心血管系統(tǒng)異常胎兒的染色體微陣列分析

耿娟 趙馨 王逾男 盧建 郭莉 黃偉偉 陳漢彪 何天文 尹愛華*

(1.廣州醫(yī)科大學(xué)附屬廣東省婦兒醫(yī)院，廣東 廣州 511442；2.廣東省婦幼保健院 醫(yī)學(xué)遺傳中心，廣東 廣州 510010)

心血管系統(tǒng)異常胎兒的染色體微陣列分析

耿娟1趙馨2王逾男2盧建2郭莉2黃偉偉2陳漢彪2何天文2尹愛華2*

(1.廣州醫(yī)科大學(xué)附屬廣東省婦兒醫(yī)院，廣東 廣州 511442；2.廣東省婦幼保健院 醫(yī)學(xué)遺傳中心，廣東 廣州 510010)

目的 探討染色體微陣列分析技術(shù)在產(chǎn)前超聲提示為先天性心臟病胎兒中的遺傳學(xué)診斷價(jià)值。方法 收集154例因產(chǎn)前超聲診斷為先天性心臟病的胎兒，取其羊水或臍血行染色體微陣列分析，其中111例病例同時(shí)行染色體核型分析。并根據(jù)單一心臟結(jié)構(gòu)畸形、多發(fā)心臟結(jié)構(gòu)畸形不合并心外畸形、心內(nèi)合并心外畸形分為3組。結(jié)果 154例行染色體微陣列檢測(cè)的胎兒中，37例結(jié)果異常，總致病性拷貝數(shù)變異的檢出率為24.03%；111例核型分析結(jié)果中，共檢測(cè)到13例異常結(jié)果，核型異常檢出率為11.71%，兩者差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.029)。 單一心臟結(jié)構(gòu)畸形組50例，多發(fā)心血管系統(tǒng)異常組57例，心內(nèi)合并心外畸形組47例。3組染色體微陣列分析結(jié)果異常率分別為2%(1/50)、31.58%(18/57)、38.30%(18/47)，3組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)。3組染色體異常率分別為0%(0/39)、10.53%(4/38)、26.47%(9/34)，3組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.002)。結(jié)論 先天性心臟病與微重復(fù)/微缺失綜合征密切相關(guān)。與常規(guī)染色體核型分析技術(shù)相比，染色體微陣列分析技術(shù)提高了先天性心臟病胎兒染色體畸變的檢出率，有助于臨床風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估及遺傳咨詢。

染色體微陣列分析技術(shù)；先天性心臟病；產(chǎn)前診斷；染色體拷貝數(shù)變異

Objective To investigate the value of chromosomal microarray analysis(CMA) in the fetuses with congenital heart disease(CHD) detected by ultrasound. Method 154 fetuses with abnormal ultrasound imaging’s were enrolled in this study, invasive prenatal diagnosis surgeries were performed at Guangdong Women and Children Hospital .All cases were screened for copy number variations (CNVs) and chromosome karyotype analysis was performed in 111 of the 154 prenatal samples. All samples were divided into three groups, Group Ⅰ:samples with isolated cardiac structural abnormalities; Group Ⅱ：cases with multiple cardiovascular abnormalities ; Group Ⅲ：cases of cardiovascular abnormalities complicated with other systemic abnormalities.Results Among the 154 pregnancies with CHD ,CMA revealed a CNVs abnormality in 37(24.03%), among the 111 fetal karytopes,21 (18.92%) were chromosomal abnormality (P=0.368).Three groups contained 50 ,57 ,47 cases respectively. The abnormal CNVs detection rate among the 3 groups were 2%(1/50)、31.58%(18/57)、38.30%(18/47), respectively(P<0.001),while the chromosomal abnormalities were 2.41%(4/39)、15.79%(6/38)、32.35%(11/34), respectively(P=0.046). Conclusions Conclusions CHD is closely associated with abnormal CNVs and chromosomal abnormalities. Compared with the conventional karyotyping techniques, CMA improves the detection rate of chromosomal aberration in CHD, and is helpful for assess the risk and conduct the genetic counseling.【Key words】 chromosomal microarray analysis；congenital heart disease；prenatal diagnosis；copy number variations

