枇杷果實(shí)EjNADP-ME2基因及啟動(dòng)子克隆與表達(dá)分析

楊俊 鄭雪蓮 高歡歡 寇燕 陳旭 郭傲 鄭國華

摘? 要? 以‘解放鐘和‘白梨果實(shí)為材料，研究基于轉(zhuǎn)錄組篩選出的表達(dá)量較高且在2個(gè)品種中有差異的EjNADP-ME2（Unigene0001461）基因，采用RACE和RT-PCR技術(shù)成功克隆EjNADP-ME2的cDNA全長。系統(tǒng)進(jìn)化樹分析表明，EjNADP-ME2與蘋果的NADP-ME基因關(guān)系最近。生物信息學(xué)預(yù)測結(jié)果顯示，EjNADP-ME2蛋白應(yīng)該位于細(xì)胞質(zhì)中。用染色體步移法成功克隆了EjNADP-ME2的啟動(dòng)子序列，序列預(yù)測該基因啟動(dòng)子區(qū)域含有水楊酸、茉莉酸、脫落酸響應(yīng)的順式作用元件，此外還有厭氧誘導(dǎo)元件、MYB和MYC參與黃化和干旱誘導(dǎo)的結(jié)合位點(diǎn)MBS。熒光定量PCR分析表明，EjNADP-ME2基因的表達(dá)量變化趨勢在2個(gè)品種中大致相同，均呈現(xiàn)出先降低后升高又降低的趨勢，且該基因在低酸品種的表達(dá)量稍低于高酸品種。相關(guān)性分析結(jié)果顯示，低酸品種EjNADP-ME2基因轉(zhuǎn)錄水平與蘋果酸含量呈顯著負(fù)相關(guān)。本研究的結(jié)果為進(jìn)一步探究EjNADP-ME2基因在蘋果酸代謝途徑中的功能奠定堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞? 枇杷;果實(shí);細(xì)胞質(zhì)型蘋果酸酶;基因表達(dá)分析;啟動(dòng)子

中圖分類號? S667.3? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)識碼? A

枇杷（Eriobotrya japonica）是薔薇科亞熱帶常綠果樹，被廣泛種植在中國、日本、意大利、巴西、西班牙等國家[1]。枇杷果實(shí)偏酸是影響其果實(shí)品質(zhì)和商業(yè)價(jià)值的主要因素。有機(jī)酸含量和種類是決定果實(shí)風(fēng)味的主要因素之一，通常在果實(shí)發(fā)育的早期階段積累，并在果實(shí)成熟期間用作呼吸基質(zhì)[2]。大多數(shù)水果中的有機(jī)酸是蘋果酸和檸檬酸，枇杷果實(shí)屬于蘋果酸型，其中蘋果酸含量占有機(jī)酸含量的80%以上[3]。成熟果實(shí)中最終有機(jī)酸的含量由有機(jī)酸生物合成，降解和液泡儲(chǔ)存之間的平衡共同決定[4]。蘋果酸代謝主要受6種關(guān)鍵酶基因調(diào)控，其中磷酸烯醇丙酮酸羧化酶（PEPC）和NAD型蘋果酸脫氫酶（NAD-MDH）控制蘋果酸的合成;NADP-ME和磷酸烯醇丙酮酸激酶（PEPCK）負(fù)責(zé)蘋果酸的降解;蘋果酸依賴液泡膜H+-ATPase（VHA）和H+-VPP（V-PPase）質(zhì)子泵積累轉(zhuǎn)運(yùn)ATP所需要的能量[5]。

蘋果酸酶（MEs）是調(diào)控蘋果酸代謝的關(guān)鍵酶之一，催化L-蘋果酸的氧化脫羧，在二價(jià)陽離子作用下產(chǎn)生丙酮酸，CO2和NADPH。根據(jù)輔酶的特性，可將蘋果酸酶分為NAD-ME和NADP- ME，均廣泛存在于自然界中[6]。在高等植物中，NAD-ME主要在線粒體中產(chǎn)生丙酮酸，NADP-ME主要存在于細(xì)胞質(zhì)和質(zhì)體中，其中cyNADP-ME是參與蘋果酸降解的關(guān)鍵酶[7]。目前，對植物中NADP-ME酶的研究主要有煙草、擬南芥、白楊、蘋果、桃、草莓、菠蘿等[8-12]。對該酶功能的研究主要在抗性、防衛(wèi)、果實(shí)成熟等方面[13]。在水稻中，Liu等[14]研究表明NADP-ME調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)外的滲透壓，能夠提高抗鹽害的能力。李明等[15]成功地從蘋果果實(shí)中克隆了細(xì)胞質(zhì)型NADP-ME，并且驗(yàn)證了Mal-ME在果實(shí)發(fā)育過程中對蘋果酸的積累起負(fù)調(diào)控作用。

