環(huán)狀RNA 在DNA 損傷修復中作用的研究進展

李俊實 楊彥勇 李百龍

海軍軍醫(yī)大學海軍醫(yī)學系艦船輻射醫(yī)學防護教研室, 上海 200433

DNA 作為細胞遺傳信息的載體，暴露于電離輻射或有毒化學物質(zhì)中可造成嚴重的結(jié)構(gòu)和功能損傷[1]。盡管細胞具有多種修復DNA 損傷的途徑，但DNA 損傷（尤其是DNA 雙鏈斷裂）通常難以得到完全、有效的修復，從而導致一系列不良反應(yīng)，包括細胞代謝紊亂、增殖失控、凋亡受阻、癌變以及治療耐受等。環(huán)狀RNA（circular RNA，CircRNA）是一類經(jīng)反向剪接形成的環(huán)狀非編碼RNA，具有序列保守、不易降解和細胞組織特異性等特點。隨著CircRNA 分子生物學效應(yīng)研究的進一步深入，CircRNA 自身穩(wěn)定的化學性質(zhì)使其在細胞內(nèi)無需較高豐度就能發(fā)揮與其他非編碼RNA 同等水平的調(diào)控效應(yīng)，故其在細胞周期調(diào)控、DNA 損傷修復等重要領(lǐng)域的作用逐漸引起研究者的關(guān)注。

1 CircRNA 概述

自1976 年人類首次觀察到CircRNA 以來[2]，研究者陸續(xù)發(fā)現(xiàn)CircRNA 在不同種類的細胞中均大量存在。大部分CircRNA 由已知的蛋白編碼基因產(chǎn)生，且廣泛存在于細胞質(zhì)中[3]。CircRNA 包括外顯子CircRNA、內(nèi)含子CircRNA、外顯子-內(nèi)含子CircRNA 和基因間CircRNA[4]。CircRNA 為共價閉環(huán)結(jié)構(gòu)，既沒有成熟mRNA 特有的5′端7-甲基鳥苷三磷酸（m7GTP）帽和3′-端多聚腺苷酸（polyA）尾結(jié)構(gòu)，也不包含自由的3′5′-OH 末端，由此可見，CircRNA 是通過初級轉(zhuǎn)錄本中的下游外顯子以反向順序剪接到上游外顯子（又名反向剪接）這一非傳統(tǒng)方式合成的。有研究結(jié)果表明，當mRNA 前體因多個剪接因子缺乏導致CircRNA 的合成加工進程放緩時，在其反向剪接的途徑中，通過上下游的Alu 重復序列、RNA 結(jié)合蛋白FUS（肉瘤融合蛋白）和QKI（Quaking 蛋白）等形成同源二聚體，拉近線性前體轉(zhuǎn)錄本上的供體和受體位點，繼而為后續(xù)的反向剪接創(chuàng)造條件。此外，當外顯子跳躍并形成套索樣結(jié)構(gòu)時，含有外顯子的套索結(jié)構(gòu)可以通過反向剪接形成外顯子CircRNA，而由內(nèi)含子構(gòu)成的套索結(jié)構(gòu)最后形成內(nèi)含子CircRNA[5]。