先天性心臟病(congenital heart disease，CHD)是最常見的出生缺陷之一，也是導(dǎo)致嬰兒發(fā)病和死亡的首要病因[1, 2]，在活產(chǎn)兒中的發(fā)病率為8‰～9‰[3]。研究表明，CHD主要受遺傳因素和環(huán)境因素的相互作用[4-6]，其中遺傳因素包括非整倍體染色體、染色體重排、染色體微缺失/微重復(fù)[7, 8]。約20%～30%的CHD患兒同時(shí)合并其他系統(tǒng)畸形[4]，而這些畸形通常與染色體數(shù)目異常、結(jié)構(gòu)異常及單基因病相關(guān)[9]。常用的檢測(cè)方法如染色體核型分析對(duì)致病性染色體異常的檢出率較低，且只能檢測(cè)5～10Mb以上的染色體片段重復(fù)和缺失，無法檢測(cè)低于5Mb的染色體畸變[10]。而最近發(fā)展起來的染色體微陣列分析技術(shù)是一種高分辨率分子遺傳學(xué)技術(shù)，能對(duì)整個(gè)基因組亞顯微水平的染色體畸變進(jìn)行檢測(cè)，分為微陣列比較基因組雜交技術(shù)(array-based comparative genome hybridization，Array CGH)和單核苷酸多態(tài)性微陣列技術(shù)(single nucleotide polymorphism array, SNP array)[11]。隨著分辨率的提高，CHD胎兒染色體異常的檢出比例上升至15%～20%[12]。2010年國際標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞基因組陣列協(xié)會(huì)(International Standard Cytogenomic Array，ISCA)發(fā)表臨床指南指出，在多種先天畸形、發(fā)育遲緩、智力低下以及自閉癥患者中，染色體微陣列分析為首選遺傳學(xué)診斷技術(shù)[13]。基于本實(shí)驗(yàn)室的Array-CGH技術(shù)平臺(tái)，回顧性分析154例產(chǎn)前超聲提示為CHD胎兒病例，分析Array-CGH技術(shù)在CHD胎兒中的遺傳學(xué)診斷價(jià)值?，F(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 資料來源 選擇2012年1月至2014年12月，在廣東省婦幼保健院產(chǎn)前診斷中心就診，因產(chǎn)前超聲診斷胎兒為CHD(伴或不伴其他系統(tǒng)異常)，行介入性手術(shù)，并行Array-CGH檢測(cè)的孕婦154例，其中111例病例同時(shí)行染色體核型分析。所有孕婦均簽署產(chǎn)前診斷知情同意書。

1.2 研究方法

1.2.1 分組 Ⅰ組，單一心臟結(jié)構(gòu)畸形組：胎兒只存在一種心血管異常，且產(chǎn)前Ⅲ級(jí)超聲未提示其他解剖結(jié)構(gòu)畸形；Ⅱ組，多發(fā)心血管系統(tǒng)異常組：胎兒存在多種畸形，但畸形只限于心血管系統(tǒng)；Ⅲ組，心內(nèi)合并心外畸形組：畸形除累及心血管系統(tǒng)外，還累及神經(jīng)系統(tǒng)、泌尿系統(tǒng)、消化系統(tǒng)等其他系統(tǒng)。

1.2.2 比較基因組雜交技術(shù)(Array-CGH) 胎兒DNA采用QIAamp DNA Blood Mini Kit提取，操作過程完全遵守試劑盒說明書。CMA檢測(cè)按照Aglient公司的標(biāo)準(zhǔn)操作流程進(jìn)行，分別進(jìn)行酶切、熒光標(biāo)記酶切DNA產(chǎn)物、純化、雜交、洗滌、掃描與分析，應(yīng)用Agilent Genomic WorkbenchLite Edition7.0.4.0軟件分析數(shù)據(jù)，并參照OMIM、UCSC、DECIPHER、ISCA、DGV數(shù)據(jù)庫資料。