本研究以高酸的‘解放鐘和低酸的‘白梨為實(shí)驗(yàn)材料。從轉(zhuǎn)錄組中得到EjNADP-ME2基因的保守區(qū)，采用RACE技術(shù)成功分離EjNADP- ME2基因cDNA全長并進(jìn)行生物信息學(xué)分析，同時(shí)分析EjNADP-ME2在果實(shí)中不同發(fā)育階段的表達(dá)水平和蘋果酸含量之間的聯(lián)系。采用染色體步移的方法獲得EjNADP-ME2基因的啟動(dòng)子序列，對所得序列的順式作用元件進(jìn)行分析，為深入研究EjNADP-ME2基因的功能與蘋果酸代謝之間的機(jī)理提供理論基礎(chǔ)。

1? 材料與方法

1.1? 材料

供試材料枇杷果實(shí)采自福建省莆田市常太鎮(zhèn)果園10年生枇杷樹。選取無病蟲害且盛花期一致的‘解放鐘和‘白梨2個(gè)品種各3株，于花期后50、65、80、95、110和125 d各采一次果。每株樹上采6個(gè)果實(shí)，采后迅速去皮去核，用錫箔紙包好于液氮中速凍，保存于80 ℃冰箱中以備后續(xù)提取RNA。本實(shí)驗(yàn)設(shè)置3次生物學(xué)重復(fù)，每次重復(fù)隨機(jī)選取2 g樣品進(jìn)行蘋果酸含量的測定。

1.2? 方法

1.2.1? 枇杷果實(shí)中蘋果酸提取及測定? 取2 g樣品于10 mL的離心管中，加入一定量的甲醇，75 ℃超聲提取30 min后，12000 r/min離心10 min后取上清轉(zhuǎn)入25 mL容量瓶中，重復(fù)3次，定容至25 mL，旋轉(zhuǎn)蒸干后，取5 mL雙蒸水溶解，取1 mL提取液過有機(jī)濾膜，濾液用于HPLC的檢測，蘋果酸含量的測定參考陳發(fā)興等[16]的HPLC方法，每個(gè)樣品設(shè)置3次生物學(xué)重復(fù)。

1.2.2? 枇杷果實(shí)RNA、DNA的提取和cDNA合成? 采用天根試劑盒對枇杷果實(shí)中RNA和DNA進(jìn)行提取，采用1%的瓊脂糖凝膠電泳和 Thermo Scientific Nano Drop 2000c檢測RNA和DNA質(zhì)量和濃度（圖1A）。以枇杷果實(shí)的總RNA為模板，利用TaKaRa公司的PrimeScript? RT reagent Kit With gDNA Eraser試劑盒合成cDNA，用于后續(xù)的RT-PCR和q-PCR。

1.2.3? EjNADP-ME2基因cDNA全長克隆及其啟動(dòng)子克隆? 分析枇杷花后110 d果肉RNA-seq數(shù)據(jù)庫（未公布）篩選得到EjNADP-ME2保守區(qū)片段，發(fā)現(xiàn)缺少5端序列，參照TaKaRa公司的SMART 5RACE對該基因進(jìn)行5端擴(kuò)增。設(shè)計(jì)5端RACE引物（表1），以反轉(zhuǎn)錄cDNA為模板，克隆EjNADP-ME2基因5端序列，用克隆得到的序列與保守區(qū)片段的序列拼接后的全長設(shè)計(jì)ORF引物驗(yàn)證，引物由鉑尚生物技術(shù)有限公司合成。以枇杷果實(shí)取逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物1 ?L為模板對EjNADP-ME2基因進(jìn)行5RACE第1輪擴(kuò)增，建立25 ?L如下PCR反應(yīng)體系：10×Ex-Taq Buffer 2.5 ?L;dNTP Mixture（10 mmol/L）0.5 ?L;上、下游引物（10 mmol/L）各0.5 ?L;cDNA模板1 ?L;Ex-Taq（5 U/?L）0.3 ?L，加ddH2O至 25 ?L。按照如下擴(kuò)增程序進(jìn)行：94 ℃預(yù)變性8 min;循環(huán)35次（94 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸120 s，72 ℃ 8 min）后。以第1輪PCR產(chǎn)物稀釋100倍作為第2輪擴(kuò)增的模板，反應(yīng)體系和條件和第1輪相同，PCR 產(chǎn)物經(jīng)膠回收純化后連接到pUCm-T載體上，轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞，用通用引物M13進(jìn)行菌液PCR檢測，篩選正確的陽性克隆子送深圳華大基因股份有限公司測序。