相較于外顯子CircRNA，外顯子-內(nèi)含子CircRNA和內(nèi)含子CircRNA 均位于細胞核內(nèi)，并能通過與U1 小核糖核蛋白（snRNP）相互作用或正向調(diào)控RNA聚合酶Ⅱ（Pol Ⅱ）來促進自身親本基因的轉(zhuǎn)錄，前者的典型代表有circEIF3J（真核翻譯起始因子3J 亞基）和circPAIP2（聚腺苷酸結(jié)合蛋白相互作用蛋白2）[5]，后者的代表則包括ci-ankrd52（錨蛋白重復結(jié)構(gòu)域52）和ci-sirt7（NAD 依賴性脫乙酰酶7）[6]。隨著研究的深入，研究者在細胞外囊泡中也發(fā)現(xiàn)了以小腦變性相關(guān)蛋白1 反義RNA（cerebellar degenerationrelated protein 1 antisense RNA，CDR1-AS）、circ-HIPK3（同源結(jié)構(gòu)域相互作用蛋白激酶3）為代表的一系列CircRNA 分子的富集，推測這可能與細胞間的信息交流有關(guān)，即CircRNA 可能通過囊泡出胞的方式作用于靶細胞，發(fā)揮特定的調(diào)控作用[7]。與線性RNA 不同，CircRNA 更穩(wěn)定，這是因為相較于線性RNA，其末端未暴露，不易被核酸外切酶或核糖核酸酶R 降解[5]。有研究結(jié)果表明，N6-甲基腺苷修飾的CircRNA可經(jīng)由YTH N6-甲基腺苷RNA結(jié)合蛋白（YTHDF2）和熱反應(yīng)蛋白12（HRSP12）依賴途徑降解，其自身可能存在的特異性降解和修飾位點也引起了研究者的關(guān)注。除上述優(yōu)勢外，研究者還發(fā)現(xiàn)，在多種耐藥腫瘤細胞系中，CircRNA的異常表達還與腫瘤細胞對化療藥物的敏感性有關(guān)[8-9]。這些研究結(jié)果均表明，在由DNA 損傷修復失調(diào)所導致的細胞癌變中，CircRNA 可能作為一個潛在的關(guān)鍵分子參與介導細胞周期和信號轉(zhuǎn)導通路的異常激活。

2 CircRNA 在DNA 損傷修復中的作用

如今，越來越多的研究結(jié)果表明，在肺癌、乳腺癌、卵巢癌、肝癌和骨肉瘤等多種惡性腫瘤中，CircRNA 的異常變化與腫瘤細胞對放化療的耐受性密切相關(guān)?，F(xiàn)階段，絕大多數(shù)研究者都著眼于CircRNA 分子經(jīng)由微小RNA 這一媒介，在多個信號轉(zhuǎn)導通路中靶向調(diào)控特定分子，并通過增強DNA 損傷修復、減少胞內(nèi)藥物聚集、目的基因擴增和構(gòu)筑腫瘤微環(huán)境等方式影響腫瘤的治療效果和預(yù)后。然而，隨著CircRNA 研究的拓展，新的修復機制得以闡述并逐漸成為學術(shù)界關(guān)注的焦點。我們將分別對CircRNA 參與調(diào)控的信號轉(zhuǎn)導通路和靶點進行介紹。

2.1 CircRNA 與微小RNA 的相互作用

2.1.1 表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）/磷酸肌醇-3-激酶（phosphoinositide-3-kinase，PI3K）信號轉(zhuǎn)導通路

EGFR/PI3K 通路與腫瘤預(yù)后不良密切相關(guān)[10-11]。有研究結(jié)果顯示，在肺腺癌中，CDR1-AS 的高表達與EGFR/ PI3K 通路中的EGFR、磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸3-激酶催化亞基α（PIK3CA）的表達水平上調(diào)呈正相關(guān)。進而促進腫瘤細胞對培美曲塞（PTX）和順鉑（CDDP）等化療藥物產(chǎn)生耐藥性[12]。在食管癌中，CircVRK1 的含量與患者的預(yù)后呈正相關(guān)，其可能是通過充當微小RNA 海綿，吸附miR-624-3p降低了人第10 號染色體缺失的磷酸酶及張力蛋白同源基因（PTEN）/ PI3K 介導的蛋白激酶B（protein kinase B，AKT）的活性，并抑制食管癌的上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition，EMT），進而達到食管癌放療增敏的效果[13]。此外，另一個CircRNA 分子circAKT3，在細胞中也可以吸附胞質(zhì)中的miR-198，逆轉(zhuǎn)其對調(diào)節(jié)亞基蛋白p85α表達的抑制作用，并誘導PI3K/AKT 信號分子的表達[8]。有趣的是，經(jīng)證實，PI3K 激酶介導的與底物相互作用的結(jié)構(gòu)域磷酸化可引起DExH 盒解旋酶9（DHX9）功能減退，并誘導下游CircRNA 分子circCCDC66 的表達，后者在結(jié)腸癌中與癌細胞對奧沙利鉑的耐受性密切相關(guān)[14]。EGFR/PI3K 通路是否還存在其他的作用機制還有待進一步證實[8]。