1.2.3 G顯帶核型分析方法 采用細(xì)胞增殖同步化方法，在產(chǎn)前診斷樣本中加入含20%小牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基液，經(jīng)過培養(yǎng)、收獲、孵育、固定、制片、烤片、消化、染色、德國Metasystem全自動(dòng)掃描儀上掃描，按照《人類細(xì)胞遺傳學(xué)國際命名體制》描述核型。必要時(shí)行C顯帶、N顯帶分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，χ2檢驗(yàn)行組間、組內(nèi)分析，P<0.05時(shí)認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 基本信息 共收集154例產(chǎn)前超聲提示為CHD胎兒的資料，其中單一心臟結(jié)構(gòu)畸形組50例(32.47%)，多發(fā)心血管系統(tǒng)異常組57例(37.01%)，心內(nèi)合并心外畸形組47例(30.52%)。孕婦平均孕齡為23+5周(孕11～36周)。心血管系統(tǒng)畸形作為胎兒最常見的畸形之一，室間隔缺損、房室間隔缺損、主動(dòng)脈發(fā)育不良、法洛四聯(lián)癥、心包積液、右位心是最常見的心血管超聲畸形。最常見的心血管系統(tǒng)外畸形分別是中樞神經(jīng)系統(tǒng)和泌尿系統(tǒng)。2.2 Array-CGH檢測(cè)情況 154例行Array-CGH檢測(cè)的胎兒中，37例(24.03%)結(jié)果異常，其中4例為不明確致病性拷貝數(shù)變異(variants of unknown significance, VOUS)，32例為致病性拷貝數(shù)變異，致病基因片段大小0.5～129Mb不等，結(jié)果見表1。4例VOUS病例包括1例3q29區(qū)域發(fā)生1.5Mb重復(fù)，1例16p13.11p12.3區(qū)域2.6Mb重復(fù)，1例2q31.1區(qū)域3.0Mb缺失，1例17p12區(qū)1.3Mb缺失，均已建議夫婦雙方行Array-CGH檢測(cè)，以輔助判斷異常片段來源及評(píng)估胎兒預(yù)后。致病性CNVs中還包括5例21-三體綜合征，4例18-三體綜合征，5例13-三體綜合征，1例45,X，1例47,XXX。

表1 致病性CNVs及VOUS胎兒的染色體微陣列檢測(cè)結(jié)果

注：該表格異常結(jié)果不包括染色體非整倍體

單一心臟結(jié)構(gòu)畸形組、多發(fā)心血管系統(tǒng)異常組、心內(nèi)合并心外畸形組結(jié)果異常率分別為2%(1/50)、31.58%(18/57)、38.30%(18/47)，三組異常檢出率有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)，其中多發(fā)心血管系統(tǒng)異常組檢出率明顯高于單一心臟結(jié)構(gòu)畸形組(P<0.001)，心內(nèi)合并心外畸形組檢出率高于單一心臟結(jié)構(gòu)畸形組(P<0.001)，多發(fā)心血管系統(tǒng)異常組與心內(nèi)合并心外畸形組檢出率差別無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，結(jié)果見表2。

在單一心臟結(jié)構(gòu)畸形組中，1例室間隔缺損胎兒(5.88%，1/17)合并CNVs異常，Array-CGH結(jié)果為arr 2q32.2q37.3 (189547392- 242656032)×3；arr 6q27 (165363814-170732033)×1 ，即在2號(hào)染色體長(zhǎng)臂2q32.2-q37.3位置發(fā)生53.1Mb的片段重復(fù)，在6號(hào)染色體長(zhǎng)臂q27位置發(fā)生5.4Mb的缺失。其余孤立性心血管異常病例較少，未發(fā)現(xiàn)陽性病例。

多發(fā)心血管系統(tǒng)異常組中，異常結(jié)果檢出率為31.58%(18/57)，其中室間隔缺損、三尖瓣反流、房室間隔缺損、主動(dòng)脈發(fā)育不良、永存左上腔靜脈的陽性率分別為13.64%(3/22)、50%(3/6)、40%(2/5)、16.67%(2/12)、50%(5/10)。