在EjNADP-ME2的編碼區(qū)序列起始密碼子ATG上游設(shè)計(jì)3個(gè)向外的PCR引物SP1、SP2和SP3（表1），以基因組DNA為模板，參照TaKaRa公司的染色體步移試劑盒進(jìn)行3次染色體步移，回收PCR產(chǎn)物并連接到pUCm-T載體上，構(gòu)建重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到DH5α感受態(tài)細(xì)胞，篩選陽性克隆，送往華大基因公司測序。

1.2.4? EjNADP-ME2基因的實(shí)時(shí)熒光定量（qPCR）表達(dá)分析? 采用Beacon Designer 7軟件分別設(shè)計(jì)內(nèi)參基因Actin和目的基因熒光定量的引物（表1）。實(shí)時(shí)熒光定量PCR體系和程序均參照TaKaRa 公司的SYBR? Premix Ex TapTM Ⅱ試劑盒說明書進(jìn)行操作。使用耶拿qTOWER2.2熒光定量儀完成定量分析。反應(yīng)程序：95 ℃ 30 s;95 ℃ 5 s，60 ℃ 20 s，45個(gè)循環(huán)。每個(gè)樣品設(shè)3個(gè)生物重復(fù)和3個(gè)技術(shù)重復(fù)，利用 2–ΔΔCT對定量數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。

1.2.5? EjNADP-ME2基因的生物信息學(xué)分析? ?使用DNAMAN進(jìn)行比對和拼接目的基因序列。利用ExPASy工具中ProtParam（https：//web. expasy.org/protparam/）程序?qū)Π被嵝蛄械慕M成分子、分子量、等電點(diǎn)及編碼蛋白的親水性進(jìn)行分析;NetPhos 3.1 Server分析磷酸化位點(diǎn);TMHMM Sever 2.0（http：//www.cbs.dtu.dk/services/TMH M M/）預(yù)測蛋白的跨膜區(qū);使用在線軟件SoftBerry ProtComp 9.0（http：//linux1.softberry.com/b err y.p html）進(jìn)行亞細(xì)胞定位預(yù)測;SignalP 4.1 （http：//ww w.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）預(yù)測信號肽;SOPMA（http：//npsa-pbil.ibcp.fr/cgi-bin/n p s a_automat.pl？page=/NPSA/npsa_sec cons. html）預(yù)測蛋白的二級結(jié)構(gòu);Phyre 2（http：//www. sbg. bio. ic. ac. uk/phyre2/html）在線預(yù)測蛋白三級結(jié)構(gòu);啟動(dòng)子的順作用元件分析在PlantCar（http：//bioinformatic.psp.ugent. be/webtools/plan tc are/heml）Place（https：//sogo.dna.affrc.go.jp/cg ibin/sogo.cgi？sid=&pj=640&action=newPlaceSite&site=S000362）網(wǎng)頁中共同分析完成。

1.2.6? 數(shù)據(jù)分析及相關(guān)性評估? 采用SPSS19.0軟件和Microsoft Excel 2016軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。利用Pearson相關(guān)系數(shù)評價(jià)EjNADP-ME2基因表達(dá)量與枇杷果肉蘋果酸含量之間的關(guān)系。

2? 結(jié)果與分析

2.1? 枇杷果實(shí)中蘋果酸含量的變化

利用HPLC對‘解放鐘和‘白梨的蘋果酸含量進(jìn)行測定，結(jié)果顯示均呈現(xiàn)出先升高后降低的趨勢（圖1）。此外，兩者在果實(shí)發(fā)育前期的蘋果酸含量不存在顯著差異，花后95 d時(shí)兩者的蘋果酸達(dá)到最大值，果實(shí)發(fā)育后期（花后95 d以后）低酸品種蘋果酸的降解幅度顯著高于高酸的幅度，是導(dǎo)致2個(gè)品種之間酸度差異的主要原因。