2.1.2 Wnt 信號轉(zhuǎn)導通路

Wnt 信號通路的激活增加了DNA 雙鏈斷裂修復的頻率，且該通路的激活依賴于Dvl2（dishevelled segment polarity protein 2）蛋白的磷酸化。既往研究結(jié)果顯示，itchy E3 泛素蛋白連接酶（ITCH）基因可以破壞Dvl2 蛋白的磷酸化，從而抑制Wnt 信號通路，促進腫瘤對化療產(chǎn)生耐受。由于CircITCH對miRNA 具有吸附作用，因此，蛋白質(zhì)編碼基因ITCH 表達水平的升高會通過阻礙Dvl2 的磷酸化來抑制Wnt 信號通路的激活[15]，從而使食管癌細胞對放療的敏感性降低。既往研究結(jié)果顯示，Wnt3可促進β-鏈蛋白的穩(wěn)定性，后者可調(diào)節(jié)腫瘤細胞對放療的敏感性[16]。EMT 是腫瘤獲得性放療耐受產(chǎn)生的關(guān)鍵機制之一[17]，CircRNA 分子circRNA_100367通過吸附miR-217，可逆轉(zhuǎn)后者對Wnt3 表達的抑制，進而使食管癌細胞對放療產(chǎn)生耐受，并且在放療耐受的癌細胞中E-鈣黏蛋白、snail 蛋白、波形蛋白等EMT 相關(guān)蛋白分子的表達水平均顯著升高（P＜0.01）[18]。此外，鑒于Wnt 信號通路與口腔鱗癌的發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切，故相關(guān)CircRNA 分子也可能與口腔鱗癌的EMT 密切相關(guān)，可能成為潛在的治療靶點。

2.1.3 核因子-κB (nuclear factor-κB，NF-κB）信號通路

NF-κB 信號通路同樣也是CircRNA 研究領(lǐng)域中的熱點通路。結(jié)果表明，包括circ-Sirt1（沉默信息調(diào)節(jié)因子1）在內(nèi)的多數(shù)CircRNA 可經(jīng)NF-κB 信號通路介導炎性血管平滑肌細胞表型轉(zhuǎn)換[19]。而在人造血干細胞中，抑制NF-κB 信號通路可能導致DNA 損傷修復基因表達下調(diào)，從而造成大范圍的DNA 修復錯誤，使造血干細胞對損傷因素敏感，對造血系統(tǒng)放化療后的恢復造成不良影響[20]。上述機制是否存在于腫瘤細胞（特別是腫瘤干細胞）仍有待進一步研究證實，不過該機制本身也是一個非常有意義的切入點。而細胞周期相關(guān)激酶2（NIMArelated kinase 2，NEK2）基因作為NF-κB 信號通路的一個新的激活靶點，在細胞中可激活A(yù)KT 蛋白激酶，并促進NF-κB 抑制蛋白α（IκBα）的磷酸化修飾和降解，且NEK2 還能通過調(diào)節(jié)NF-κB 抑制蛋白α 磷酸化，激活p65 蛋白入核，后者與乙酰肝素酶（Heparanase）啟動子結(jié)合，上調(diào)乙酰肝素酶的表達水平，繼而促進骨髓瘤的產(chǎn)生和發(fā)展[21]。Xia 等[9]的研究結(jié)果表明，circTNPO3（轉(zhuǎn)運蛋白3）通過吸附miR-1299，提高其下游NEK2 蛋白的表達水平，從而參與DNA 損傷修復的調(diào)控。綜上所述，CircRNA 既可能經(jīng)由NF-κB 信號通路中的典型分子介導DNA 損傷修復，也可能通過與全新靶點的相互作用共同參與DNA 損傷修復的調(diào)控。

