內(nèi)適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，飼養(yǎng)溫度為室溫，光照L∶D=12 h∶12 h，飼喂人工飼料，食物和水不限量供應(yīng)。

1.3 儀器 倒置顯微鏡：型號VHX-1000，基恩，日本，石蠟切片機(jī)：型號RM2126RT，上海徠卡儀器有限公司。多功能酶標(biāo)儀：型號3001-1592，賽默飛世爾科技，氣相色譜：型號HP1890，惠普上海分析儀器有限公司。

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1 試驗(yàn)動物分組與處理 將150只KM小鼠隨機(jī)分成6組，設(shè)CK組(不做任何處理)、模式組(皮下注射丙酸睪酮)、陽性對照組(皮下注射丙酸睪酮+局部涂抹2%非那雄胺)、實(shí)驗(yàn)組(皮下注射丙酸睪酮的同時局部分別涂抹5%、10%和15%蟲白蠟)，每組25只試驗(yàn)動物，動物模型的建立參照Renuka等[10]的報道，每天在小鼠背部皮下注射0.1 mL丙酸睪酮，連續(xù)注射60 d。皮下給藥的同時，除模式組外，其他組每天在小鼠背部局部涂抹0.5 mL相應(yīng)的藥液。

1.4.2 毛囊生長期/休止期(A/T) 給藥第7(只稱取毛發(fā)重量)、14、21、28、45、60天每組隨機(jī)選取5只小鼠，用乙醚迷暈后脫頸處死，剪下小鼠背部面積為2 cm×3 cm的毛發(fā)及皮膚，剪下的毛發(fā)直接稱量其重量，皮膚在4%多聚甲醛中固定12 h，流水沖4 h，在不同濃度的乙醇中(30%、50%、70%、85%、90%、95%、無水乙醇、二甲苯)脫水、浸蠟、裝盒，橫切蠟塊，烤箱58～60 ℃過夜，H&E染色。記錄1 mm皮膚范圍內(nèi)生長期(A)和休止期(T)毛囊的數(shù)量，計算生長期與休止期的比值(A/T)。生長期判斷標(biāo)準(zhǔn)為具有完整的毛囊結(jié)構(gòu)，即具有內(nèi)根鞘、外根鞘；休止期判斷標(biāo)準(zhǔn)為毛囊沒有內(nèi)根鞘[6]。

1.4.3 堿性磷酸酶活性測定 取給藥第14、21、28、45、60天小鼠背部皮膚，剪碎，稱重，加入4倍量0.1M的磷酸緩沖鹽(pH值為7.4) ，在玻璃均漿器中勻漿，12000 rpm，4 ℃離心20 min，取上清液，分裝放在-70 ℃條件下保存。用堿性磷酸酶試劑盒測定皮膚內(nèi)堿性磷酸酶(ALP)的含量，操作步驟按照試劑盒說明進(jìn)行。在96孔板內(nèi)添加適量的樣品和試劑，37 ℃孵育15 min，加入顯色劑，搖勻，用酶標(biāo)儀在520 nm波長時測定每孔的吸光度值。采用考馬斯亮測定樣品中蛋白質(zhì)的含量，每個樣品3次重復(fù)。按照下列公式計算樣品中ALP的活性：皮膚內(nèi)ALP活性=(測定OD-空白OD值)/(標(biāo)準(zhǔn)OD值-空白OD值)×酚標(biāo)準(zhǔn)品濃度/待測樣本蛋白濃度。

1.4.4 生長因子測定 試驗(yàn)第28天，每組隨機(jī)選取5只小鼠，取小鼠背部皮膚，剪碎，稱重，按一步法動物組織活性蛋白提取試劑盒操作說明進(jìn)行。加入9倍量的組織提取液，在冰上孵育20 min，4 ℃離心，取上清液，采用試劑盒測定皮膚內(nèi)血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)和表皮生長因子(EGF)，操作步驟按照試劑盒說明進(jìn)行。用酶標(biāo)儀在450 nm波長時測定樣品中血管內(nèi)皮生長因子的吸光度值，在560 nm波長時測定樣品中表皮生長因子的吸光度值。采用考馬斯亮測定樣品中蛋白質(zhì)的含量。每個樣品3次重復(fù)。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算出每個樣品的濃度除于樣品蛋白質(zhì)濃度。

