半巢式RT-Realtime PCR方法檢測藜草花葉病毒

賀麗娜 李金慶 厲艷

摘要 [目的]根據(jù)藜草花葉病毒（SoMV）全基因組中多聚蛋白質(zhì)基因序列保守區(qū)，分別設(shè)計2套TaqMAN探針和引物，建立半巢式實時熒光PCR檢測SoMV的新方法。[方法]提取病毒核酸進行反轉(zhuǎn)錄操作合成cDNA，依據(jù)設(shè)計好的2套TaqMAN探針和引物，分別進行實時熒光PCR特異性與靈敏度檢測，并進行2套引物探針的擴增效率對比試驗。[結(jié)果]方法特異性強，靈敏度高達0.4 fg/μL植物總RNA，2套引物探針的擴增效率試驗對比結(jié)果顯示擴增效率幾乎完全一樣。[結(jié)論]該方法適用于藜草花葉病毒的檢疫鑒定。

關(guān)鍵詞藜草花葉病毒;半巢式實時熒光PCR;檢測

中圖分類號S412文獻標識碼A

文章編號0517-6611（2019）02-0194-03

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2019.02.060

藜草花葉病毒（Sowbane mosaic virus，SoMV），屬于南方菜豆花葉病毒屬（Sobemovirus）成員。該病毒分布在世界近30個國家和地區(qū)，主要分布于歐洲及南北美洲國家及南非、日本、土耳其等國家或地區(qū)[1-3]，可通過汁液、昆蟲及種子傳播，具有種傳率極高、抗逆性強和極易傳播蔓延的特點[4]。目前該病毒在中國無報道，被我國列為禁止進境的檢疫性有害生物。藜草花葉病毒可侵染藜科雜草、葡萄、蘋果、櫻桃、香石竹、菊花等5個屬的24種植物[4-5]，這些寄主植物在我國都有大面積的種植，我國的氣候條件也與世界上該病毒的許多疫區(qū)的氣候條件相似，因此該病毒一旦傳入我國，可導致嚴重危害。

為了保障我國蘋果、葡萄等相關(guān)產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展，開發(fā)先進的檢測技術(shù)，防止藜草花葉病毒傳入我國具有重要意義。目前，國內(nèi)外已建立了SoMV的RT-PCR檢測方法[6-7]、IC-RT- PCR檢測方法免疫捕獲抗原[8]、Real-time PCR檢測方法[1]、反轉(zhuǎn)錄環(huán)介導等溫擴增方法[9]，但尚未見采用半巢式-Real time PCR檢測SoMV的研究報道。筆者建立了具有更快速、簡便、準確、靈敏等特點的半巢式-Real time PCR檢測SoMV的方法，旨在進一步豐富藜草花葉病毒的檢疫鑒定技術(shù)。

1材料與方法

1.1供試材料

藜草花葉病毒（SoMV）、番茄黑環(huán)病毒（TBRV）、草莓潛環(huán)斑病毒（SLRSV）、番茄叢矮病毒（TBSV）和桃叢簇花葉病毒（PRMV）由中國檢驗檢疫科學研究院植物檢疫研究所提供。

1.2儀器設(shè)備

實時熒光PCR儀ABI 7000（美國，應(yīng)用生物公司）;PCR擴增儀PTC-200（美國，MJ公司）;純水儀Milli-Q（美國，Millipore）;高壓滅菌鍋MLS 3020（日本，SANYO）;高速冷凍離心機5417R（德國，Eppendorf）;渦旋振蕩器MS1? minishaker（美國，IKA）;金屬浴ALB 128（美國，Thermo）;多用電泳系統(tǒng)PROTEAN II（美國，BIO-RAD）;凝膠成像系統(tǒng)Universal HoodⅡ（美國，BIO-RAD）;核酸蛋白分析儀Bio Photometer（德國，eppendorf）。

1.3試劑

植物總RNA提取試劑盒（DP432）購自天根生化科技（北京）有限公司;反轉(zhuǎn)錄試劑盒（貨號：RR037A）購自TaKaRa公司;實時熒光PCR試劑盒Platinum購自Invitrogen公司等。

1.4TaqMAN探針與引物的設(shè)計與合成

根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫中藜草花葉病毒全基因組中多聚蛋白質(zhì)基因序列保守區(qū)，分別設(shè)計2套TaqMAN探針和引物，探針5′端發(fā)光基團為FAM，3′端淬滅基團為TAMRA，引物和探針由上海生工合成。