2.2 外泌體CircRNA 調(diào)節(jié)DNA 損傷修復

外泌體因內(nèi)部包含種類豐富的蛋白、脂質(zhì)和核酸而被認為是細胞間信息傳遞的重要分子。近年來，隨著研究的不斷深入，有研究者提出外泌體可能以旁分泌或遠距離分泌的方式使攜帶的CircRNA分子被靶細胞吸收，從而改變靶細胞的治療敏感性[22]。有研究者發(fā)現(xiàn)，CircRNA 分子CiRS-122 在化療耐受的結(jié)直腸癌細胞中高表達，后者通過分泌外泌體的方式將CiRS-122 運送到其他細胞，并吸附胞內(nèi)的miR-122，上調(diào)M2 亞型丙酮酸激酶的水平，使靶細胞對奧沙利鉑產(chǎn)生耐藥性[23]。與CiRS-122 相反，在對順鉑耐受的卵巢癌患者的血清和組織的外泌體中，CiRS-7（與CDR1-AS 是同一分子）的含量反而降低，這可能是CiRS-7 低表達使侵襲抑制因子CiRS-7-miR-1270-SCAI 對侵襲因子的抑制作用減弱所致[24]。已有研究結(jié)果論證了泛素化和去泛素化修飾與電離輻射相關(guān)的DNA 損傷修復存在密切聯(lián)系[25]，其中涉及與DNA 損傷修復相關(guān)的研究比較少。在肝癌細胞中，外泌體CircRNA 分子circ-DB 可充當miR-34a 海綿，促進去泛素化蛋白泛素特異性肽酶7（USP7）的表達，并激活下游的泛素特異性肽酶7 /Cyclin A2 信號轉(zhuǎn)導通路，發(fā)揮減少DNA 損傷、促進腫瘤生長的作用[26]。綜上所述，現(xiàn)有研究結(jié)果表明，血清所包含的外泌體CircRNA 分子因具有豐度高和化學性質(zhì)穩(wěn)定的優(yōu)點，既可以作為一種篩查指標，也可以作為一種載體在靶向治療中運送分子藥物，具有非常廣闊的應(yīng)用前景。

2.3 CircRNA 經(jīng)p53 調(diào)控細胞周期

與DNA 損傷所致的上百種p53 相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄本異常相比，p53 誘導基因僅促進了少數(shù)CircRNA的上調(diào)。其中，環(huán)狀RNA-鼠雙微粒體2 （circ-murine double minute 2，circ-MDM2）因其線性宿主基因MDM2 在抑制p53 蛋白表達水平中的重要調(diào)控作用而成為研究者關(guān)注的熱點。Chaudhary 等[27]發(fā)現(xiàn)，使用小干擾RNA（siRNA）沉默circ-MDM2 會導致包括p53基礎(chǔ)水平上升、細胞增殖缺陷、G1期/S 期細胞周期阻滯、Rb 磷酸化水平降低等一系列現(xiàn)象，同時伴有數(shù)個p53 直接作用位點的高表達。但是相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄或翻譯水平幾乎沒有影響。研究者還發(fā)現(xiàn)，與單獨抑制circ-MDM2 相比，在靶細胞中使用siRNA 同時抑制circ-MDM2 和p53基因，反而使細胞的增殖缺陷得到了完全恢復，這表明circ-MDM2 的調(diào)控作用可能還需要p53 介導[27]。免疫組織化學實驗結(jié)果顯示，circ-MDM2 的缺失使腫瘤生長功能受損，與對照組相比，circ-MDM2缺失組中細胞增殖核抗原Ki67 陽性率降低約18%。然而，Lou 等[28]針對CircRNA 分子CDR1-AS 的研究結(jié)果表明，與主流微小RNA 海綿學說相反，在argonaute 2（AGO2）蛋白和Dicer（一種核糖核酸內(nèi)切酶）耗竭的人腦星形膠質(zhì)母細胞瘤U87 細胞中因微小RNA 成熟障礙，造成p53 及其靶基因p21 表達水平降低；但在上述細胞中伴隨著CDR1-AS表達水平上調(diào)，p53、p21 的表達水平及p53 的轉(zhuǎn)錄活性均得以恢復。Zhang 等[29]的實驗也得出了類似的結(jié)果，和CDR1-AS 一樣，circ-Amotl1（angiomotin like 1）并不是通過吸附微小RNA 來發(fā)揮自身的調(diào)控作用。既然argonaute 2 蛋白和Dicer 在微小RNA的合成和成熟過程中必不可少，那么CDR1-AS 對p53 的調(diào)控很顯然不經(jīng)由微小RNA 發(fā)揮作用。這提示除傳統(tǒng)的微小RNA 海綿的角色之外，CircRNA很可能還通過其他機制參與DNA 損傷修復過程[28]。