2.2? EjNADP-ME2基因cDNA全長序列克隆及分析

基于‘解放鐘和‘白梨果肉發(fā)育過程中轉(zhuǎn)錄組測序，分析得Unigene0001461（NADP- ME2）在2個(gè)品種果肉發(fā)育后期具有顯著差異，利用Blast數(shù)據(jù)庫對該基因與同源基因進(jìn)行比對，結(jié)果顯示該基因缺少5端序列。在此片段的基礎(chǔ)上設(shè)計(jì)2輪巢式PCR的引物（表1），對EjNADP-ME2基因進(jìn)行5端擴(kuò)增得289 bp的片段（圖2C），最后利用特異性引物擴(kuò)增該基因的（ORF）全長，經(jīng)過測序拼接之后獲得該基因的ORF為1863 bp（圖2B）。所得的序列與蘋果、白梨的序列具有95%以上的同源性，因此將該基因命名為EjNADP-ME2。

2.3? EjNADP-ME2編碼蛋白質(zhì)生物信息學(xué)分析

2.3.1? EjNADP-ME2編碼蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)? 利用ProtParam程序分析EjNADP-ME2編碼蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)，結(jié)果表明，該基因編碼621個(gè)氨基酸（圖3）。理論上的蛋白分子量67895.23 u，理論等電點(diǎn)（pI）為6.56，分子式為：C3061H4851N811O892 S19。半衰變期為30 h，不穩(wěn)定系數(shù)為30.72（<40），平均親水性0.094，屬于穩(wěn)定的非親水蛋白。NetPhos 3.1 Server分析推測該蛋白質(zhì)多肽鏈上總共含有78個(gè)磷酸化位點(diǎn)。TMHMM Sever 2.0結(jié)果表明不存在跨膜區(qū)。SignalP 4.1預(yù)測顯示不存在信號肽序列，表明其是非分泌蛋白。SoftBerry ProtComp 9.0在線預(yù)測EjNADP-ME2蛋白位于細(xì)胞質(zhì)，其預(yù)測值為6.2。

2.3.2? EjNADP-ME2編碼蛋白質(zhì)的二級和三級結(jié)構(gòu)分析? 使用在線數(shù)據(jù)庫SOPMA對NADP-ME蛋白進(jìn)行二級結(jié)構(gòu)預(yù)測，結(jié)果顯示，該蛋白質(zhì)由39.29%的α-螺旋、16.26%的延伸鏈和44.44%隨機(jī)卷曲三部分結(jié)構(gòu)組成，由此可知該蛋白質(zhì)主要是由隨機(jī)卷曲結(jié)構(gòu)組成。SWISS-MODEL對EjNADP-ME2蛋白的三級結(jié)構(gòu)進(jìn)行模擬，GEOM分值為0.74，表明該模型的可信度很高。

2.4? EjNADP-ME2保守結(jié)構(gòu)域及系統(tǒng)進(jìn)化分析

對蘋果（Malus domestica）、梨（Pyrus? bretschneideri）、李（Prunus avium）、桃（Prunus persica）、草莓（Fragaria vesca subsp. Vesca）、月季（Rosa chinensis）、葡萄（Vitis vinifera）、番茄（Solanum lycopersicum）、煙草（Nicotiana attenuata）、擬南芥（Arabidopsis thaliana）及枇杷（Eriobotrya japonica）中NADP-ME蛋白氨基酸的保守序列進(jìn)行分析（圖4）。結(jié)果表明：均存在10個(gè)Motifs，且前9個(gè) Motifs均有50個(gè)保守序列（表2）。

在單子葉植物和雙子葉植物中，選取19個(gè)物種，通過從NCBI中下載氨基酸的同源序列，利用MEGA7.0構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，結(jié)果見圖5，