2 試驗(yàn)結(jié)果

2.1 毛發(fā)重量 給藥60 d，蟲白蠟和陽性對照組小鼠背毛生長情況明顯優(yōu)于模式組。蟲白蠟組背毛有光澤，毛發(fā)生長濃密，模式組小鼠背部脫毛明顯(如圖1)。蟲白蠟組單位面積內(nèi)毛發(fā)的重量高于模式組。給藥21 d，各組小鼠被毛重量達(dá)到峰值，隨后毛發(fā)的重量降低，其中，CK組和10%蟲白蠟組毛發(fā)重量在給藥第28天時緩慢上升，15%蟲白蠟組和陽性對照組在給藥第45天時才開始上升。如圖2所示。

2.2 毛囊A/T比值 小鼠毛囊A/T比值隨著給藥時間發(fā)生變化，蟲白蠟組毛囊A/T變化趨勢與陽性對照組相似，呈“N”字形，在給藥第28天和45天，分別出現(xiàn)最高點(diǎn)和最低點(diǎn)，其值明顯高于模式組。給藥28 d時，10%蟲白蠟A/T比值明顯高于CK組、陽性對照和5%、10%蟲白蠟組。給藥60d時，除模式組外，各組A/T比值差異不顯著。如圖3所示。

2.3 堿性磷酸酶活性 皮下連續(xù)注射丙酸睪酮60 d，小鼠皮膚內(nèi)ALP含量下降，其最高值出現(xiàn)的時間早于CK組，給予不同濃度的蟲白蠟和米諾地爾后，ALP含量明顯升高，且隨著給藥時間發(fā)生改變。其中，蟲白蠟組ALP變化趨勢與陽性對照組相似，即給藥14～28 d，ALP呈上升狀態(tài)，隨后降低，給藥45 d，ALP含量降到最低點(diǎn)后反彈；給藥45～60 d，10%蟲白蠟組ALP含量明顯高于5%、15%蟲白蠟和陽性對照組。如圖4所示。

2.4 生長因子 給藥第28天，蟲白蠟組和陽性對照組小鼠皮膚內(nèi)血管內(nèi)皮生長因子和表皮生長的表達(dá)量明顯高于模式組。隨著蟲白蠟濃度的增加，VEGF含量增加，蟲白蠟用量高于10%時，VEGF含量與陽性對照組和CK組差異不顯著。EGF的含量變化不隨蟲白蠟濃度的升高發(fā)生變化。10%蟲白蠟組EGF的含量明顯低于低于5%、15%蟲白蠟組，其值與CK組差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

表1不同處理小鼠皮膚內(nèi)生長因子的表達(dá)量

處理血管內(nèi)皮生長因子表皮生長因子CK42.51±5.151478.55±112.62?模式36.78±2.81 765.85±35.845%米諾地爾66.53±10.77△2418.56±132.95?5%蟲白蠟39.32±4.131966.01±127.47?10%蟲白蠟55.94±7.541488.44±125.78?15%蟲白蠟63.64±4.40△2550.06±130.20?

注：與模式組比較，*P<0.01，△P<0.05。

3 討論

給藥期間，蟲白蠟組小鼠皮膚內(nèi)ALP表達(dá)量、A/T、毛發(fā)重量隨時間發(fā)生變化，出現(xiàn)峰值的時間早于CK組，而與陽性對照組相同，分別為28 d和45 d；給藥28 d時，測定小鼠皮膚內(nèi)VEGF和EGF表達(dá)量，結(jié)果顯示，蟲白蠟濃度為10%時VEGF的表達(dá)量最低，其值明顯高于模式組，而與CK組差異不顯著。表明，皮下注射丙酸睪酮后縮短了毛囊的周期，給予蟲白蠟后能提高雄激素性脫發(fā)模型小鼠毛發(fā)營養(yǎng)的供應(yīng)。