2.4 CircRNA 與DNA 損傷修復蛋白的相互作用

蛋白質(zhì)是分子調(diào)控機制中最重要的下游效應(yīng)分子。研究結(jié)果表明，非編碼RNA 可通過與蛋白質(zhì)結(jié)合的方式參與轉(zhuǎn)錄、翻譯等重要過程的調(diào)控[30]，作為非編碼RNA 中的一員，CircRNA 很可能也通過類似的方式發(fā)揮對DNA 損傷修復的調(diào)節(jié)作用。Xia 等[31]研究發(fā)現(xiàn)，源自AKT 基因序列的CircRNA Hsa_circ-0017250 分子所編碼的蛋白能夠使AKT失活，從而增強細胞對輻射的敏感性，這增加了CircRNA 與蛋白質(zhì)可能發(fā)生相互作用的途徑。在針對CircRNA 分子CDR1-AS 的研究中，Lou 等[28]發(fā)現(xiàn)CDR1-AS 可促進DNA 損傷誘導的細胞周期阻滯和凋亡，且CDR1-AS 相較于傳統(tǒng)的CircRNA還具有不同于miRNA 海綿的分子生物學效應(yīng)：雖然CDR1-AS 的過表達與p53 蛋白水平的升高呈劑量依賴性，但TP53 的mRNA 水平并沒有受CDR1-AS分子水平的明顯影響，進一步的實驗結(jié)果證明了CDR1-AS 可促進p53 蛋白在使用阿霉素處理的細胞中累積，而且與其在細胞核緊密共定位。不同于其他CircRNA 分子，CDR1-AS 可通過直接與p53 的核心DNA 結(jié)合域緊密結(jié)合來發(fā)揮調(diào)控作用。兩者的結(jié)合會破壞p53/MDM2 復合物的形成，進而通過限制p53 泛素化降解來促進蛋白的穩(wěn)定性[28]。同樣，Zhang 等[29]發(fā)現(xiàn)另一個CircRNA 分子circ-Amotl1可以直接結(jié)合AKT 和丙酮酸脫氫酶激酶（PDK），促進AKT 蛋白的激活以及AKT、pAKT、丙酮酸脫氫酶激酶（PDK）和pPDK 的核轉(zhuǎn)位。在該過程中，CircRNA 并未參與調(diào)控上述蛋白的表達，這也進一步說明CircRNA 可能直接結(jié)合靶蛋白的效應(yīng)分子。類似的相互作用還可能存在于其他新發(fā)現(xiàn)的CircRNA 分子和蛋白之間，還有待進一步研究發(fā)掘。