2.5? EjNADP-ME2基因啟動(dòng)子的克隆及序列分析

以‘解放鐘枇杷基因組DNA為模板，利用染色體步移的方法獲得EjNADP-ME2啟動(dòng)子序列721 bp（圖2D）。將得到的啟動(dòng)子序列提交到在線工具PlantCare和PLACE進(jìn)行預(yù)測和分析，結(jié)果顯示（圖6）：該基因的啟動(dòng)子順式作用元件除包括大多數(shù)植物啟動(dòng)子序列的一些保守元件如啟動(dòng)子和增強(qiáng)子區(qū)域CAAT-Box，厭氧誘導(dǎo)作用元件ARE，G-motif、光響應(yīng)調(diào)控元件G-Box、轉(zhuǎn)錄開始30左右的核心啟動(dòng)子元件。還有一些與激素有

圖5? EjNADP-ME2氨基酸序列的系統(tǒng)進(jìn)化樹

Fig. 5? The phylogenetic tree of EjNADP-ME2 amino acid sequence

圖6? EjNADP-ME2啟動(dòng)子序列及順式作用元件

Fig. 6? EjNADP-ME2 promoter sequence and cis-acting element

關(guān)的作用元件如脫落酸響應(yīng)元件、茉莉酸響應(yīng)元件、水楊酸響應(yīng)元件。此外，該啟動(dòng)子還存在轉(zhuǎn)錄因子MYB、MYC結(jié)合位點(diǎn)MBS。

2.6? EjNADP-ME果實(shí)發(fā)育過程中的表達(dá)分析

利用熒光定量PCR技術(shù)對‘解放鐘和‘白梨果實(shí)發(fā)育過程EjNADP-ME2的表達(dá)檢測，結(jié)果表明，‘解放鐘和‘白梨的EjNADP-ME2具有相似的表達(dá)模式，均表現(xiàn)出先降低后升高又降低的趨勢（圖7），在果實(shí)發(fā)育前期（50～80 d）EjNADP-ME2基因在‘解放鐘中總體的轉(zhuǎn)錄水平與‘白梨之間差異不顯著，該基因的表達(dá)量在花后95 d時(shí)均達(dá)到最低值，果實(shí)成熟期（花后110 d）高酸品種的表達(dá)量顯著高于低酸品種。

2.7? 枇杷果實(shí)蘋果酸含量與EjNADP-ME2基因表達(dá)的相關(guān)性

利用SPSS19.0軟件對2個(gè)枇杷品種果實(shí)發(fā)育時(shí)期的的蘋果酸含量與EjNADP-ME基因的表達(dá)量進(jìn)行相關(guān)性評價(jià)。結(jié)果表明，在低酸品種“白梨”果實(shí)發(fā)育時(shí)期內(nèi)，蘋果酸含量與EjNADP-ME基因表達(dá)量之間的Pearson值為0.779，呈顯著負(fù)相關(guān)，但在高酸品種果實(shí)發(fā)育過程中，兩者的之間為Pearson值為0.117，高酸品種中蘋果酸含量與EjNADP-ME基因表達(dá)量之間不存在顯著的相關(guān)性。

3? 討論

利用HPLC技術(shù)對高酸品種‘解放鐘和低酸品種‘白梨果實(shí)發(fā)育期的果肉進(jìn)行有機(jī)酸的測定，結(jié)果表明，在果實(shí)發(fā)育前期（即花后80 d以前），2個(gè)品種中的蘋果酸的含量不存在差異。在花后95 d時(shí)，高酸和低酸品種的蘋果酸含量達(dá)到最大值。在果實(shí)發(fā)育后期（花后95 d以后）低酸品種的降解速度和幅度明顯高于高酸品種，陳發(fā)興等[17]研究表明在花后的105 d時(shí)果實(shí)中的蘋果酸含量達(dá)到最高隨后降低，可能是因?yàn)閷?shí)驗(yàn)材料所處的地理位置不同所致，但蘋果酸含量的總體變化趨勢相一致，所以仍然可以說明高酸和低酸品種在果實(shí)發(fā)育后期蘋果酸降解速度不同可能是導(dǎo)致2個(gè)品種酸度差異的主要原因。