心內(nèi)合并心外畸形組的檢出率最高，為38.30%(18/47)，包括2例膈疝，2例唇腭裂，1例腹腔積液，1例骨骼系統(tǒng)異常，4例復(fù)雜畸形，3例神經(jīng)系統(tǒng)畸形，4例泌尿系統(tǒng)異常，1例消化系統(tǒng)異常。

表2 不同CHD表型胎兒致病性CNVs檢出率

2.3 G顯帶核型分析結(jié)果 154例CHD胎兒中有111例(72.08%)同時(shí)接受了G顯帶核型分析，其中98例(88.29%)為正常核型，13例(11.71%)核型異常，包括2例21-三體綜合征，3例18-三體綜合征，3例13-三體綜合征，3例缺失，1例重復(fù)，1例不平衡易位。本研究共發(fā)現(xiàn)5例多態(tài)性，包括2例46,XY,1qh+、1例46,X,inv(Y)、2例46,XX,inv(9)(p11q12)，已建議夫婦雙方行外周血染色體核型分析以判斷胎兒多態(tài)性的來源和評(píng)估預(yù)后。單一心臟結(jié)構(gòu)畸形組、多發(fā)心血管系統(tǒng)異常組、心內(nèi)合并心外畸形組結(jié)果異常率分別為0(0/39)、10.53%(4/38)、26.47%(9/34)，3組差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.002)，心內(nèi)合并心外畸形組明顯高于單一心臟結(jié)構(gòu)畸形組(P=0.03)，其余各組兩兩比較差別無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 討論

非整倍體引起遺傳物質(zhì)改變，擾亂基因之間的平衡，從而導(dǎo)致胎兒發(fā)育異常，常見的非整倍體包括Down、Edwards、Patau和Turner綜合征[14]。Hartman等[15]在4430個(gè)CHD胎兒中研究中發(fā)現(xiàn)非整倍體的檢出率為12.3%(547/4430)，最常見的染色體異常分別是21-三體綜合征(52.8%)、18-三體綜合征(12.8%)、13-三體綜合征(5.7%)、22q11.2微缺失綜合征 (12.2%)。Bao等[1]回顧性分析了537例產(chǎn)前心臟超聲異常胎兒，非整倍體的檢出率為16.8%。本研究發(fā)現(xiàn)2例21-三體綜合征，3例18-三體綜合征，3例13-三體綜合征，非整倍體檢出率8%，明顯低于其他學(xué)者研究。由于各研究分組方式及數(shù)目不同，在Array-CGH開展初期未規(guī)范檢查方法，因此非整倍體檢出率較其他文獻(xiàn)低。

除常見的綜合征型，CHD還與各種微缺失/微重復(fù)綜合癥相關(guān)。在1例胎兒宮內(nèi)生長(zhǎng)受限、四腔心不對(duì)稱、右心增大、主動(dòng)脈發(fā)育不良的胎兒中，Array-CGH診斷為Prader-Willi /Angelman 綜合征，另一例法洛四聯(lián)癥合并融合腎的病例提示14q32.3 缺失綜合征。Array-CGH結(jié)果表明致病性CNVs檢測(cè)率為24.03%(37/154)，染色體核型分析異常檢出率為11.71%，兩者差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.029)。Mademont等[16]報(bào)告了1例G顯帶漏診14.9Mb缺失，而被Array-CGH檢測(cè)到的病例。本研究中Array-CGH檢出到所有10Mb以上的致病性重復(fù)/缺失，并額外檢出8例<5Mb的CNVs，這說明Array-CGH能準(zhǔn)確、可靠地檢測(cè)產(chǎn)前CHD胎兒。

研究表明3%～14%的孤立CHD可合并致病或可疑拷貝數(shù)變異[17-19]。Geng J等[20]回顧性分析了514例行CMA檢測(cè)的CHD病例，通過對(duì)比孤立性CHD和綜合征性CHD病例的檢出率，發(fā)現(xiàn)4.3%～9.3%孤立的CHD病例存在致病的或可能致病的CNVs。當(dāng)不包括非整倍體時(shí)，其檢出率高于綜合征性CHD。還有研究者對(duì)正常核型合并22q11微缺失的孤立CHD新生兒行CMA分析時(shí)發(fā)現(xiàn)，檢出率在0～4%[20-24]，本研究孤立性CHD病例的檢出率為2%，與其他學(xué)者檢出率相近。但由于目前各CHD分組數(shù)據(jù)量較小，發(fā)生率有待大樣本人群數(shù)據(jù)研究。