該研究共設(shè)計了3條引物和1條探針，其中引物包括1條上游引物和2條下游引物，上游引物SoMVF：5′-CCGATGGAACACTTATTCAACAGT-3′。下游引物用SoMVR表示，其中SoMVR1：5′- TGGAGTTGGTGGAGGAAGTACA-3′;SoMVR2：5′-GCCATAAGGCAGCGGACTC-3′。探針SoMVP：5′-FAM-TCGCCGGGTGTTATGAAGTCAGGATC-TAMARA-3′;PCR產(chǎn)物長度SoMVF/SoMVR1為78 bp，SoMVF/SoMVR2為97 bp。3條引物及探針組成2套不同的反應(yīng)組合，套1為SoMVF/SoMVR1/SoMVP，套2為SoMVF/SoMVR2/SoMVP。

1.5病毒核酸提取與質(zhì)量控制采用試劑盒提取病毒葉片及健康葉片（CK）中總RNA，操作步驟詳見試劑盒DP432說明書。提取的核酸用核酸蛋白分析儀測定濃度與純度值，確保核酸質(zhì)量。

1.6cDNA合成

病毒總RNA及水對照CK采用反轉(zhuǎn)錄試劑盒在PTC-200 普通PCR擴增儀上分別進行反轉(zhuǎn)錄過程合成cDNA。反應(yīng)體系：5×Primer Script Buffer 2.0 μL，oligo dT Primer（50 μmol/L） 0.5 μL，Primer ScriptRT Enzyme Mix I 0.5 μL，Random 6 mers（100 μmol/L）0.5 μL，總RNA 2.0 μL，加DEPC水至10.0 μL。反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件：37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s。

1.7實時熒光PCR檢測

1.7.1特異性檢測。

以上述不同病毒的cDNA及2種陰性對照為模板，在實時熒光PCR儀96孔板中進行半巢式實時熒光PCR特異性檢測。反應(yīng)體系：2×PCR buffer 12.5 μL，上游引物（15 μmol/L）1.0 μL，下游引物（15 μmol/L）1.0 μL，探針（10 μmol/L）1.0 μL，ROX 0.5 μL， cDNA 2.0 μL，加ddH2O至25.0 μL。反應(yīng)條件：50 ℃ 2 min;95 ℃ 2 min;95 ℃ 15 s，60 ℃ 30 s，45 cycles。

1.7.2靈敏度檢測。

將提取的藜草花葉病毒總RNA，用ddH2O從10-1稀釋到10-10及ddH2O共11個梯度，分別按照“1.6”中的反應(yīng)體系和反應(yīng)條件進行cDNA合成，然后進行半巢式實時熒光PCR靈敏度檢測，反應(yīng)體系和反應(yīng)條件同“1.7.1”。

1.7.3擴增效率對比試驗。

采用藜草花葉病毒同一cDNA為模板，分別用2套引物-探針進行半巢式實時熒光PCR檢測，以比較這2套引物探針的擴增效率。實時熒光PCR操作同“1.7.1”。

2結(jié)果與分析

2.1特異性檢測結(jié)果

套1（SoMVF/SoMVR1/SoMVP）和套2（SoMVF/SoMVR2/SoMVP）結(jié)果分別見圖1、2。結(jié)果顯示，2套引物探針分別只有在SoMV的cDNA為模板的反應(yīng)中出現(xiàn)擴增曲線，其他4種病毒和2種陰性對照cDNA均未出現(xiàn)擴增信號，說明2套引物探針的特異性很好，符合預期。

2.2靈敏度檢測結(jié)果

該試驗中所提取RNA濃度與純度值為39.8（約為40）ng/μL，核算蛋白分析儀測定結(jié)果為OD260/280=2.16，OD260/230=2.33。稀釋后各個梯度所對應(yīng)的RNA濃度從4 ng/μL～0.004 fg/μL及ddH2O。反轉(zhuǎn)錄分別合成cDNA后，進行半巢式實時熒光PCR擴增。套1、套2結(jié)果分別見圖3、圖4。熒光PCR擴增的結(jié)果表明，當RNA稀釋至10-9（即0.04 fg/μL）時，檢測不到信號，因此該方法檢測的靈敏度可達10-8，即0.4 fg/μL植物總RNA。

2.3擴增效率對比試驗結(jié)果

套1組合（SoMVF/SoMV R1/SoMV P）和套2組合（SoMVF/SoMVR2/SoMV P）引物探針的擴增效率結(jié)果對比見圖5。由圖5可見，2套引物探針的擴增效率幾乎等同。

3結(jié)論與討論

近年來，隨著國際貿(mào)易的發(fā)展，進口植物種苗批次和貨值急劇增加，進口植物種苗口岸呈現(xiàn)集中化與專一化特點，各個種苗口岸截獲了大量的植物疫情，特別是檢疫性的植物病毒。進境種苗中植物病毒的檢測一直是我國檢驗檢疫系統(tǒng)的重點難點，絕大多數(shù)的口岸局都沒有掌握植物病毒室內(nèi)的檢測技術(shù)，很多都還停留在初步判斷階段[10]，如果要鑒定到種，往往需要送到鑒定能力強的省局實驗室進行鑒定，費時費力。特別是其中木本植物中病毒的檢測，由于它們在植株體內(nèi)含量低、分布不均，且時有復合侵染等特殊性，傳統(tǒng)的方法，極易出現(xiàn)漏檢和誤檢[11]，藜草花葉病毒就是其中之一。SoMV侵染癥狀常常表現(xiàn)較輕或無癥狀，且在一些寄主