2.5 DNA 重組修復的調(diào)節(jié)

越來越多的研究結(jié)果表明，非編碼RNA 可不依賴轉(zhuǎn)錄本調(diào)控臨近基因的轉(zhuǎn)錄和表達[32]，因此，是否存在非編碼RNA 與基因直接相互作用的途徑也成了科學界關(guān)注的焦點。Xu 等[33]研究發(fā)現(xiàn)，在乳腺癌活檢標本細胞中，CircSMARCA5通過與其親本基因相互作用形成r 環(huán)，可起到抑制癌細胞SMARCA5 基因表達的作用。既往研究結(jié)果表明，SMARCA5 基因在調(diào)控DNA 修復和維持基因組穩(wěn)定性方面發(fā)揮重要作用[34]。在circSMARCA5 的作用下，親本基因僅能翻譯產(chǎn)生截斷的無功能蛋白，且免疫印跡實驗結(jié)果顯示，人乳腺癌MCF-7 細胞（表達circSMARCA5）的DNA 損傷標志物γ-H2AX（DNA 雙鏈斷裂標志物）表達水平明顯高于對照組。此外，與對照組相比，用順鉑處理MCF-7 細胞顯著提高了細胞內(nèi)DNA 損傷反應(yīng)蛋白細胞周期檢測點激酶1（Chk1）和細胞周期檢測點激酶2（Chk2）的水平。在后續(xù)的實驗中，研究者將ANT（一種野生型寡核苷酸，可結(jié)合circSMARCA5）或ANT-mut（ANT 突變體，無circSMARCA5 結(jié)合能力）轉(zhuǎn)染到表達circSMARCA5 的細胞中，經(jīng)單細胞凝膠電泳實驗和γ-H2AX 抗體檢測實驗發(fā)現(xiàn)，ANT 轉(zhuǎn)染的細胞的DNA 損傷修復能力明顯提高[33]，這進一步驗證了之前的假設(shè)，即CircRNA 通過結(jié)合親本基因的啟動子序列，抑制目的基因的蛋白質(zhì)合成，進而調(diào)控DNA 損傷修復過程。CircRNA 可能會成為繼順式作用元件和反式作用因子之后的又一大類調(diào)控目的基因轉(zhuǎn)錄的作用分子，如果該假設(shè)成立，CircRNA 分子在癌前篩查和靶向治療中的應(yīng)用前景將更加廣闊。

3 小結(jié)與展望

隨著以高通量技術(shù)為代表的一系列RNA 研究技術(shù)的不斷發(fā)展，越來越多的CircRNA 在調(diào)控細胞增殖、分化、癌變等方面的作用得到了詳盡的闡述。與其他非編碼RNA 相比，CircRNA 自身獨有的化學結(jié)構(gòu)以及在部分亞細胞結(jié)構(gòu)中的高豐度提示其在基因表達和細胞周期調(diào)控中具有關(guān)鍵作用?，F(xiàn)階段，大多數(shù)研究仍然著眼于CircRNA 作為微小RNA 海綿的傳統(tǒng)作用機制，但我們認為CircRNA的分子生物學特性不止于此，越來越多的研究結(jié)果也證實了CircRNA 可不經(jīng)過微小RNA 介導，直接與特定的蛋白質(zhì)、核酸分子相互作用，進而調(diào)控腫瘤細胞的敏感性和DNA 損傷修復。

在諸如EGFR/PI3K、Wnt 等傳統(tǒng)信號轉(zhuǎn)導通路中，CircRNA 分子大多與腫瘤耐受性相關(guān)，鑒于分子自身穩(wěn)定的化學性質(zhì)和低豐度特性，很難通過傳統(tǒng)的敲除方法達到對腫瘤細胞放化療增敏的作用。但以circSMARCA5 為代表的CircRNA 可通過直接與基因相互作用來調(diào)節(jié)DNA 損傷修復，這可能預(yù)示著CircRNA 分子在DNA 損傷修復相關(guān)領(lǐng)域存在有別于傳統(tǒng)信號通路的作用機制。雖然目前有關(guān)CircRNA 在相關(guān)領(lǐng)域的作用還沒有成熟的研究可供臨床借鑒，但在涉及癌癥放化療敏感性的相關(guān)問題上，CircRNA 仍有可能作為預(yù)測治療耐受乃至逆轉(zhuǎn)耐藥性的理想分子靶點。相信隨著研究的不斷深入，相關(guān)CircRNA 在DNA 重組修復中新的作用機制能得到詳盡闡述，并為臨床腫瘤治療和電離輻射的防護提供完備指導。

利益沖突 本研究由署名作者按以下貢獻聲明獨立開展，不涉及任何利益沖突。

作者貢獻聲明 李俊實負責文獻的收集與整理、綜述的撰寫；楊彥勇負責綜述的選題與寫作指導；李百龍負責綜述的審閱與修訂。