盡管孤立性CHD的致病性CNVs檢出率低，但當(dāng)合并心臟外畸形時(shí)致病性CNVs檢出率明顯提高。對(duì)合并心外畸形、神經(jīng)發(fā)育延遲的CHD新生兒研究中發(fā)現(xiàn)，Array-CGH檢出率17%～53%[25-28]。但也有研究表明合并心外畸形的CHD胎兒中染色體異常的發(fā)生率為7.9%～12%[10, 29]。本研究中合并其他系統(tǒng)異常組的異常結(jié)果檢測(cè)率為38.30%，與CHD新生兒的分析數(shù)據(jù)類似。Jansen等[10]通過meta分析發(fā)現(xiàn)，多系統(tǒng)畸形的CHD胎兒中室間隔缺損、圓錐動(dòng)脈干畸形和左心室流出道畸形常見導(dǎo)致致病性CNVs。Shaffer等[29]發(fā)現(xiàn)左心發(fā)育不良、法絡(luò)四聯(lián)癥的異常結(jié)果最常見。本研究中室間隔缺損、心包積液和法絡(luò)四聯(lián)癥是常見的致病性結(jié)果來源。因此，當(dāng)產(chǎn)前發(fā)現(xiàn)室間隔缺損、心包積液、法絡(luò)四聯(lián)癥合并其他系統(tǒng)異常時(shí)，應(yīng)當(dāng)建議病人遺傳咨詢門診就診。

現(xiàn)有證據(jù)表明，在攜帶特定基因突變或染色體異常的家庭，基因表達(dá)差異和不完全外顯使CHD表型更加復(fù)雜。在4例Array-CGH結(jié)果提示4號(hào)染色體拷貝數(shù)變異的病例中，發(fā)現(xiàn)兩個(gè)與肥厚性心臟病變相關(guān)的基因ADRA2C和SLC25A4，但受累胎兒超聲心動(dòng)圖未提示心室增厚，且各自表型不同，最嚴(yán)重的一例除單心房、單心室畸形外，還合并全前腦、腦積水、視隔發(fā)育不良、唇腭裂、腎發(fā)育不良、羊水過少。因此，臨床中應(yīng)警惕同一基因變異可能導(dǎo)致不同CHD表型。

隨著分辨率的提高，Array-CGH也帶來一些問題，如VOUS增加了產(chǎn)前遺傳咨詢的難度，同時(shí)也增加父母的焦慮，但夫婦雙方Array-CGH結(jié)果可輔助VOUS結(jié)果咨詢。Janssen等[10]的研究顯示，父母雙方進(jìn)行Array-CGH可降低VOUS的發(fā)生率。本研究共檢出5例VOUS，但因夫婦雙方拒絕行Array-CGH檢測(cè)，無法進(jìn)一步指導(dǎo)臨床咨詢。

相比常規(guī)的染色體核型分析，Array-CGH對(duì)于產(chǎn)前超聲提示CHD胎兒的拷貝數(shù)變異檢出率增加至24.03%，進(jìn)一步說明CHD與染色體微重復(fù)/微缺失相關(guān)。隨著導(dǎo)致CHD的遺傳因素越來越多，遺傳基因檢測(cè)、遺傳風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估和產(chǎn)前遺傳咨詢將在CHD患兒的管理中日益重要。Array-CGH技術(shù)大大提高了CHD胎兒亞顯微水平染色體畸變的檢出率，并能提供更多的基因信息。因此可作為產(chǎn)前診斷的工具，為CHD胎兒診治及孕期管理提供客觀科學(xué)的依據(jù)。

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編輯：劉鄧潔

10.13470/j.cnki.cjpd.2016.04.011

R714.55

A

2016-11-20)

DOI: 10.13470/j.cnki.cjpd.2016.04.012

*通訊作者：尹愛華，E-mail：yinaiwa@126.vip.com