在高等植物中，NADP-蘋果酸酶由1個(gè)小的基因家族編碼。水稻中的NADP-ME家族由3個(gè)細(xì)胞質(zhì)NADP-ME和1個(gè)質(zhì)體型NADP-ME構(gòu)成，并且4種NADP-ME的氨基酸序列具有很高的相似性[5]。Tao等[18]分析了12種十字花科植物的NADP-ME家族成員，結(jié)果表明NADP-ME的5個(gè)基因表現(xiàn)出差異表達(dá)模式，每個(gè)基因都可能具有特定的生物功能。Wheeler等[19]從擬南芥中克隆出4種NADP-ME基因的序列，并且通過Gus染色技術(shù)結(jié)果表明NADP-ME2是調(diào)控?cái)M南芥成熟組織中NADP-ME活性的關(guān)鍵酶基因。本研究從枇杷果實(shí)轉(zhuǎn)錄組中篩選出表達(dá)量較高且在兩品種之間有顯著表達(dá)差異的EjNADP-ME（Unigene 0001461）基因。采用RACE技術(shù)克隆出EjNADP- ME2的cDNA全長，該基因cDNA的全長序列2159 bp，編碼621個(gè)氨基酸，通過亞細(xì)胞定位軟件結(jié)果顯示EjNADP-ME2位于細(xì)胞質(zhì)中。EjNADP-ME2基因與其他物種具有相似的功能結(jié)構(gòu)域，表明該基因可能調(diào)控蘋果酸的合成。從系統(tǒng)進(jìn)化樹中可以看出EjNADP-ME2基因在物種進(jìn)化上具有較高的保守性。

目前，關(guān)于EjNADP-ME2基因啟動(dòng)子的研究未見報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)利用染色體步移的技術(shù)成功克隆到EjNADP-ME2起始密碼子上游721 bp啟動(dòng)子片段。對啟動(dòng)子序列進(jìn)行生物信息學(xué)分析，結(jié)果顯示，其含有大多數(shù)基因啟動(dòng)子的保守元件。此外，還有一些MYC和MYB的結(jié)合位點(diǎn)，說明EjNADP-ME2有可能受該轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控，這為進(jìn)一步探究EjNADP-ME2基因如何調(diào)控蘋果酸的降解提供了依據(jù)。

已有人研究EjNADP-ME2基因表達(dá)與水果果實(shí)中蘋果酸積累之間的關(guān)系，Yao等[20]研究表明在蘋果成熟期間EjNADP-ME的轉(zhuǎn)錄對蘋果酸的積累起負(fù)調(diào)控的作用。Etienne等[21]成功克隆出桃中6個(gè)關(guān)鍵酶基因并且對各個(gè)基因的表達(dá)量進(jìn)行了分析，結(jié)果表明各個(gè)基因的表達(dá)量與蘋果酸的積累沒有必然聯(lián)系。Mu等[22]通過分析李的轉(zhuǎn)錄組及對蘋果酸相關(guān)基因的表達(dá)量進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)雖然NADP-ME基因是蘋果酸代謝過程的關(guān)鍵基因，但對李果實(shí)發(fā)育過程中的有機(jī)酸積累并沒有起到?jīng)Q定性的作用。本實(shí)驗(yàn)利用RT-qPCR對2個(gè)品種的EjNADP-ME2基因的表達(dá)量進(jìn)行了測定。結(jié)果表明，高酸和低酸品種的EjNADP-ME2表達(dá)量的變化趨勢大致相同，在果實(shí)發(fā)育前期，該基因的表達(dá)量均逐漸減小，在花后80 d兩個(gè)品種的轉(zhuǎn)錄水平均達(dá)到最低，此時(shí)蘋果酸的含量達(dá)到最大值?；ê?0 d，果實(shí)的蘋果酸含量隨EjNADP-ME2基因表達(dá)量升高而降低。利用SPSS軟件分析對EjNADP-ME2基因表達(dá)與果實(shí)蘋果酸積累的相關(guān)性進(jìn)行分析，結(jié)果顯示‘白梨中該基因轉(zhuǎn)錄水平與蘋果酸含量呈顯著負(fù)相關(guān)，說明EjNADP- ME2基因可能是導(dǎo)致低酸的關(guān)鍵因素，這與李明等[15]的研究結(jié)果一致。在果實(shí)發(fā)育前期‘解放鐘EjNADP-ME2基因的表達(dá)量略高于‘白梨，在實(shí)發(fā)育后期（110～125 d），該基因在兩者之間的表達(dá)水平呈現(xiàn)顯著差異。由此說明兩品種之間的酸度差異不是主要由該基因引起的，可能還受其他蘋果酸代謝相關(guān)基因的調(diào)控。這與Yang等[23]的結(jié)果相似。

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