現(xiàn)代研究表明，延長毛囊的生長期，提高毛囊營養(yǎng)的供應(yīng)可有效防治毛發(fā)的脫落[11]。ALP和A/T是評價毛囊處于生長期的關(guān)鍵性指標(biāo)。VEGF和EGF是毛囊營養(yǎng)供應(yīng)的關(guān)鍵指標(biāo)[12-14]。毛囊具有循環(huán)再生的能力，其生長過程包括生長期、退行期和休止期。在生長期內(nèi)毛囊細(xì)胞生長旺盛，毛囊柄伸入到真皮層，分泌較多的VEGF，為毛囊提供充足的營養(yǎng)，生成的毛干直徑較粗，毛發(fā)較長；在退行期毛囊細(xì)胞開始凋亡，VEGF分泌量減少，毛干開始萎縮，其長度隨著毛囊柄長度的縮短而減少，到休止期毛囊到達(dá)表皮層，細(xì)胞幾乎不分泌VEGF，毛囊營養(yǎng)供應(yīng)不足，毛發(fā)開始脫落。正常情況下，毛囊的三個生長階段同時存在，共同維持新舊毛發(fā)的更替。當(dāng)退行期和休止期毛囊數(shù)量增多時，會導(dǎo)致毛發(fā)的脫落。有效的促進(jìn)VEGF的分泌，能延長毛囊的生長期，提高生長期毛囊的數(shù)量，阻止毛發(fā)的脫落，從而達(dá)到治療脫發(fā)的目的。EGF是毛囊生長期與退行期轉(zhuǎn)化的開關(guān)[5]。文獻(xiàn)報道，表皮生長因子促進(jìn)毛發(fā)生長的作用與其劑量關(guān)系密切，其表達(dá)量只有在2×103～2×104pg/mL范圍內(nèi)才能促進(jìn)毛發(fā)的生長[5，15]。因此，控制EGF的表達(dá)量在適宜的范圍也可有效的阻止毛發(fā)的脫落，達(dá)到治療脫發(fā)的目的。

Lida[8]報道，ALP在毛囊生長期的初期表達(dá)量最高，隨后其含量降低，一直持續(xù)到休止期，堿性磷酸酶在休止期內(nèi)的含量最低。由此可知，除了A/T比值外，ALP含量變化也能反映毛囊生長期的變化。經(jīng)過研究筆者發(fā)現(xiàn)，皮下注射丙酸睪酮后，小鼠皮膚內(nèi)ALP的變化趨勢與A/T比值相同，即ALP的表達(dá)量和A/T比值在28 d和45 d時出現(xiàn)高峰和低谷。測試范圍內(nèi)，CK組ALP和A/T比值一直處于平穩(wěn)的的上升階段。給予蟲白蠟后，小鼠皮膚內(nèi)ALP值出現(xiàn)的時間與模式組相同，但其表達(dá)量明顯高于模式組。表明，皮下注射丙酸睪酮后，毛囊生長周期縮短，其生長初期和休止期分別始于給藥后的28d和45d，給與蟲白蠟后并不能改變毛囊的生長周期。

測定生長期表皮內(nèi)小鼠的VEGF和EGF發(fā)現(xiàn)，10%蟲白蠟VEGF和EGF表達(dá)量與CK組差異不顯著，其值明顯高于模式組。表明，蟲白蠟通過提高毛囊內(nèi)的血管內(nèi)皮生長因子表達(dá)量，促進(jìn)毛囊營養(yǎng)的供應(yīng)，治療脂溢性脫發(fā)。但10%蟲白蠟組VEGF和EGF表達(dá)量與陽性對照組相比表現(xiàn)為不同的顯著性，10%蟲白蠟組VEGF表達(dá)量與陽性對照差異不顯著，而其EGF表達(dá)量明顯低于陽性對照組，這可能是導(dǎo)致蟲白蠟組促進(jìn)毛發(fā)生長的效果優(yōu)于陽性對照組的原因。關(guān)于這一點(diǎn)還需進(jìn)一步驗(yàn)證。