上， 病毒含量很低，導致生物學檢測或血清學檢測較為困難[1]。

使用不同的方法，其檢測靈敏度差異較大[11]。為了確認結(jié)果的正確性，經(jīng)常需要對一個結(jié)果進行另一種方法的確認試驗，例如通過RT-PCR方法檢出一種病毒，往往需要通過ELISA方法進行確認，但是ELISA方法檢測靈敏度較低，有可能導致漏檢，這就為結(jié)果的判斷增加了難度，尤其是在檢測目標含量極少的情況下，極易造成結(jié)果判斷錯誤。但如果方法之間檢測靈敏度相近的話，漏檢問題就迎刃而解，很少造成漏檢情況。

基于上述原因，筆者建立了半巢式RT-Realtime PCR檢測藜草花葉病毒的方法。該方法充分利用了實時熒光PCR方法所固有的特異性強、可重復性好、定量分析較準確、PCR污染少、自動化程度高等特點[12]，同時巧妙地將巢式PCR的原理，運用到實時熒光PCR技術(shù)中[11，13]。設(shè)計上僅僅在一般實時熒光PCR的基礎(chǔ)上增設(shè)了一條引物，就形成了2套完全獨立的檢測體系，2套引物探針相互印證，可以減少假陽性的出現(xiàn)，又進一步提高了準確性。這2套引物探針的擴增效率極高且近乎等同，這樣就避免了藜草花葉病毒漏檢情況的出現(xiàn)。與單一的巢式PCR或Realtime PCR等方法相比，其檢測的準確性、靈敏度更高，同時也解決了由于靈敏度不同導致結(jié)果漏檢的問題。該試驗結(jié)果表明，方法檢測的靈敏度可達0.4 fg/μL植物總RNA。

安徽農(nóng)業(yè)科學2019年

參考文獻

[1] 辛言言，張永江，馬潔，等.實時熒光RT-PCR方法檢測藜草花葉病毒[C]//郭澤建，吳元華.中國植物病理學會2014年學術(shù)年會論文集.北京：中國農(nóng)業(yè)科學技術(shù)出版社，2014.

[2] CORNELIA B O.Sowbane mosaic virus[EB/OL].（2005-04-05）[2012-03-15].http：//ictvdb.biomirror.cn/ICTVdB/00.067.0.01.008.htm.

[3] GRATSIA M E，KYRIAKOPOULOU P，VOLOUDAKIS A.First report of Olive mild mosaic virus and Sowbane mosaic virus in Spinach in Greece[J] Plant disease，2012，96（8）：1230.

[4] 沈淑琳.介紹一種極易從國外傳入的種傳病毒——藜草花葉病毒[J].植物檢疫，1990，4（4）：246-247.

[5] 馮黎霞，趙立榮，武目濤，等.藜草花葉病毒的研究概述[J].中國蔬菜，2016（8）：17-21.

[6] 陳青，李桂芬，董菁，等.藜草花葉病毒外殼蛋白基因的克隆與RT-PCR檢測[J].植物病理學報，2010，40（4）：438-441.

[7] 董菁，陳青，陳紅運，等.應(yīng)用簡并引物檢測南方菜豆花葉病毒屬病毒[J].植物保護學報，2010，37（4）：377-378.

[8] 馮黎霞，何瑞芳，鐘國強，等.進境菠菜種子中藜草花葉病毒的免疫捕獲RT-PCR檢測[J].植物檢疫，2013，27（1）：33-35.

[9] 楊姍萍，廖富榮，艾洪木.反轉(zhuǎn)錄環(huán)介導等溫擴增技術(shù)檢測藜草花葉病毒[J].植物保護學報，2018，45（2）：391-392.

[10] 張京宣，曹秀芬，宋濤，等.植物病毒檢測技術(shù)研究進展分析[J].北京農(nóng)業(yè)，2011（30）：79-80.

[11] 粟智平，張靜，黃迎波，等.半巢式-RT-RealtimePCR檢測李痘病毒[J].植物檢疫，2012，26（3）：26-29.

[12] 周曉麗，朱國坡，李雪華，等.實時熒光定量PCR技術(shù)原理與應(yīng)用[J].中國畜牧獸醫(yī)，2010，37（2）：87-89.

[13] 粟智平，楊益娥，趙偉鐸，等.半巢式RT-Realtime PCR檢測番茄叢矮病毒[J].現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技，2015（18）：148-150.